We thank K. Delaney for comments on the manuscript. This work was supported by the National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Intramural Program.

1. Tessuto Raccolta e dissezione <ol><li> In ogni flacone contenente lievito secco, cultura 10 femmina adulta vola con 10 maschi per 2-3 giorni. Nota: Mantenere le mosche di sesso femminile ben nutriti migliorerà la qualità complessiva e la resa della produzione ovarica e facilitare la dissezione. </li><li> Anestetizzare la femmina vola su un anidride carbonica (CO 2) vola pad. </li><li> Sotto lo stereoscopio, mettere alcune gocce di media RT (media Drosophila Schneider integrato con siero fetale bovino al 10% (FBS)) su un rilievo da dissezione. Condurre tutte le procedure di dissezione nel mezzo per mantenere in vita e in buona salute i tessuti. </li><li> Afferra una femmina ingrassato mosca con una pinza sottile dal naso taglienti al suo torace inferiore. Utilizzare un altro set di pinze per tirare delicatamente all&#39;estremo posteriore del volo fino a quando i tessuti nell&#39;addome sono esposti. Staccare le due ovaie da altri tessuti (ad esempio budella). Nota: ogni display ovaio una struttura opaca che è componed di 16-20 ovarioli allegati. </li><li> Per migliorare la penetrazione dei reagenti, aprire le ovaie tirando loro parte e passando le punte della pinza tra ogni ovariole un paio di volte. Mantenere le ovarioli collegati all&#39;interno di un ovaio per minimizzare la perdita dei tessuti durante le seguenti procedure. </li><li> Trasferire le ovaie subito in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 500 ml di mezzo di Drosophila di Schneider con il 10% FBS. </li><li> Ripetere la dissezione e raccogliere 10-15 ovaie in ogni provetta. </li></ol> 2. EdU Labeling <ol><li> Aspirare il mezzo in ogni tubo, e sostituirlo con 500 ml di mezzo di Drosophila di Schneider con il 10% FBS contenente 7 micron afidicolina. Nota: afidicolina viene utilizzato per bloccare la sintesi del DNA nucleare, inibendo DNA polimerasi α senza influenzare la replicazione del mtDNA 7, 12. È possibile aumentare la concentrazione afidicolina finoa 70 mM per ottenere una migliore inibizione. La soluzione madre di 3-30 mM afidicolina in DMSO può essere conservato al buio a -20 ° C per un massimo di 6 settimane. </li><li> Per mantenere le ovaie sani, in modo che essi sono immersi in soluzioni durante il cambio del mezzo. Utilizzare medio Drosophila Schneider con il 10% FBS fino al passo 2.6. </li><li> Incubare ovaie per 3 ore a temperatura ambiente su una sedia a dondolo da banco con rotazione delicata. <ol><li> Per il trattamento della droga, per esempio, mitocondriale sganciamento carbonile cianuro fenilidrazone 4 trifluoromethoxy (FCCP), aggiungere la concentrazione adeguata di farmaci (ad esempio, 10 micron FCCP) nel mezzo, dopo 2 ore di trattamento afidicolina. Continuare l&#39;incubazione per un altro 1 ora. </li></ol></li><li> Rimuovere il contenente afidicolina mezzo con o senza farmaci. Brevemente risciacquare le ovaie con media (afidicolina non è necessario) due volte. </li><li> Aggiungere 1 ml di mezzo contenente 10 mM EdU e 7 micron afidicolina e continuare incubating a temperatura ambiente per 2 ore. Conservare la soluzione 10 mM EdU disponibile (DMSO) a -20 ° C. </li><li> Rimuovere il terreno contenente EdU e afidicolina. Lavare con medio (senza afidicolina) due volte per 3 minuti ciascuno. </li></ol> 3. Fissazione dei tessuti e permeabilizzazione <ol><li> Preparare una soluzione di paraformaldeide al 4% in tampone fosfato (PBS, pH 7,4). Nota: Abbiamo usato paraformaldeide disponibile commerciale memorizzati in fiale pre-segnato. Aprire una nuova ampolla e diluire al 4% prima dell&#39;uso. ATTENZIONE: La formaldeide è tossica; esso dovrebbe essere gestito in una cappa aspirante con la pelle e protezione per gli occhi. </li><li> Fissare ovaie con 4% paraformaldeide per 20 minuti a RT con rotazione dolce. </li><li> Rimuovere il fissativo e lavare ovaie due volte in 1 ml di 3% BSA in PBS per 5 minuti ogni volta. </li><li> Per permeabilize i tessuti, rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere 1 ml di 0,5% Triton X-100 in PBS. Incubare a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Rimuovere la soluzione permeabilizzazione e lavare due volte in 1 mldel 3% BSA in PBS. </li></ol> 4. Individuazione EdU Nota: EdU rilevamento si basa sulla chimica &quot;click&quot;, un Cu (I) -catalyzed [3 + 2] cicloaddizione 13, che aggiunge azidi fluorescenti al gruppo alchino terminale EdU, e la molecola fluorescente viene sottoposto a successiva rivelazione. Poiché Cu (I), che è facilmente ossidato a specie non catalitici Cu (II), è necessario per catalizzare la reazione, si raccomanda di ridurre la (II) solfato Cu in situ per ottenere Cu (I). Cioè, Cu (II) solfato viene utilizzato in presenza di un riducente come l&#39;acido ascorbico (qui il &quot;buffer additivo&quot;) per generare il rame (I). <ol><li> Prima dell&#39;esperimento, preparare la soluzione di lavoro del azide Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 azide, Alexa Fluor 555 azide o altri, a seconda del fluoroforo preferita, che prendono il nome di &quot;dye azide&quot; di seguito), tampone di reazione EdU e tampone EdU additivo secondo il fornitore diistruzioni. <ol><li> Ricostituire il colorante azide in 70 ml di DMSO. Conservare la soluzione di lavoro a -20 ° C fino a 1 anno. </li><li> Preparare tampone fresco reazione EdU diluendo il tampone di reazione 10x EdU con acqua deionizzata. Nota: Dopo l&#39;uso, conservare qualsiasi soluzione 1x rimanendo a 4 ° C. La soluzione 1x è stabile per un massimo di 6 mesi. </li><li> Fare una soluzione 10x magazzino del buffer additivo EdU sciogliendo completamente la polvere in 2 ml di acqua deionizzata. Nota: Questa soluzione madre è stabile fino a 1 anno a -20 ° C. Se la soluzione si sviluppa un colore marrone, si è degradato e deve essere scartato. </li></ol></li><li> Preparare il cocktail reazione EdU nuovo ogni volta, ed utilizzare entro 15 minuti dalla preparazione. Per ottenere risultati riproducibili, assicurarsi che i componenti della reazione sono mantenuti agli stessi rapporti. <ol><li> Fare fresco 1x EdU tampone soluzione additiva diluendo la soluzione di 10x magazzino (preparata al punto 4.1.3) 1:10 in acqua deionizzata. Utilizzare questo soluzione lo stesso giorno. </li><li> Preparare 1 ml di EdU cocktail reazione combinando i seguenti ingredienti in ordine: 860 microlitri di buffer 1x EdU reazione, 40 microlitri CuSO 4, 2,5 ml di tintura azide, 100 ml 1x EdU buffer di additivo. Nota: È importante che gli ingredienti vengono aggiunti al fine di garantire prestazioni ottimali. </li></ol></li><li> Rimuovere il PBS con il 3% di BSA e aggiungere 0,5 ml di cocktail reazione EdU ad ogni provetta. Incubare a temperatura ambiente per 30 min con rotazione dolce. Mantenere i campioni al riparo dalla luce. </li><li> Rimuovere il cocktail reazione EdU e lavare una volta con 1 ml di 3% di BSA in PBS. </li><li> Lavare i campioni una volta con 1 ml di PBS. </li></ol> 5. anticorpo etichettatura Nota: eseguire l&#39;etichettatura degli anticorpi dopo EdU colorazione. Se nessuna colorazione aggiuntiva si desidera, si può procedere al montaggio e di imaging direttamente. È importante che i campioni siano protetti dalla luce in tutte le seguenti procedure. <ol><li> Rimuovere la soluzione di lavaggio. Bloccare le ovaie in 1 ml di soluzione bloccante contenente 0,2% di BSA e 0,1% Triton X-100 in PBS per 30 min. </li><li> Rimuovere la soluzione di saturazione e sostituirlo con l&#39;anticorpo primario diluito in soluzione bloccante (ad esempio, il mouse ATP sintetasi subunità α anticorpi, 1: 1000 diluizione). Incubare al buio a 4 ° CO / N. </li><li> Lavare i campioni di 1 ml di soluzione bloccante 3 volte, 10 minuti ogni volta. Per ridurre al minimo lo sfondo, lavare altre due volte per 30 minuti ciascuno. Rimuovere la soluzione di saturazione. </li><li> Incubare con anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante (per esempio, di capra anti-topo Alexa Fluor 568 anticorpo secondario, diluizione 1: 200) per 2 ore a temperatura ambiente. Nota: Utilizzare un colore diverso da quello accoppiato ad edu. </li><li> Ripetere le fasi di lavaggio eseguiti in fase 5.3. </li><li> Lavare con 1 ml di PBS, una volta per rimuovere il detergente. </li></ol> 6. Montaggio e Imaging <ol><li> Rimuovere con attenzione tutto il PBS e immediatamente coprire le ovaie con 50 ml mezzo di montaggio (con o senza DAPI). Nota: utilizzare un mezzo di montaggio che non indurisce mentre i ovarioli vengono separati l&#39;uno dall&#39;altro. Ovaie possono essere memorizzati in un mezzo di montaggio a 4 ° C per una settimana. </li><li> Tagliare l&#39;estremità di un puntale e utilizzarlo per trasferire accuratamente ovaie su un vetrino da microscopio. </li><li> Completamente separata ogni ovariole con una pinza sottile dal naso taglienti allo stereomicroscopio. Rimuovere i tessuti che collegano alla fine posteriore e la fase 14 o camere uovo maturo. I giovani camere uova sono alla fine anteriore e trasparente. </li><li> Allineare le camere d&#39;uovo con una pinza in modo che non si sovrappongano tra loro. </li><li> Lentamente abbassare vetrino coprioggetti # 1.5 sulla cima dei campioni. Lasciare che il mezzo di montaggio per polimerizzare per diverse ore a temperatura ambiente. Sigillare con smalto trasparente. </li><li> Immagine scivola il giorno dopo, o conservare a 4 ° C prima di imaging. </li><li> Visualizza sotto a mi confocalecroscope con un obiettivo ad immersione in olio 63X. Cattura immagini tridimensionali z-stack. Nota: Vi è una forte EdU segnale in camere d&#39;uovo in seguito allo stadio e fluorescenza di fondo nella guaina epiteliale. Nell&#39;esaminare etichettatura EdU in un particolare germarium, si dovrebbe evitare germariums che si sovrappongono da o vicino ad altri tessuti o camere d&#39;uovo in seguito allo stadio. </li></ol>

<ol>
	<li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease.">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nat Rev Genet. 6 (5), 389-402 (2005).</li><li>Wallace, D. C., Chalkia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+genetics+and+the+heteroplasmy+conundrum+in+evolution+and+disease.">Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (11), a021220 (2013).</li><li>Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Riechmann, V., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axis+formation+during+Drosophila+oogenesis.">Axis formation during Drosophila oogenesis.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 374-383 (2001).</li><li>Lin, H., Yue, L., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+fusome,+a+germline-specific+organelle,+contains+membrane+skeletal+proteins+and+functions+in+cyst+formation.">The Drosophila fusome, a germline-specific organelle, contains membrane skeletal proteins and functions in cyst formation.</a> Development. 120 (4), 947-956 (1994).</li><li>Cox, R. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Balbiani+body+and+the+fusome+mediate+mitochondrial+inheritance+during+Drosophila+oogenesis.">A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis.</a> Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).</li><li>Davis, A. F., Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+mitochondrial+DNA+replication+in+intact+mammalian+cells.">In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells.</a> J Cell Biol. 135 (4), 883-893 (1996).</li><li>Iborra, F. J., Kimura, H., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+mitochondrial+genomes+in+human+cells.">The functional organization of mitochondrial genomes in human cells.</a> BMC Biol. 2, (2004).</li><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+adult+primate+neocortex:+an+evaluation+of+the+evidence.">Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidence.</a> Nat Rev Neurosci. 3 (1), 65-71 (2002).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Hill, J. H., Chen, Z., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+propagation+of+functional+mitochondrial+DNA+during+oogenesis+restricts+the+transmission+of+a+deleterious+mitochondrial+variant.">Selective propagation of functional mitochondrial DNA during oogenesis restricts the transmission of a deleterious mitochondrial variant.</a> Nat Genet. 46 (4), 389-392 (2014).</li><li>Lentz, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidotriazoles+on+solid+phase:+[1,2,3]-triazoles+by+regiospecific+copper(i)-catalyzed+1,3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides.">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).</li><li>Horwitz, H. B., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+by+ethidium+bromide+of+mitochondrial+DNA+synthesis+in+physarum+polycephalum.">Specific inhibition by ethidium bromide of mitochondrial DNA synthesis in physarum polycephalum.</a> J. Cell Biol. 49, 546-553 (1971).</li><li>Huberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+the+biochemistry+of+eucaryotic+DNA+replication+revealed+by+aphidicolin,+an+unusual+inhibitor+of+DNA+polymerase+alpha.">New views of the biochemistry of eucaryotic DNA replication revealed by aphidicolin, an unusual inhibitor of DNA polymerase alpha.</a> Cell. 23 (3), 647-648 (1981).</li><li>McClung, C., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotypic+behavioral+responses+to+free-base+cocaine+and+the+development+of+behavioral+sensitization+in+Drosophila.">Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila.</a> Curr Biol. 8 (2), 109-112 (1998).</li><li>Moore, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+intoxication+in+Drosophila:+Genetic+and+pharmacological+evidence+for+regulation+by+the+cAMP+signaling+pathway.">Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway.</a> Cell. 93 (6), 997-1007 (1998).</li><li>Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-aminobutyric+acid+B+receptor+1+mediates+behavior-impairing+actions+of+alcohol+in+Drosophila:+adult+RNA+interference+and+pharmacological+evidence.">Gamma-aminobutyric acid B receptor 1 mediates behavior-impairing actions of alcohol in Drosophila: adult RNA interference and pharmacological evidence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5485-5490 (2003).</li><li>Koch, E. A., Spitzer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+colchicine+on+oogenesis+in+Drosophila:+induced+sterility+and+switch+of+potential+oocyte+to+nurse-cell+developmental+pathway.">Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway.</a> Cell Tissue Res. 228 (1), 21-32 (1983).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

etichettatura EdU è un nuovo metodo ed efficiente per rilevare la sintesi del DNA in cellule proliferanti, che si basa sulla costituzione e la colorazione di analoghi nucleosidici nel DNA di nuova sintesi. Questo metodo è superiore al metodo di etichettatura BrdU in quanto è più veloce e altamente sensibile. Ancora più importante, permette di buona conservazione strutturale e penetrazione edu-dye efficiente di tutto il montaggio tessuti 9, 10. Storicamente, come un&#39;alternativa superiore per l&#39;etichettatura BrdU, etichettatura EdU è stato utilizzato per studiare la replicazione del DNA nucleare durante la fase S del ciclo cellulare. Afidicolina è un inibitore della DNA polimerasi α, che è la polimerasi principale per la replicazione del DNA nucleare in fase S 12 15. replicazione del mtDNA viene effettuata da DNA polimerasi γ, che è insensibile ai afidicolina trattamento. Quindi, il trattamento con afidicolina prima e durante l&#39;incubazione EdU significativamente inibito EdU incorporazione nel DNA nucleare. Dovrebbenotato che afidicolina può essere stabile per diverse settimane se opportunamente conservato, e l&#39;efficacia di afidicolina nell&#39;inibire la replicazione del DNA nucleare era variabile nelle nostre mani. I ovarioli o camere d&#39;uovo con una forte etichettatura DNA nucleare dovrebbero essere esclusi dalla analisi di ulteriori dati. replicazione del mtDNA può essere facilmente visualizzato come puncta nel citoplasma, che offre anche un modo semplice per quantificare il livello di replicazione del mtDNA contando il numero di EdU puncta, normalizzata al volume totale di citoplasma. software di imaging può essere applicato a identificare automaticamente EdU puncta nelle immagini microscopiche, il che è particolarmente utile per le analisi computazionali di grandi insiemi di dati. Tuttavia, dovrebbero essere prese precauzioni, in quanto l&#39;inibizione incompleta della replicazione del DNA nucleare può portare alla costituzione EdU in loci distinti sul cromosoma e visualizzare come puncta all&#39;interno del nucleo. Anche in altri casi, l&#39;intensità della EdU incorporazione in replicolata mtDNA potrebbe essere debole, mentre lo sfondo e il rumore potrebbe essere elevato. Pertanto, i singoli parametri per analisi automatica delle immagini devono essere attentamente definiti. Si raccomanda inoltre che le immagini devono essere esaminati con gli occhi addestrati per fare in modo che una corretta puncta EdU sono identificati. Visualizzazione di nuova sintesi mtDNA durante Drosophila oogenesis offre l&#39;opportunità di indagare come la replicazione del DNA mitocondriale è regolata in condizioni fisiologiche o patologiche, svolgendo l&#39;esperimento in mosche sottoposti a una serie di perturbazioni farmacologici o genetici. In uno studio precedente, saggio di incorporazione EdU è stato eseguito in un mtDNA mutante Drosophila mt: COI T300I 11. Inoltre, per interrompere il potenziale di membrana mitocondriale, ovaie sono state trattate con varie concentrazioni di mitocondriale FCCP disaccoppiatore o 2,4-dinitrofenolo (DNP) prima EdU incorporazione. A seconda dei fini sperimentalie le caratteristiche di droga, metodi diversi potrebbero essere adottate per la consegna efficace. Per mosche adulte, farmaci possono essere presentati in forma di vapore (per esempio, etanolo e cocaina) 16,17 o farmaci possono essere iniettati nell&#39;addome, dove diffonde rapidamente in tutto il corpo 18. La pratica più comune è che i farmaci siano aggiunti all&#39;alimento mosca o una carta da filtro di saccarosio / farmaco-saturo. Ad esempio, l&#39;inibitore di assemblaggio dei microtubuli, colchicina, è stato alimentato a mosche per 2-3 giorni prima della dissezione ovaio 19. Quindi, è importante valutare il metodo drug delivery e selezionate concentrazioni appropriate. Per garantire il successo di imaging di replicazione del mtDNA in ovaie di Drosophila, diversi passaggi critici devono essere eseguiti con cura. Primo, preservando la vitalità e la salute delle ovaie durante la dissezione e EdU incorporazione è essenziali (punti 1 e 2). Medio Drosophila della Schneider con FBS ha bisogno di essere riscaldato a RTprima dell&#39;uso. Uno dovrebbe ridurre al minimo il contatto diretto tra le camere d&#39;uovo e strumenti di dissezione o puntali delle pipette. Le ovaie dovrebbero essere immerso sotto soluzioni tutti i tempi per evitare la disidratazione. Cattiva gestione i tessuti possono facilmente portare a svenire o segnali fluorescenti. Durante la fase di montaggio dei tessuti, ovarioli dovrebbero essere separati l&#39;uno dall&#39;altro e sparsi sul vetrino da microscopio. Assicurarsi che le camere di uova non sono impilati uno sopra l&#39;altro. Abbiamo notato che le camere a base di uova al di là di fase 14 visualizzati po &#39;incorporazione edu. Inoltre, a causa delle grandi dimensioni, le camere di uovo fase avanzata spesso causano vicine camere uovo più giovani di essere fuori fuoco. Pertanto si raccomanda che le camere fase tardiva uovo essere scartati. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l&#39;etichettatura replicare mtDNA in Drosophila ovaie adulte. Questo metodo consente la semplice quantificazione di replicazione del mtDNA sotto varie perturbazioni genetiche e farmacologiche,e sarà utile per la dissezione meccanismi alla base dello sviluppo biogenesi mitocondriale e mtDNA eredità.

Inoltre genoma nucleare, ogni cellula eucariotica contiene anche migliaia di copie di DNA circolare piccolo nella matrice mitocondriale. Mentre il DNA mitocondriale (mtDNA) codifica subunità essenziali della catena di trasporto degli elettroni, la maggioranza del proteoma mitocondriale, compresi tutti i fattori per la replicazione e trascrizione del mtDNA sono codificati dal genoma nucleare. In contrasto con il genoma nucleare che segue le leggi di Mendel dell&#39;ereditarietà, il genoma mitocondriale animale viene ereditato esclusivamente attraverso la linea materna. Pertanto, la comprensione di come mtDNA è proliferato e trasmessa da una generazione a quella successiva attraverso l&#39;ovocita femminile è di fondamentale importanza. Tuttavia, vi è continuo dibattito su come replicazione del mtDNA è regolata nella linea germinale femminile. Inoltre, la teoria collo di bottiglia mtDNA ampiamente accettata per la trasmissione del mtDNA suggerisce che la popolazione di mtDNA in cellule germinali primordiali è un sotto-campione di un numero relativamente piccolo during di sviluppo 1 2. Ciò implica anche che la replicazione del DNA mitocondriale è temporalmente e spazialmente regolamentato durante oogenesis. Quindi, il rilevamento in situ di replicazione del mtDNA durante lo sviluppo germline faciliterà la comprensione del meccanismo di mtDNA ereditarietà. Drosophila oogenesi fornisce un sistema geneticamente trattabili per studiare la replicazione del DNA mitocondriale e la trasmissione. In ciascuna delle due ovaie Drosophila, ci sono 16-20 stringhe indipendenti di camere uovo chiamati ovarioli 3, che sono le unità funzionali di produzione di uova (vedere Figura 1A). Ogni ovariole contiene un&#39;organizzazione lineare progressiva dell&#39;oogenesi, dove la punta anteriore è composto da una struttura chiamata germarium. Il germarium è ulteriormente suddiviso in quattro regioni che contengono le cellule germinali in fasi di sviluppo differenti. Nella regione 1, le cellule staminali germinali passare attraverso la divisione asimmetrica per produrre cellule figlie noto come cystoblasts. Regione 2a contiene i cystoblasts che hanno completato la loro divisione finale. Cystoblasts sottoposti a quattro cicli di divisione che produce gruppi di 16 cellule. I 16 cellule rimangono collegati tra loro da ponti citoplasmatici chiamati canali anello. Solo una delle celle impegna a differenziazione ovocita, mentre l&#39;altro 15 sviluppano come cellule infermiere poliploidi. Una struttura essenziale citoplasmatica, noto come fusome, si propone di agevolare la formazione di canali anello, determinare la polarità cisti e l&#39;infermiera interazioni cellula-ovociti 4,5. Poiché le cisti muovono verso regione 2b, le strutture cisti coprono l&#39;intera larghezza della germarium, e diventano più associati con cellule follicolari. Le strutture germarium terminano con la regione 3 contenente la prima camera uovo in erba. Successivamente, le camere d&#39;uovo vengono assemblate alla fine posteriore della germarium, che il progresso attraverso il ovariole in 14 tappe morfologicamente distinte. La crescita di ovociti dipende dalle cellule infermiere, which proteine di trasporto, mRNA e strutture endomembrane (ad esempio, Golgi) tramite i canali ad anello nel citoplasma dell&#39;ovocita. Durante Drosophila oogenesi, si è constatato che una frazione dei mitocondri all&#39;interno di ogni cisti di 16 cellule sono stati associati con il fusome, mosso attraverso i canali ad anello e sono stati consegnati nel singolo ovocita in una grande massa chiamato Balbiani corpo 6. Questo fenomeno è stato proposto di contribuire al controllo della qualità di eredità mitocondriale attraverso ovaie femminili. Rilevazione della sintesi del DNA mitocondriale si basa sulla costituzione dei precursori del DNA marcati nel DNA cellulare. Tradizionalmente, un analogo nucleosidico della timidina 5-bromo-2&#39;-deossiuridina (BrdU) è stato utilizzato per etichettare la replicazione del mtDNA in cellule di coltura dei tessuti 7,8. Tuttavia, l&#39;etichettatura BrdU a base di anticorpi presenta diverse limitazioni, soprattutto per tutto il montaggio colorazione dei tessuti. Uno dei principali svantaggi di etichettatura BrdU è che richiede denaturazione del DNA per esporrel&#39;epitopo BrdU, in modo che possa essere rilevato dal anticorpo anti-BrdU. Il campione deve essere trattato in condizioni denaturanti duri quali sostanze chimiche (ad esempio, acido cloridrico o miscele di metanolo e acido acetico), calore o digestione con DNasi che potrebbero interrompere la struttura del campione e complicare la seguente procedura di colorazione 9, 10. Qui, in alternativa timidina analogico 5-etinil-2&#39;-deossiuridina (EdU) viene utilizzato per etichettare il DNA mitocondriale replicare in Drosophila ovaie adulte. Questo metodo è più veloce e altamente sensibile. EdU è facilmente incorporato nel DNA cellulare durante la replicazione del DNA. La seguente rilevamento si basa su una reazione &quot;click&quot;, un Cu (I) -catalyzed reazione covalente tra il gruppo alchino terminale e una azide fluorescente 10. Poiché la reazione non richiede la denaturazione del campione, permette una buona conservazione strutturale. Inoltre, la dimensione di colorante unZide è soltanto 1/500 di quella di una molecola anticorpale 10, che consente la penetrazione veloce ed efficiente dei tessuti tutto il montaggio. Abbiamo usato questo metodo per rilevare la replicazione del mtDNA durante Drosophila oogenesis e ha trovato un modello spaziale sorprendente nella regione germarium di Drosophila dell&#39;ovaio 11, che ci portano a proporre un meccanismo di ereditarietà del mtDNA selettivo replica-dipendente. Presentiamo qui un protocollo dettagliato sull&#39;etichettatura EdU di replicazione del mtDNA in ovaie di Drosophila. Per dimostrare l&#39;applicazione del protocollo, abbiamo provato anche la replicazione del mtDNA in un mtDNA mutante Drosophila (mt: COI T300I) 11, nonché con il trattamento diversificato di uncouplers mitocondriali, che dissipano il potenziale di membrana mitocondriale e potenzialmente interrompono replicazione del mtDNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10100-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aphidicolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0781</td>
			<td>Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ATP synthase subunit &#945; antibody, (15H4C4)</td>
			<td>MitoSciences</td>
			<td>Ab14748</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Hts antibody (clone RC)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>hts RC</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-038-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Elf</td>
			<td></td>
			<td>Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ labeling of mitochondrial dna replication in drosophila adult ovaries by edu staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

Il protocollo di cui sopra permette la visualizzazione delle strutture puntiformi associate con i mitocondri (Figura 1B-C), che indicano la replicazione del DNA mitocondriale durante Drosophila oogenesis. Il puncta EdU localizzato con mitocondri segnati da macchie di ATP sintetasi subunità alfa (Figura 2). I segnali osservati erano assenti in ovaie trattati con bromuro di etidio 11, un inibitore per la replica mtDNA 14, convalidando che questi puncta effettivamente etichetta replicare mtDNA.Aphidicolin stato usato per inibire la colorazione del DNA nucleare senza influire replicazione del mtDNA (Figura 2). Senza trattamento afidicolina, intensi segnali EdU etichettare i nuclei, e mtDNA puncta erano appena rilevati (Figura 3). Tuttavia, in presenza di afidicolina, incorporazione nucleare fu drasticamente ridotto e sono stati osservati numerosi puncta associati mitocondri. (Figura 1B). Tuttavia, in particolare, la replicazione del mtDNA visualizzato un modello spaziale nel germarium. Come indicato dal numero di EdU puncta, c&#39;è un livello moderato di replicazione del mtDNA nella regione 1 del germarium, ma quasi nessun EdU incorporazione nella regione 2A (Figura 1C). Come la cisti muove verso il basso a regione 2B in germarium, replicazione del mtDNA ripreso e il numero di EdU puncta nella cisti posteriore della regione 2B è molto superiore a quello della regione 2A (Figura 1C). In particolare, intensa incorporazione EdU si è concentrata intorno ai canali ad anello e le strutture fusome, come macchiato dal hu li tai shao proteine ​​(HTS). mtDNA mantenuto replica ad un livello elevato nella regione 3 della germarium (Figura 1C) Per dimostrare l&#39;associazione di specifgeni o il trattamento con la proliferazione mtDNA ic, ovaie Drosophila potrebbero essere sottoposti a manipolazione genetica o di trattamento farmacologico. Abbiamo trattato ovaie con differenti concentrazioni di FCCP, un protonophore mitocondriale classico, che dissipa potenziale di membrana mitocondriale. Come controllo, DMSO non ha effetto sulla replicazione del mtDNA (Figura 4A). Alte dosi di FCCP (10 micron) quasi esaurite replicazione del mtDNA interamente in tutto il germarium (Figura 4D). Tuttavia, la concentrazione più bassa di FCCP (2 o 5 mM) ha avuto un impatto minimo sulla replicazione del mtDNA nella regione 1 ma la replica inibito nelle regioni 2B e 3 (Figura 4B-C), suggerendo regioni 2B e 3 sono più sensibili alle perturbazioni mitocondriale, o mantengono relativi cinetica di replica più lenti. I risultati di cui sopra hanno indicato che la replicazione del DNA mitocondriale è associata con l&#39;attività mitocondriale. In particolare, diverse regioni del germarium risposto diversamente a imp mitocondrialeairment. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig1.jpg" /> Figura 1. replicazione del mtDNA durante Drosophila oogenesis. (A) Schema di un ovariole Drosophila e una vista ingrandita del germarium. Il ovariole illustra da sinistra a destra, anteriore a posteriore, successive fasi di sviluppo di camere di uovo. Nel germarium, il fusome (rosso), le cellule staminali germinali (blu), i mitocondri (verdi), ovocita futuro (linea tratteggiata, riconosciuto dal posizionamento, la struttura fusome e cluster mitocondriali), lo sviluppo di cisti (pesca) e quattro regioni di sviluppo sono mostrati . (B) Rappresentante proiezione z-stack di una wild-type ovariole etichettati da EdU e anticorpi contro HTS-RC, un marker per i canali ad anello e fusome. In presenza di afidicolina, EDU è stata incorporata nel DNA mitocondriale (punte di freccia) e nuclei (frecce). barra della scala, 10 micron.(C) Visualizzazione ingrandita della germaria delineati nella regione scatola in B. Le quattro regioni di sviluppo sono indicati. Barra della scala, 5 micron 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig2.jpg" /> Figura 2. replicazione del mtDNA nel germarium Drosophila visualizzato da Edu incorporazione con trattamento afidicolina (A) -. Sezione confocale rappresentante di un tipo germarium selvaggio che mostra EdU incorporazione (D) (verde, b), i mitocondri, segnata da ATP sintetasi subunità alfa colorazione (rosso, C), e nuclei, marcato con colorazione DAPI (blu, D) con pre-incubazione con DNA polimerasi inibitore-α afidicolina. (A &amp;# 39 ;-D &#39;) un&#39;immagine ingrandita della zona in scatola in (A) mostrando EdU incorporazione (B&#39;), i mitocondri (C &#39;) e nuclei (D&#39;). In presenza di afidicolina, incorporazione nucleare (frecce) si riduce e molti puncta sono stati localizzati all&#39;interno dei mitocondri (punte di freccia). Barre di scala, 10 micron. Il dato è stato modificato da 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig3.jpg" /> Figura 3. replica del DNA mitocondriale è appena rilevato nel germarium Drosophila senza trattamento afidicolina (A) -. (D) Sezione confocale rappresentante di un tipo germarium selvaggio che mostra EdU incorporazione (verde), i mitocondri, segnata daATP sintasi subunità alfa colorazione (rosso), e nuclei, marcato con colorazione DAPI (blu) in assenza del afidicolina DNA polimerasi inibitore-α. &#39;Immagine A ingrandita della zona in scatola in (A) mostra EdU incorporazione (B (A&#39;-D)&#39;), mitocondri (C &#39;) e nuclei (D&#39;). Senza afidicolina, intensi segnali EdU etichetta nuclei (frecce), e mtDNA puncta erano appena rilevati. Barre di scala, 10 micron. Il dato è stato modificato da 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig4.jpg" /> Figura 4. mitocondriale sganciamento danneggia la replicazione del mtDNA. Progetti z-stack rappresentativi mostrano wild-type germarium trattati con DMSO(A) o il FCCP disaccoppiatore mitocondriale a concentrazioni di 2 mM (B), 5 mM (C), 10 mM (D) durante EdU incorporazione. Si noti l&#39;etichettatura EdU alterata nella regione 2B trattati con 2 mM FCCP (B), e in entrambi regione 2B e 3 trattati con 5 micron FCCP (descritto in scatole). Quattro regioni di sviluppo sono mostrati. Frecce, DNA nucleare; punte di freccia, mtDNA. barra della scala, 10 micron. Il dato è stato modificato da 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining at JoVE.com

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ etichettatura di DNA mitocondriale di replica in Drosophila adulti ovaie di Edu colorazione

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

in-situ-labeling-mitochondrial-dna-replication-drosophila-adult

Research

JoVE Journal

Genetics

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

9.0K Views.  National Institutes of Health. Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

Video: In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Determinazione genoma a livello di timing di replicazione del DNA dei mammiferi da contenuti di misura

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Ricerca

Genetica

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Mirata<em&gt; In Situ</em&gt; mutagenesi dell&#39;istone geni in germogliamento lievito

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Cinetica di Lagging filamento sintesi del DNA<em&gt; In Vitro</em&gt; Dai replica proteine ​​batteriofago T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

Visualizzazione del Microbiota in Tick budella di intero-monta In Situ di ibridazione

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Metodologia per la rilevazione accurata di metilazione del DNA mitocondriale

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Alterazioni di modificazione post-traduzionale istone caratterizzante nel lievito Neurodegenerative Proteinopathy modelli

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

Studio funzionale in vivo sulle varianti umane rare associate alla malattia utilizzando la Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Situ etichettatura di DNA mitocondriale di replica in Drosophila adulti ovaie di Edu colorazione

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video