D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada's Discovery Grant program.

Nota: Fases 1 e 2 têm lugar antes do dia de imagem; assegurar todos os meios e suplementos para ser utilizado antes ou no dia da imagiologia são equilibradas. A equilibração é conseguida através do aquecimento de meios e suplementos para 37 ° C numa incubadora a 5% de CO 2. Todas as etapas do trabalho de cultura celular e lamela chapeamento ter lugar em condições estéreis sob uma capela de fluxo laminar. 1. A transfecção celular <ol><li> Transfectar as células T a ser trabalhada 24 horas antes da experiência, com um plasmídeo que codifica uma fusão de rotulagem fluorescente construir GFP F-actina e imagiologia. Nota: As células devem ser dividida 24 h antes da transfecção (48 h antes da imagem) para garantir as células estão em óptima saúde e na sua fase de crescimento logarítmica. <ol><li> Colocar 5 ml de suplemento de meio RPMI (meio RPMI 1640 mais 10% de FBS e 1% de Pen-Strep (opcional)) em um único poço de uma placa de 6 poços na incubadora para equilibrar. </li><li> Agregar 2 x 10 7 células T cultorado a 37 ° C, 5% de CO 2 em meio RPMI suplemento utilizando um tubo de centrifugação a 327 xg durante 5 minutos e lava-se em um volume igual de meio de electroporação pré-aquecido. Nota: médio Eletroporação é um meio de soro reduzido contendo buffers e suplementos (ver consumíveis). </li><li> Depois de re-granulação a 327 xg durante 5 min, ressuspender as células em 500 ul de meios de electroporação e lentamente adicionar a uma cuvete, adicionam-se 5 ug do plasmídeo em PCR grau de dH2O para rotulagem de F-actina. </li><li> Bata suavemente a tina no espaço de trabalho capa para assegurar a remoção de quaisquer bolhas de ar nos meios de comunicação, que podem provocar faíscas da eletricidade e para distribuir uniformemente as células dentro dos meios de comunicação. </li><li> Ligue o aparelho de eletroporação e ajuste a tensão para 300 V e capacidade para 290 Ω. Electroporate amostra utilizando um decaimento exponencial de 20 mseg. Nota: Optimização podem ser necessários para diferentes células e diferentes construções de plasmídeos. </li><li> Uma vez que o protocolo de transfecção é, células de lojas completas sobre gelo durante 1 min antes de continuar. </li><li> Transferir cuidadosamente as células da cuvete para a placa de 6 poços contendo 5 mL de meio RPMI suplemento equilibrada a partir do passo 1.1.1. </li><li> Incubar as células O / N a 37 ° C + 5% de CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Lamelas casaco e Pré-quente Suplemento de imagem <ol><li> Lamelas revestimento com anticorpos para induzir a estimulação de células T. <ol><li> Bata de cada uma das câmaras de uma lamela 8 poços com 1 ug / ml oCD3 e αCD28 em 200 ul de PBS. </li><li> Armazenar a 4 ° CO / N. Alternativamente, lamelas de revestimento de 2 horas antes da imagem e manter-se em uma incubadora a 37 ° C para reduzir a dispersão durante o processo de imagem ao minimizar as mudanças de temperatura para a lamela. </li></ol></li><li> Criar uma amostra de teste lamela com 0,1 um sub-difração de microesferas fluorescentes. <ol><li> Solução estoque Vortex de esferas para evitar grumos. </li><li> Em uma nova lamela, limpo de the mesmo tipo que os utilizados no passo 2.1.1, pipeta de 5 ul da solução de microesferas fluorescentes sobre a superfície (conforme as instruções do fabricante). </li><li> Espalhe solução microesfera sobre a lamela com ponteira. </li><li> Deixe secar, em seguida, aplicar 200 ï¿½ de meio de montagem, como a PBS. Nota: o meio de montagem deve corresponder ao utilizado para amostras de células de imagem. </li></ol></li><li> Equilibrar HBSS (+ 20 mM de HEPES, a seguir designado por &quot;HBSS suplemento &#39;) num tubo de centrifugação por colocação dentro de uma incubadora para pré-aquecer O / N a 37 ° C + 5% de CO 2. Nota: a adição de HEPES é para tamponar CO 2, se estiver usando uma câmara de incubação com CO 2 de entrada pular esta suplementação. </li></ol> 3. Microscópio Set-up <ol><li> Ligue a fase de topo incubadora do microscópio e lugar suficiente água destilada TIRF-SIM no reservatório do microscópio para cobrir completamente a base do elemento de aquecimento. Permitir que a água para equilibrate a 37 ° C. Adicionar o colar de aquecimento para a lente da objectiva, também definido como 37 ° C. Nota: Devido à sensibilidade do set-up, essas etapas são feitas na noite anterior para que os componentes ópticos estão a uma temperatura estável antes da imagem. </li><li> Coloque o TIRF 488 compatível bloco ralar no caminho óptico do microscópio e prenda no lugar. <ol><li> Mude o modo de canal e do cabo de fibra para a posição &#39;Single&#39; no palco cama laser e microscópio, respectivamente, para envolver o caminho óptico correto para o modo TIRF-SIM. Nota: Ignorando este passo conduzirá a um erro (Figura 1A) na janela do software. </li></ol></li><li> Ligue todos os componentes do microscópio e computador e abra o software de controle de aquisição. <ol><li> Abra o painel de OC, Ti Pad, N-SIM Pad e ND Aquisição janelas (Figura 1B). No &#39;Painel de OC&#39; selecione a opção &#39;TIRF 488&#39; (Figura 2B, seta amarela). </li&gt; <li> Na janela de N-Pad SIM, selecione a opção &#39;TIRF-SIM&#39; e configurações &#39;em movimento &quot;(Figura 2C, setas amarelas). Selecione o botão de configurações (Figura 1C, caixa amarela) e selecione &#39;TIRF 488 (para 100x TIRF 488nm)&#39; no menu suspenso, clique em &#39;Aplicar&#39; e &#39;OK&#39;. </li><li> Defina as configurações da câmera dentro das configurações DU897 &#39;Para: Frame Rate 50 ms, modo de leitura, Gain EM 3 MHz em 14 bits, e EM Gain Multiplicador 300 com um ganho de conversão de 1 (Figura 1C, caixa verde). Nota: Os resultados representativos para ver considerações taxa de quadros. </li><li> Calibrar a iluminação do microscópio para TIRF-SIM, seleccionando a NA CFI Apochromat TIRF objetivo 100x 1,49, no &#39;N-SIM Pad&#39; virar a potência do laser de 488 nm para 10%. Nota: O tamanho do pixel das imagens cruas é de 60 nm, com um campo de 512 x 512 pixels de vista. </li><li> Limpe a lente objetiva usando lenço de papel para remover o pó e óleo. </li></ol></li&gt; <li> Encontre o plano focal TIRF-SIM. <ol><li> Comece com o objetivo no menor z-plano possível. Coloque uma gota de óleo na lente objetiva e adicione a amostra de microesferas fluorescentes a partir do passo 2.2 para o palco microscópio. </li><li> Seleccionar a função perfeito sistema de focagem (PFS) situado no corpo do microscópio. </li><li> Mover-se lentamente o objectivo acima através do plano z até que o botão de PFS pára de piscar para confirmar o plano focal foi atingido. </li><li> Mudar para a Visão &#39;Live&#39; no software de controle e imagem das microesferas para ajustes finais feitas usando a roda de micro-manipuladora PFS. </li></ol></li><li> Observe a iluminação uniforme sem emissão de fluorescência fora de foco acima da onda evanescente 75 nm. Nota: Confirme iluminação estruturada é cumprida observando um padrão de iluminação flutuante a partir da amostra de microesferas fluorescentes. </li><li> Meça fluorescente amostra microesfera e quantificar a melhoria resolut imagemion, observando toda a largura à meia altura (FWHM) do perfil de intensidade. <ol><li> Abra o software Analisar (v4.20.01), com o módulo de NIS-A N-SIM Análise instalado e selecione &quot;Aplicativos&quot; -&gt; &quot;janela mostra N-SIM &#39;. </li><li> Com o contraste de modulação iluminação (IMC) e supressão de ruído de alta resolução (HRNS) definido como 1 para conjuntos de dados TIRF-SIM (Figura 2), reconstruir a imagem da amostra microesfera para gerar uma imagem reconstruída de 1.024 x 1.024 pixels com um tamanho de pixel de 30 nm. </li><li> Usando a ferramenta de perfil de linha com uma largura de 1 de pixel (Figura 3A, caixa amarela), desenhar uma linha através do centro de uma única microesfera. </li><li> Selecione o botão FWHM (Figura 3B, caixa amarela) e clique no maxima intensidade da distribuição de Gauss, seguido por seu mínimos intensidade. </li><li> Confirmar a FWHM da microesfera está na gama de 100 nm (Figura 3C). Nota: o ach resoluçãoquando imaging amostras biológicas quistada irá variar dependendo da relação sinal-ruído de fundo e eficiência de marcação por fluorescência. </li></ol></li></ol> 4. Preparação de Amostras for Imaging <ol><li> Preparação lamela. <ol><li> Recuperar lamela αCD-revestido do passo 2.1 do refrigerador ou incubadora e remover PBS contendo oCD3 e αCD28 de cada poço. </li><li> Adicionar 200 ul de pré-aquecido suplemento HBSS a partir do passo 2.3 em cada poço da lamela. Lavar e remover para assegurar o mínimo oCD3 e αCD28 é deixado em solução. Adicionar mais 200 ul de HBSS o suplemento aos poços lamela. </li><li> Limpar o lado de baixo da lamela com o tecido da lente para retirar o óleo e partículas. </li></ol></li><li> Posição lamela na platina do microscópio e encontrar o plano focal TIRF da lamela, utilizando o plano z PFS como encontrado na etapa 3.4. </li><li> Preparação de Células. <ol><li> Pipetar 200 mL da mídia contenção células transfectadas do passo 1.1.8 para um tubo de micro-centrífuga. </li><li> Células de pellets em uma micro-centrífuga a 268 xg durante 20 segundos e remova a mídia celulares. </li><li> Ressuspender as células em 200 ul de pré-aquecido suplemento HBSS a partir do passo 2.3. </li></ol></li></ol> 5. Células de imagem <ol><li> Tome-célula suplemento contendo HBSS ao microscópio e pipeta suavemente em 200 ul de um dos poços. </li><li> Mantendo-se no plano focal TIRF na lamela (no modo de PFS), utilize a ocular microscópios e iluminação epifluorescência para rastrear células fluorescentes que se aproximam da lamela. </li><li> Uma vez que as células pousar na lamela, alternar para o modo &#39;Live&#39; no N-SIM Pad para trazer a imagem no monitor e verifique as células estão em foco na tela do computador. </li><li> Para gravar tempo-cursos, abra a janela ND Aquisição e selecione a guia &#39;Time&#39;, clique em &#39;Adicionar&#39; e configure &#39;Intervalo&#39; para Nenhum atraso, &#39;Duração&#39;a 10 min, &#39;Loops&#39; é definido como 1. Nota: A duração pode ser alterada, dependendo do processo de interesse; o software STICS pode extrair resultados quantitativos com pilhas de imagens de = 10 quadros quando capturadas com &quot;Sem atraso &#39;. </li><li> Com configurações de aquisição idênticos aos da amostra talão, iniciar a gravação de dados selecionando &#39;Executar agora&#39; na janela do ND Aquisição. </li></ol> 6. Reconstructing SIM Images <ol><li> Depois de imagem estiver concluída, abra o software Analisar (v4.20.01), com o módulo de NIS-A N-SIM Análise instalado e selecione &quot;Aplicativos&quot; -&gt; &quot;janela mostra N-SIM &#39;. </li><li> Com o contraste de modulação iluminação (IMC) e supressão de ruído de alta resolução (HRNS) definido como 1 para conjuntos de dados TIRF-SIM (Figura 2), reconstruir um (ou múltiplos usando a ferramenta Batch) arquivo SIM-prima para produzir uma imagem de SIM reconstruído. </li><li> Confirme o arquivo reconstruído tem um tamanho de pixel de 30 nm, indicado nobarra de status da imagem. Nota: o tamanho do pixel não afecta análise STICS mas deve ser de pelo menos 2x menor em dimensão do que a resolução espacial PSF, a fim de assegurar a correlação espacial entre os pixels. </li><li> Exportar os dados como .tiff arquivos, pronto para análise STICS. </li></ol> 7. Análise STICS <ol><li> Baixe e extraia o STIC (C) S pacote de software Matlab (Wiseman laboratório, disponível como informação suplementar). O stics_vectormapping.m roteiro é o núcleo de uma única análise STICS canal e os primeiros 30 linhas de código são usados ​​para definir os parâmetros de entrada, tal como definido no ponto 2.1 do manual. Abra esse script e definir os parâmetros de entrada para a análise de dados TIRF-SIM. Sugere-se também adicionar a pasta S STIC (C) com subpastas para o Matlab caminho da máquina local, conforme detalhado no apêndice do manual. <ol><li> Defina os parâmetros de entrada para a análise dos dados, editando as linhas correspondentes do código </li><li> Para executar analise dos dados TIRF-SIM para gerar um vector mapa, defina os parâmetros temporais para sub-região temporal na linha 31 para o número máximo de quadros ea mudança temporal na linha 32 para 1. Para obter uma série temporal de mapas vetoriais variar esses parâmetros . </li><li> Para o filtro de remoção de Immobile, defina o parâmetro &quot;filtragem&quot; (linha 23) para &#39;Média móvel&#39; e definir o parâmetro &#39;MoveAverage&#39; (linha 24) a 21. Nota: Esta definição foi mostrado para trabalhar em movimento mais lento e grandes sinais de fluorescência, como ele é baseado em subtraindo quadros de série do quadro que está sendo analisado. </li><li> Alterar linhas 33-38 para definir o nome dos arquivos de saída e títulos dos mapas saída do vetor, bem como o caminho do diretório de saída e definir em que formato as imagens vetoriais mapa deve ser salvo. </li></ol></li></ol><table><tbody><tr><td> Tamanho do pixel (um) </td><td> 0,03 mm </td><td> A linha 19 </td></tr><tr><td> Taxa de quadros (seg) </td><td> 1 segundo </td><td> Linha 20 </td></tr><tr><td> O tempo máximo de atraso (quadros) </td><td> 20 quadros </td><td> Linha 21 </td></tr><tr><td> Tamanho sub-região (pixels) </td><td> 8 pixels </td><td> Linha 29 </td></tr><tr><td> Espaçamento sub-região (pixels) </td><td> 1 pixel </td><td> Linha 30 </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Abra as run1ChannelSTICS script na janela Editor de Matlab. Carregue a série de imagens, executando linhas 1-23 deste script. Nota: Este script pode ser usado para carregar e pré-processo de série de imagens, traçar os mapas vetoriais e histogramas de velocidade e executar um processamento em lote para muitos arquivos. Se necessário, cortar a imagem de uma região de interesse, usando a linha 24-26 deste script. <ol><li> Linhas correm 29-35 de run1ChannelSTICS para iniciar a análise STICS. Quando solicitado, selecione um polígono para indicar uma região específica de interesse (ROI), se necessário. Certifique-se de que o ROI não se sobreponha com a borda de célula, como ocorre artefatos de limite quando STICS analisa esses reregiões. </li><li> Linhas 38-52 executados para exibir os mapas vetoriais. Para traçar o histograma velocidade magnitude, linhas 53-72 executado. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li><li>Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+interaction+between+T+and+B+cells.">Antigen-specific interaction between T and B cells.</a> Nature. 314, 537-539 (1985).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+antigen+recognition+by+naive+CD4++T+cells:+compulsory+cytoskeletal+alterations+for+the+triggering+of+an+intracellular+calcium+response.">Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response.</a> European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Receptor-Proximal+Signals+Are+Sustained+in+Peripheral+Microclusters+and+Terminated+in+the+Central+Supramolecular+Activation+Cluster.">T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature methods. 3, 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

Esta técnica permitirá aos investigadores a imagem e quantificar previamente detalhes insolúveis em células que expressam fluorescência. Nos nossos resultados que mostram que os fluxos de F-actina de um modo simétrico a partir da periferia em direcção ao centro da célula a célula na célula T IS. Estes resultados são consistentes com os resultados anteriores de dados de perfil quimógrafo linha 1D 13 e ampliar a capacidade de análise de dados 2D e super-resolução. A ...

O objectivo da experiência é a imagem e caracterizar o fluxo molecular de filamentous- (F-) actina em células T vivo, para além do limite de difracção, a fim de estabelecer a direcção do fluxo e durante a magnitude sinapse imunológica (IS) formação. Esta técnica irá ser realizada utilizando um microscópio de iluminação estruturada (SIM) no modo de reflexão interna total de fluorescência (TIRF), imagiologia de células T de Jurkat que formam uma sinapse artificial sobre a activação das lamelas revestidas com anti-CD3 e anti-CD28. Os formulários está entre uma célula T e seu alvo; uma célula que apresenta antigénios (APC) em cima do receptor de células T (TCR) 1,2 activação. Como esta é a primeira etapa para determinar se o sistema imunitário adaptativo gera uma resposta imunitária a uma infecção, as consequências da capacidade de resposta a estímulos incorrecta pode provocar um certo número de doenças. A importância da interacção de células T-APC está bem documentada, no entanto, o papel (s) do maduro é depois Si TCR inicialinternalização nal ainda estão para ser totalmente compreendido. Como o citoesqueleto é pensado para auxiliar dois processos ligados à activação de TCR (o movimento de moléculas na membrana plasmática e do controlo de moléculas de sinalização dependentes do citoesqueleto de actina 3,4), compreender como o citoesqueleto reorganiza espacial e temporalmente irá elucidar os passos de reorganização molecular durante a formação de sinapses. O fluxo retrógrado de F-actina é pensado para encurralar aglomerados de TCR em direcção ao centro da sinapse imunológica, esta translocação se acredita ser fundamental para a cessação do sinal e de reciclagem; auxiliando o bom equilíbrio de activação de células T 5. Enquanto a microscopia de fluorescência padrão é uma ferramenta flexível que continua a fornecer uma visão sobre muitos eventos biológicos, incluindo interações célula-célula, ela é limitada pela capacidade do sistema para resolver com precisão vários fluoróforos que residem mais perto do que o diffrlimite de acção (≈200 nm) de cada outro. Como muitos eventos moleculares dentro das células envolvem densas populações de moléculas e apresentam rearranjo dinâmico quer na quietude ou mediante estimulação específica, microscopia de luz convencional não fornece a imagem completa. A utilização de super-resolução de imagem permitiu a investigadores para contornar o limite de difracção utilizando uma variedade de técnicas. Microscopia molécula única localização (SMLM), tais como PALM e STORM 6,7 tem a capacidade de resolver o local de moléculas até uma precisão de cerca de 20 nm, no entanto, estas técnicas dependem de longos tempos de aquisição, a criação de uma imagem ao longo de muitos quadros . Geralmente isso requer amostras a serem fixos ou para estruturas mostrou baixa mobilidade fluorophores tão simples não são mal interpretados como vários pontos. Enquanto esgotamento emissão estimulada (STED) imagiologia permite super-resolução através da excitação confocal muito seletivo 8, a digitalização necessáriaabordagem pode ser lento sobre os campos de células inteiras de vista. STED também demonstra fototoxicidade significativo para resoluções mais elevadas devido ao aumento do poder do feixe de esgotamento. Microscopia de iluminação estruturada (SIM 9) proporciona uma alternativa a estes métodos, capazes de duplicar a resolução de um microscópio de fluorescência padrão e é mais compatível com a imagem de células vivas do que as técnicas correntes SMLM. Ele usa poderes de laser inferiores, em um sistema de campo amplo para campos de células inteiras de vista; proporcionando maior velocidade de aquisição, e é compatível com rotulagem fluoróforo padrão. A natureza de campo amplo de SIM também permite a utilização de fluorescência total interno de reflexão (TIRF) para excitação altamente seletivo, com profundidades de penetração na dimensão axial de &lt;100 nm. Espectroscopia de correlação de imagem (ICS) é um método de correlacionar as flutuações na intensidade de fluorescência. Uma evolução do ICS; Im espaço-temporalespectroscopia de correlação de idade (STICS 10) correlaciona sinais fluorescentes intracelulares no tempo e no espaço. Ao correlacionar intensidades de pixel com áreas pixels em quadros mais atrasadas através de uma função de correlação, a informação é adquirida com as velocidades de fluxo e direcionalidade. Para garantir objectos estáticos não interfiram com a análise STICS, um filtro objecto imóvel é implementado, o qual funciona através da subtracção de uma média móvel da intensidade dos pixels. A técnica aqui apresentada acredita-se ser a primeira demonstração de espectroscopia de correlação de imagem a ser aplicada aos dados de microscopia de super-resolução para quantificar o fluxo molecular em células vivas 11. Este método melhora na imagem limitado por difração de fluxo de F-actina via análise STICS 12 e serviria para pesquisadores que desejam determinar o fluxo molecular bidimensional em células vivas, a partir de dados adquiridos em resoluções espaciais para além do limite de difração da luz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="799">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Consumables:</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat E6.1 cells</td>
			<td>APCC</td>
			<td>ATTC TIB-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21875-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Strepromycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>&#160;Life Technologies</td>
			<td>14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">#1.5 8-well Labtek coverslips</td>
			<td>NUNC, Labtek</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LifeAct GFP construct</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>60101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OptiMem</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>51985-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD3</td>
			<td>Cambridge Bioscience</td>
			<td>317315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD28</td>
			<td>BD Bioscience / Insight Biotechnology</td>
			<td>555725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lens oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gene Pulsar Xcell System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-2660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cuvette (0.4cm)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5805 000.327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge (Heraeus)</td>
			<td>Biofuge pico</td>
			<td>75003235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stage-top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INUH-TIZSH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon N-SIM microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon Analyse software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator (190D)</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cortical actin flow in t cells quantified by spatio-temporal image correlation spectroscopy of structured illumination microscopy data

-Actina filamentosa desempenha um papel crucial na maioria dos processos celulares, incluindo a motilidade e, em células do sistema imunológico, a formação de uma interacção célula-célula chave conhecida como a sinapse imunológica. F-actina também é especulado para desempenhar um papel na regulação da distribuição molecular na membrana de células, incluindo vesículas dinâmica sub-membranoso e agrupamento da proteína. Embora as técnicas de microscopia de luz padrão permitem observações generalizadas e limitou-difração de ser feita, muitos eventos celulares e moleculares, incluindo clustering e fluxo molecular ocorrem em populações de comprimento escalas muito abaixo do poder de resolução da microscopia de luz padrão. Através da combinação total de fluorescência de reflexão interna com o método de iluminação estruturada microscopia de super-resolução de imagem, o fluxo molecular bidimensional da actina F na sinapse imune das células T foi gravado. Espectroscopia de correlação de imagem espaço-temporal (STICS) foi então aplicada, o que gera resul quantificávelts na forma de histogramas de velocidade e mapas vetoriais que representam a direcionalidade e fluxo magnitude. Este protocolo descreve a combinação de técnicas de imagem e os paus de super-resolução para gerar vetores de fluxo em níveis sub-difração de detalhe. Esta técnica foi utilizada para confirmar uma fluxo de actina que é simetricamente retrógrada e centrípeta ao longo da periferia de células T mediante a formação de sinapses.

Configurações de microscópio Depois de atingir com sucesso todas as etapas o pesquisador terá iluminação estruturada realizada (SIM) imageamento de fluxo de F-actina em uma sinapse das células T (vídeo 1) e quantificou esse fluxo molecular por espectroscopia de correlação de imagem espaço-temporal (Figura 4 11). Antes de gravar imagens, assegurar a iluminação da amostra é uniforme para...

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Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Cortical actina Fluxo nas células T quantificada pela correlação espacial e temporal Imagem Espectroscopia de iluminação estruturada Microscopia Dados

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

cortical-actin-flow-t-cells-quantified-spatio-temporal-image

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.6K visualizações.  King's College London. To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy. 

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Imunologia e Infecção

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

As células T Capturar Bactérias por Transinfection das dendríticas

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

A citometria de fluxo para avaliar o estado de cromatina em células T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis allow the spatial localization and visualization of gangliosides involved in CD4+ T cell activation, that complement expression profiling experiments such as flow cytometry, western blotting or real-time PCR. The quantification of ganglioside expression through flow cytometry and their cellular localization through microscopy can be obtained by the use of anti-ganglioside antibodies with high affinity and specificity. Nonetheless, an adequate handling of cells in suspension involves the treatment of culture plates to promote the necessary adherence required for fluorescence or confocal microscopy acquisition. In this work, we describe a protocol for determining GD3 and GD2 ganglioside expression and colocalization with the TCR during na&#239;ve CD4+ T cell activation. Also, real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells are described for the determination of the GD3 and GM2/GD2 synthase genes, demonstrating that gene analysis experiments can be performed with a low number of cells and without the need of additional low input RNA kits.

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

We describe a standard antibody staining protocol for use in microscopy to determine the membrane expression and localization of gangliosides in resting and activated human na&#239;ve CD4+ T cells. Also described are real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells that do not require additional low input RNA kits.

Preparação de CD4<sup&gt; +</sup&gt; As células T para Análise de GD3 e GD2 gangliï¿½idos Membrane Expressão por microscopia

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Difusão molecular em membranas plasmáticas de linfócitos primários medida por fluorescência Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Isolamento e Citometria de Fluxo Analysis of Human Endocervical Gama Cells Delta T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

Indução de paralisia e lesão do sistema Visual em camundongos por específicos de células T para Neuromielite Óptica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...