Este protocolo nos permite explorar facilmente as características epigenéticas da doença neurodegenerativa. A principal vantagem dessa técnica é que ela explora a levedura como um sistema modelo, em comparação com outros modelos celulares e animais de doença neurodegenerativa, a levedura é conveniente e econômica. Essa técnica nos permite mapear as alterações epigenéticas que surgem na doença neurodegenerativa, que podem levar a novos marcadores para diagnóstico, bem como novos alvos para a terapia.
Este método permite uma investigação mais aprofundada do papel das marcas epigenéticas na doença neurodegenerativa e pode ser modificado para a avaliação de fibroblastos humanos e células-tronco pluripotentes induzidas. Este método em particular contém uma série de detalhes que precisam ser demonstrados visualmente, como o carregamento adequado do aparelho de mancha ocidental. Demonstrando o procedimento estarão Michel Fallah e Navin Rana, ambos pesquisadores de graduação do laboratório Torrente.
Comece ressuando levedura de estoques de glicerol congelados em placas médias seletivas de ágar de 2% glicose, para uma incubação de dois a três dias a 30 graus Celsius. No final da incubação, a levedura reescrita inoculada para cada modelo de expressão sobre expressão e controle em cinco mililitros de meio líquido seletivo histidina. Complementado com 2% de raffinose a 30 graus Celsius e 200 rotações por minuto, durante a noite.
Na manhã seguinte, cresça 100 mililitros de cultura líquida para cada um dos modelos de superexpressão e controles em meios seletivos complementados com 2% de galactose durante a noite. E meça a densidade óptica em 600 nanômetros ou OD600 para determinar o volume da cultura durante a noite necessária para renderizar sobre culturas de expressão a um OD600 inicial de 0,3. Para induzir a superexpressão proteica, cresça a levedura no meio galactose com agitação a 30 graus Celsius para o período experimental adequado.
Em seguida, meça o OD600 de cada cultura no final do período de indução. E padronizar todas as contagens de células para o menor valor OD600. Colher as culturas em tubos de centrífugas de 50 mililitros por centrifugação e resuspensar as pelotas em um mililitro de água estéril para cada 10 mililitros de cultura cultivadas.
Alíquota de um mililitro de resuspensão celular em tubos de microcentrifuusidade individual para uma centrifugação adicional e aspirar os supernantes. Em seguida, congele as pelotas de célula em nitrogênio líquido para armazenamento a menos 80 graus celsius. Para lise as células para análise de manchas ocidentais, descongele as pelotas de células de levedura no gelo antes da resuspensão em 100 microlitres de água destilada.
Adicione 300 microlitres de hidróxido de sódio 0,2 molar e 20 microlitres de 2-Mercaptoetanol a cada amostra celular. E resuspense as pelotas por pipetação. Após uma incubação de 10 minutos no gelo, pelota as células por centrifugação e resuspensa as amostras em 100 microliters de corante de carga.
Em seguida, ferva as amostras por 10 minutos em um bloco de aquecimento. Enquanto as amostras estão sendo líricas, coloque dois géis em um suporte de gel e encha a câmara interna até o topo com tampão de corrida e a câmara externa para a marca de linha de dois gel. Quando as amostras estiverem prontas, carregue 15 microliters cada um, solução de lise celular, em cada poço dos 10 poços, 12% de gel de poliacrilamida e adicione cinco microlitadores de escada de proteína à pista de escada de proteína bem.
Execute o gel por aproximadamente 45 minutos a 150 volts ou até que o carregamento da frente de corante atinja a parte inferior do gel. Enquanto o gel estiver funcionando, mergulhe duas almofadas de fibra por gel no buffer de transferência e um fluoreto de polivinida, ou PVDF, membrana por gel em metanol. Quando o gel estiver pronto, enxágue a membrana no tampão de transferência e coloque uma almofada de fibra preso na parte inferior de uma célula de aparelho de transferência semi-seca.
Seguido pela membrana PVDF, o gel e o segundo bloco de fibra preso. Em seguida, afina a energia para 150 miliamperes por uma hora. No final da transferência de proteínas, remova a membrana do aparelho de transferência para uma breve lavagem com água destilada.
Coloque a membrana enxaguada, o lado da proteína em uma pequena caixa de coloração e cubra a membrana com soro fisiológico ou TBS, bloqueando o tampão para uma incubação de uma hora em temperatura ambiente com balanço suave. No final da incubação de bloqueio, incubar a membrana durante a noite com uma histona anti-levedura e anticorpo específico de modificação em TBS a quatro graus Celsius. E um anticorpo de controle de carga nuclear adequado.
Na manhã seguinte, lave a membrana quatro vezes em TBS, suplementada com 0,1% de polisorbato 20 por cinco minutos com balanço à temperatura ambiente por lavagem. Após a última lavagem, incubar a mancha com os anticorpos secundários apropriados durante uma hora em temperatura ambiente. Seguido por quatro, cinco minutos de lavagem em TBST e uma lavagem de cinco minutos em TBS sozinho com balanço.
Em seguida, imagine a mancha em um sistema de imaginação de manchas ocidentais fluorescentes por dois minutos. Aqui, a supressão do crescimento em culturas sólidas e líquidas é mostrada com efeitos significativos sobre o crescimento da levedura observado na presença de galactose-infundido em modelos de superexpressão de sarcoma. Uma diminuição significativa dos níveis de histona são aparentes no modelo fundido no modelo de superexpressão de sarcoma e aumentos significativos nos níveis de acetilação de histona no modelo de superexpressão da proteína de ligação TAR 43, que não são vistos no modelo de superexpressão de sarcoma ou alfa sinucleína.
Também há reduções significativas nos níveis de histona no modelo de superexpressão da sinucleína alfa. Neste experimento de afinação de sacarose, menor a quantidade de galactose usada para induzir fundido na superexpressão do sarcoma, a menor toxicidade observada na cultura sólida e líquida. É importante ressaltar que quanto menor o nível de fundição na superexpressão do sarcoma, menor a magnitude da redução dos níveis de histona.
Ao executar este protocolo, é imperativo padronizar a quantidade de levedura em cada amostra para permitir uma comparação adequada nos níveis de modificação pós-translacional de histona. 2-Mercaptoetanol deve ser usado sob um capô para evitar a inalação. Se a mancha de Ponceau for usada, deve ser descartada corretamente.
