This work is supported by the V Foundation Scholar (AGF) and the MPN Research Foundation (AGF).

Este estudo foi aprovado e executado de acordo com as recomendações do Comité Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade da Califórnia, Irvine. Todos os procedimentos foram realizados sob anestesia isoflurano e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. 1. Produção de Retrovírus ecotrópico <ol><li> Preparar plasmídeos de alta qualidade com uma concentração de pelo menos 1 mg / mL usando um kit Maxi-prep comercial ou purificação de cloreto de césio. Nota: Estes incluem um vector de espinha dorsal MSCV que codifica o gene de interesse (neste caso Calr 7,8) e o marcador de escolha (GFP, neo, etc.), bem como um plasmídeo empacotamento ecotrópico, codificação de gag-pol-env (referido como aqui plasmídeo). </li><li> Descongelar e expandir células 293T de baixa passagem em DMEM suplementado com 10% de FBS e L-glutamina com penicilina / estreptomicina (D10). Placa 5 x 10 6 células em um prato de 10 centímetros de tecido tratado com a cultura em um umidificadoincubador de cultura de tecido a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Expandir células 293T em cultura. No dia antes da transfecção, as células lavagem por adição de 1 ml de PBS e aspirar o sobrenadante para um balão de vácuo. </li><li> Para trypsinize células, adiciona-se 2 ml de tripsina a 0,05% e incubar pratos numa incubadora de cultura de tecidos humidificada durante 2-3 min a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Para parar a tripsinização, adicionar 3 ml D10 de prato e células de transferência para um tubo de 15 ml. Girar células a 400 xg durante 10 minutos. </li><li> Aspirar o sobrenadante para um agregado de células frasco de vácuo e ressuspender em 2 ml de D10. </li><li> Contagem das células por exclusão do azul de tripano utilizando um hemocitómetro. </li><li> Semente de 2 x 10 6 culas por prato em três tecidos de 10 cm pratos tratados com cultura por vírus gerados. NOTA: Para melhores resultados, não permitem que as células de exceder 30-50% de confluência no momento da transfecção ou pode ser obtido um rendimento de vírus pobre. </li><li> Imediatamente antes da transfecção,media aspirado em um balão de vácuo e substituir com 5 ml D10 fresco. </li><li> Para cada placa de Petri de 10 cm para ser transfectada preparar um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml esterilizado individual. </li><li> Pipeta 760 ul de meio de soro reduzido em cada tubo de microcentrífuga, em seguida, adicionar cuidadosamente 40 mL de reagente de transfecção diretamente para a mídia. Incubar os tubos no capuz de cultura de tecidos à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Adicionar 30 g de MSCV vector com o gene de interesse (15 ug se utilizando o vector vazio), bem como 5 ug de plasmídeo a cada tubo respectivo e misturar suavemente por pipetagem para cima e para baixo. Incubar à temperatura ambiente no capuz de cultura de tecidos durante mais 15 min. NOTA: vetores menores tendem a ter rendimentos virais mais elevadas. </li><li> Cuidadosamente adicionar o volume total de cada reacção (aproximadamente 800 mL) gota a gota em seu respectivo 10 centímetros de Petri e gentilmente incline o prato de lado a lado para misturar. células retornar ao cu tecido umidificadoincubadora LTURE. </li><li> Após 8 h ou uma incubação durante a noite na incubadora de cultura de tecidos, meios aspirado para um frasco de vácuo e colocar suavemente com 10 ml de D10 fresco. </li><li> Em 48 horas após a transfecção recolher o sobrenadante para uma seringa de 35 mL e filtrar através de uma membrana de 0,45 pm para remover detritos celulares. </li><li> OPCIONAL: Coloque 10 ml de volta fresco D10 nas células 293T e vírus adicional pode ser colhida em 72 horas após a transfecção. </li><li> Descarte as células 293T em resíduos de risco biológico quando nenhum vírus adicionais são coletadas. </li><li> sobrenadante viral alíquota em volumes de uso único (por exemplo, 1 ml de título do vírus ou 6,5 ml para a infecção BM). vírus flash-congelamento com nitrogênio líquido e vírus armazenar a -80 ° C. NOTA: Evitar ciclos de congelamento / descongelamento repetidos à medida que reduzir muito o título do vírus. </li></ol> 2. Determinar título viral Relativa por Citometria de Fluxo <ol><li> Thaw 3T3 e manter em D10. Cultura as células em um 10 centímetrosda cultura de tecidos tratados prato numa incubadora de cultura de tecidos humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Realizar título virai em triplicado. Para preparar as células, lavar as células por adição de 1 ml de PBS e aspirar o sobrenadante para um balão de vácuo. </li><li> Para trypsinize células, adiciona-se 2 ml de tripsina a 0,05% e incubar pratos numa incubadora de cultura de tecidos humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Para parar a tripsinização, adicionar 3 ml D10 de prato e células de transferência para um tubo de 15 ml. Girar células a 400 xg durante 10 minutos. </li><li> Aspirar o sobrenadante para um agregado de células frasco de vácuo e ressuspender em 2 ml de D10. </li><li> Contagem das células por exclusão do azul de tripano utilizando um hemocitómetro. </li><li> Semente células 3T3 a uma densidade de 1 x 10 5 células em quinze 60 mm pratos de tecido de cultura tratados com e incubar durante a noite. </li><li> Adicione 1: 3, 1:10, 1:30, e 1: 100 de sobrenadante viral diluições descongelado, usando D10 em um total de 1 ml. Também incluem um controle livre de vírus. </li><li> aspirar meDiâmetro de células 3T3 em um frasco de vácuo e substituir com 4 ml de D10. </li><li> Sobrepor as células 3T3 com as diluições do sobrenadante viral e adicionar polibreno a uma concentração final de 8 ug / ml a cada placa. Incubar durante 48 horas na incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Determinar título virai em relação por citometria de fluxo: <ol><li> Para lavar as células, aspirar os meios de comunicação em um balão de vácuo e adicionar 5 ml PBS. </li><li> Aspirar o PBS para um balão de vácuo. Adicionar 1 ml de 0,05% de tripsina e incubar a 37 ° C durante 2-5 minutos para separar as células do prato. </li><li> Adicionar 3 ml D10 e pipeta cima e para baixo para destacar todas as células restantes da placa. Transferir as células num tubo de FACS e centrifugar a 400 xg durante 10 min. </li><li> Decantar o sobrenadante e lavar as células com 3 ml de PBS. Centrifuga-se a 400 xg durante 10 min e o sobrenadante decantado. Ressuspender em 200 ul de PBS. </li><li> Células executado em um citômetro de fluxo 9. Recolha entre 20.000 - 30.000 eventos dentro tele vive portão celular (determinado pelo FSC vs. SSC) e calcular a percentagem de GFP + e GFP - células. NOTA: O título virai é considerada aceitável quando a diluição do sobrenadante rendimentos virais, pelo menos, 50% + 3T3 células GFP 01:30. Se esta diluição resulta em menos do que 50% de células GFP +, em seguida, sub-óptimos resultados de transdução pode ser obtido. O cálculo para determinar título virai foi adaptado a partir Limon et ai. , Blood (1997) 9. </li><li> Para determinar o título do vírus relativo, use a equação: título do vírus = formando partículas unidades (UFP) / ml = [(Número de 3T3 × frequência de células GFP +) / Volume de sobrenadante (ml)] × Factor de diluição. </li></ol></li></ol> 3. transdução de Doadores Células de Medula Óssea <ol><li> Para preparar ratinhos dadores de medula óssea (BM) de colheita, primeiro anestesiar ratos por vaporizador de isoflurano com uma taxa de fluxo de 5% suplementar combinadaoxigénio em 1 L / min. Comprima pé para avaliar a resposta. NOTA: Os ratinhos dadores (menos de 8 semanas de idade) deve ser preparado 5 dias antes da colheita de medula óssea (8 dias antes da transplantação). Um camundongos doadores irá fornecer células suficientes para pelo menos 2 receptores. </li><li> Injectar 150 mg / kg de 5-fluorouracilo (5-FU) por meio de injecção retro-orbital em ratos anestesiados usando um 27 L × ½ &quot;agulha. CUIDADO! 5-FU um agente quimioterapêutico anti-câncer. Sempre lidar com 5-FU dentro de uma Cobertura de vapores químicos certificada ou de um gabinete de biossegurança canalizado. Consulte o comitê de segurança de laboratório e animal da instituição para determinar uma rotulagem adequada de camundongos tratados com 5-FU. <ol><li> Posicione o mouse anestesiado em seu lado e restringir usando tanto o polegar eo dedo indicador de modo a que o olho sai ligeiramente da cabeça. </li><li> Começando com o lateral, agulha para o canto medial e com o bisel voltado para cima, insira a agulha em um 45° ângulo na direção medial e parar quando a agulha é inserida no meio do caminho. Lentamente injetar células e remover remova cuidadosamente agulha. NOTA: Se esta técnica é realizada corretamente, o olho deve recuar um pouco e nenhuma resistência deve ser sentida após a inserção da agulha. </li><li> Examine o mouse para detectar quaisquer sinais de lesão, tais como inchaço ou hemorragia. </li></ol></li><li> Colheita da medula óssea 5 dias após o tratamento com 5-FU (3 dias antes da transplantação). <ol><li> Anestesiar ratos por vaporizador de isoflurano com uma taxa de fluxo de 5% de oxigénio suplementar combinada em 1 L / min. Comprima pé para avaliar a resposta. </li><li> Sacrifício do mouse por deslocamento cervical. Esterilizar rato pulverizando generosamente com etanol 70%, até a pele ficar molhada. </li><li> Usando dissecando tesoura, fazer uma incisão na pele e dissecar a fáscia longe dos músculos da perna. Em seguida, dissecar a mão fora de rato, cortando o fêmur na altura do quadril e da tíbia, no tornozelo. </li><li> dobrara perna em um &quot;L&quot; forma e separar cada osso da perna, cortando na articulação do joelho com uma tesoura de dissecção. </li><li> Para remover cartilagem nas extremidades distais de cada osso da perna, usar as tesouras de dissecação para raspar suavemente músculo direcção de uma extremidade do osso da perna, até a cartilagem é desengatada. </li><li> Usando uma seringa com uma agulha de 27 G x ½ polegada, lave cada osso da perna com PBS suplementado com 2% de FBS ao longo de um membrana de nylon de 100 um de um tubo de 50 ml. osso nivelado até osso torna-se branco para maximizar o número de células colhidas. </li><li> Utilizar o êmbolo de uma seringa para triturar as células através da membrana de nylon no interior do tubo cónico de 50 ml para se obter uma suspensão de célula única. Repita com a outra perna mouse. </li></ol></li><li> células Centrifugar a 4 ° C durante 10 min a 400 xg e rejeitar o sobrenadante. Ressuspender BM potássio em 5 ml de cloreto de amónio (ACK) tampão para lisar as células vermelhas do sangue. Incubar as células em gelo durante 10 min. </li><li> Encha o tubo com PBS para parar a lise celular. Centrifuge células a 4 ° C durante 10 min a 400 xg e rejeitar o sobrenadante. Repita o passo de lise se o pellet BM tem da cor vermelha. </li><li> Ressuspender em 5 ml de PBS e contagem de células por exclusão com azul de tripano utilizando um hemocitómetro. </li><li> Ressuspender as células a 2 x 10 6 culas por M e um cocktail pré-STIM 2x que contém DMEM suplementado com 20% de FBS, L-glutamina, penicilina / estreptomicina, a IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml), e SCF (112 ng / ml). Placa de 2 ml por poço em placas de 6 cavidades. </li><li> Incubam-se as células durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Adicionar 2 ml de sobrenadante virai para cada poço contendo células de MO e adicionar polibreno (8 ug / ml). chapas giram a 30 ° C durante 90 min a 1500 xg, em seguida, voltar a placa na incubadora de cultura de tecidos durante a noite. </li><li> suspensão de células em tubos cónicos de pipeta e centrifugar a 4 ° C durante 10 minutos a 400 xg, não elimine a placa. Ressuspender as células em 2 ml fresco 2x cocktail pré-Stim por poço e voltar aos poços originais. </li&gt; <li> Executar uma spinoculation 2º, repetindo os passos 3,7-3,9. </li></ol> 4. Células de transplantes em ratos destinatário <ol><li> Prepare ratinhos receptores singeneicos para transplante com uma dose de irradiação corporal total letal &lt;24 hr antes da injecção de células de MO. NOTA: irradiação dose letal para camundongos BALB / c é normalmente 800-900 cGy e 1.000-1.200 cGy para C57B / 6 10. A dose está tipicamente em duas sessões de irradiação espaçados, pelo menos, 3-4 horas de intervalo. </li><li> Continuação da etapa 3.11, células do doador colheita transduzida a partir das 6 placas de poços com cuidado pipetando sobrenadante para tubos cônicos. Lave cada poço com 1 ml de PBS para coletar células residuais e adicionar 50 ml tubos cônicos. </li><li> Adicionar 0,5 ml de tripsina a 0,05% aos poços e incuba-se a 37 ° C na incubadora de cultura de tecido durante 5 minutos. </li><li> Adicionar 1 ml D10 aos poços e retirar todas as células restantes por pipetagem suave. Adicionar células para o respectivo tubos a partir do passo 4.2 e sedimento por centrifugação a 4 ° C durante 10 min a 400 x g. </li><li> Lavar células com PBS e centrifugação a 4 ° C durante 10 min a 400 x g. Ressuspender em 5 ml PBS e contagem de células usando um hemocitômetro por exclusão azul de tripano. NOTA: Se o vector tem uma marcação GFP então quantificar a percentagem de células positivas para GFP com um citómetro de fluxo. </li><li> Ressuspender 5 x 10 5 - 2 X 10 6 células em 50 - 100 ul de PBS para injecção em ratinhos. </li><li> Injetar células através de injecção retro-orbital em ratos anestesiados usando um 27 G x ½ &quot;agulha estéril. NOTA: Outras técnicas de injeção incluem tail-veia, baço, ou femoral. <ol><li> Anestesiar mouse usando isoflurano e pitada pé para avaliar a resposta. </li><li> Posicione o mouse de lado e restringir usando tanto o polegar eo dedo indicador de modo a que o olho sai ligeiramente da cabeça. </li><li> Com o bisel voltado para cima, insira o needle lateral ao canto medial em um ângulo de 45 °. NOTA: Se esta técnica é realizada corretamente, o olho deve recuar um pouco e nenhuma resistência deve ser sentida após a inserção da agulha. </li><li> Examine o mouse para detectar quaisquer sinais de lesão, tais como inchaço ou hemorragia. NOTA: Seguindo ratos transplante terá baixa contagem do sangue para um número de semanas e por isso são suscetíveis à infecção. pode ser utilizada a profilaxia com antibióticos ou uso de água acidificada. </li></ol></li><li> Um mês após o transplante, medir a GFP% no sangue periférico como indicador para células doadoras enxertados, por citometria de fluxo. NOTA: GFP sozinha não pode determinar o sucesso do enxerto de células. A transdução viral pode ter falhado ainda enxerto pode ter ocorrido. Neste caso, não há células GFP + seria detectado, mas o enxerto de células transplantadas foi bem-sucedida. <ol><li> Tome 10 ml de sangue periférico bY punção da veia safena da perna com um 21 L x 1 ½ &quot;seringa e adicioná-lo ao EDTA 100 mM em PBS, para prevenir a coagulação. </li><li> Adicionar 1 mL de ACK para o sangue e lise em gelo durante 10 min. as células por centrifugação a 400 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante num balão de vácuo e adicionar 1 ml de PBS suplementado com FBS a 2% para parar a lise. as células por centrifugação a 400 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante num balão de vácuo e sedimento ressuspender em 100 ul de PBS suplementado com 2% de FBS. </li><li> Executar amostras em um citômetro de fluxo e recolher 300.000 eventos dentro do portão de células vivas (determinado pelo FSC vs. SSC) e calcular a percentagem de GFP + e GFP - células 9. </li></ol></li><li> Além disso em 1 mês pós-transplante, realizar hemogramas completos (CBC) usando um analisador de hematologia veterinária automatizado 18 para monitorar a progressão da doença. NOTA: Continue a monitorar a doença por%GFP no sangue periférico e CBC mensalmente. </li><li> Para terminar a experiência, anestesiar mouse usando isoflurano e pitada pé para avaliar a resposta. Sacrifício do mouse por deslocamento cervical e baço colheita e medula óssea para histopatologia. NOTA: A duração do experimento é subjetivo e a data da rescisão deve ser avaliada com base no fenótipo da doença esperado. </li></ol>

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	<li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).</li><li>Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Jak2V617F+causes+a+polycythemia+vera-like+disease+with+associated+myelofibrosis+in+a+murine+bone+marrow+transplant+model.">Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model.</a> Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).</li><li>Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAK2V617F+expression+in+murine+hematopoietic+cells+leads+to+MPD+mimicking+human+PV+with+secondary+myelofibrosis.">JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis.</a> Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).</li><li>Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+and+therapy+of+polycythemia+induced+in+mice+by+JAK2+V617F.">Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F.</a> PloS One. 1, e18 (2006).</li><li>Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+murine+JAK2V617F-positive+myeloproliferative+disease.">Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease.</a> Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).</li><li>Marty, C., Pecquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. , (2015).</li><li>Klampfl, T., Gisslinger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+calreticulin+in+myeloproliferative+neoplasms.">Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.</a> N. Engl. J. Med. 369 (25), 2379-2390 (2013).</li><li>Araki, M., Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+thrombopoietin+receptor+by+mutant+calreticulin+in+CALR-mutant+myeloproliferative+neoplasms.">Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms.</a> Blood. , (2016).</li><li>Lim&#243;n, A., Briones, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Titer+Retroviral+Vectors+Containing+the+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein+Gene+for+Efficient+Expression+in+Hematopoietic+Cells.">High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells.</a> Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).</li><li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+bone+marrow+transplantation+(BMT):+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies.">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).</li><li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Replication-Defective+Retrovirus+by+Transient+Transfection+of+293T+cells.">Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells.</a> J. Vis. Exp. (10), (2007).</li><li>Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Hematopoietic+Stem+Cell+Identification+And+Analysis.">Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis.</a> Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).</li><li>Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+side+population+cells.">Isolation and characterization of mouse side population cells.</a> Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).</li><li>Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD150-+side+population+cells+represent+a+functionally+distinct+population+of+long-term+hematopoietic+stem+cells.">CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).</li><li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors.">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li><li>Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+myeloproliferative+neoplasms:+JAK+of+all+grades.">Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades.</a> Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).</li><li>Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloproliferative+neoplasm+animal+models.">Myeloproliferative neoplasm animal models.</a> Hematol. Oncol. Clin. North Am. 26 (5), 1065-1081 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este protocolo fornece uma descrição detalhada de como realizar os transplantes de medula óssea em ratinhos recapitular uma doença trombocitemia essencial, como com progressão para mielofibrose com mutação CALRdel52 como o controlador da doença. O transplante bem sucedido de células que expressam os resultados CALRdel52 no aumento de plaquetas, a expansão de megacariócitos e fibrose da medula óssea. Como o transplante de medula óssea é um processo de vários passos, é importante reconhecer passos onde err...

Transdução-transplante é um método útil para modelar doenças malignas hematológicas em ratinhos. Esta técnica tem sido particularmente valiosa para estudar malignidades mielóides que datam da primeira demonstração de que a expressão ectópica de BCR-ABL1 poderia fielmente recapitular leucemia mielóide crônica em ratos 1. Esta técnica foi posteriormente facilitou o estudo extensivo de JAK2 V617F e MPL W515K / L mutado neoplasia mieloproliferativa (MPN). NMP são um grupo de doenças hematológicas, caracterizado por o excesso de produção de células mielóides maduras e fibrose da medula óssea. Essas doenças geralmente surgem a partir da expansão clonal de uma célula-tronco hematopoiéticas, que adquiriu uma mutação somática em qualquer Jak2, MPL, ou Calr. Transdução-transplante JAK2 V617F e MPL W515K L modelos / exibem as características clínicas da policitemia vera e mielofibrose 2-5 &lt;/ Sup&gt;. Recentemente, também foi gerado um modelo de ratinho de NMP mutada-calreticulina com o método de transdução-transplante 6. Estes ratinhos desenvolvem uma doença essencial thrombocythemia-like com o aumento das plaquetas, aumento do número de megacariócitos e fibrose da medula óssea. Juntos, esses modelos não só forneceram a oportunidade para obter insights sobre a patogênese molecular do MPN, mas também a capacidade de desenvolver e estudar terapias em um ambiente pré-clínica. Este manuscrito fornece uma descrição detalhada da metodologia de transdução-transplante, com foco na mutação CALRdel52. Esta técnica envolve a transplantação de células de medula óssea transduzidas retroviralmente expressando o mutante de construir em ratinhos receptores singeneicos irradiados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELL LINES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLASMIDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoPak, also known as pCL-Eco</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12371</td>
			<td>Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional &#947;-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCV-IRES-GFP (MIG)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20672</td>
			<td>Additional &#947;-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONSUMABLES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin/L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-30-009-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-25-052-CI</td>
			<td>Can be homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12565268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9840454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-FU</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A13456-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100um cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12565270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>130184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45um syringe filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974061B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Can be homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>216-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365809001</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml centrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray irradiator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transduction-transplantation mouse model of myeloproliferative neoplasm

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

A técnica de transdução-transplante resulta na reconstituição hematopoiética dos ratinhos receptores com células que expressam o gene de interesse. A Figura 1 mostra uma visão geral do modelo de rato transdução-transplante de calreticulina mutado MPN. Resumidamente, retrovírus que expressam CALRwt ou CALRdel52 é utilizado para infectar células de MO de um ratinho dador C57B / 6. transduzidas células são transplantadas para irradiado C57B / 6 rato receptor ...

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Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

Transdução-Transplante Rato Modelo de neoplasia mieloproliferativa

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

transduction-transplantation-mouse-model-myeloproliferative

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.8K visualizações.  University of California, Irvine. This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation. 

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Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will survive longer than five years. In order to understand and mimic the microenvironment of pancreatic tumors, we utilized a murine orthotopic model of pancreatic cancer that allows non-invasive imaging of tumor progression in real time. Pancreatic cancer cells expressing green fluorescent protein (PANC-1 GFP) were suspended in basement membrane matrix, high concentration, (e.g., Matrigel HC) with serum-free media and then injected into the tail of the pancreas via laparotomy. The cell suspension in the high concentration basement membrane matrix becomes a gel-like substance once it reaches room temperature; therefore, it gels when it comes in contact with the pancreas, creating a seal at the injection site and preventing any cell leakage. Tumor growth and metastasis to other organs are monitored in live animals by using fluorescence. It is critical to use the appropriate filters for excitation and emission of GFP. The steps for the orthotopic implantation are detailed in this article so researchers can easily replicate the procedure in nude mice. The main steps of this protocol are preparation of the cell suspension, surgical implantation, and whole body fluorescent in vivo imaging. This orthotopic model is designed to investigate the efficacy of novel therapeutics on primary and metastatic tumors.

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

Fluorescente modelo de camundongo ortotópico de câncer de pâncreas

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Pesquisa do câncer

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. Here we describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. With appropriate shielding, the irradiation targets the lower abdominal/pelvic region of the mouse, sparing the brain, in an effort to model radiation treatment received by individuals with pelvic cancers. We deliver an irradiation dose that is sufficient to induce fatigue-like behavior in mice, measured by voluntary wheel-running activity (VWRA), without causing obvious morbidity. Since wheel running is a normal, voluntary behavior in mice, its use should have little confounding effect on other behavioral tests or biological measures. Hence, wheel running can be used as a feasible outcome measure in understanding the behavioral and biological correlates of fatigue. CRF is a complex condition with frequent comorbidities, and likely has causes related both to cancer and its various treatments. The methods described in this paper are useful for investigating radiation-induced changes that contribute to the development of CRF and, more generally, to explore the biological networks that can explain the development and persistence of a peripherally-triggered but centrally-driven behavior like fatigue.

We describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. The selected non-lethal irradiation dose leads to a week-long reduction in voluntary wheel-running activity.

Um mouse modelo de fadiga induzida por irradiação periférica

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Genetically engineered mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in large organs such as the colon in which only a single tumor is desired.
As a result, an immunocompetent, genetically engineered mouse model of colorectal cancer was developed which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor development is initiated by surgical, segmental infection of the distal colon with adeno-cre virus in compound conditionally mutant mice. The tumors can be easily detected and monitored via colonoscopy. We here describe the surgical technique of segmental adeno-cre infection of the colon, the surveillance of the tumor via high-resolution colonoscopy and present the resulting colorectal tumors.

A protocol for the establishment of a genetically engineered mouse model of colorectal cancer by segmental adeno-cre infection and its surveillance via high-resolution colonoscopy is presented.

Um modelo de mouse de engenharia genética de câncer colorretal esporádico

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when stimulated by T lymphocytes, oncogenic B cells survive and expand autonomously in undefined organ niches. Mantle cell lymphoma (MCL) is one such B cell disorder, where the median survival rate of patients is 4 - 5 years. This calls for the need of effective mechanisms by which the homing and engraftment of these cells are blocked in order to increase the survival and longevity of patients. Therefore, the effort to develop a xenograft mouse model to study the efficacy of MCL therapeutics by blocking the homing mechanism in vivo is of utmost importance. Development of animal recipients for human cell xenotransplantation to test early stage drugs have long been pursued, as relevant preclinical mouse models are crucial to screen new therapeutic agents. This animal model is developed to avoid human graft rejection and to establish a model for human diseases, and it may be an extremely useful tool to study disease progression of different lymphoma types and to perform preclinical testing of candidate drugs for hematologic malignancies, like MCL. We established a xenograft mouse model that will serve as an excellent resource to study and develop novel therapeutic approaches for MCL.

Mantle cell lymphoma (MCL) is a difficult to treat B cell disorder and it is equally difficult to establish a xenograft mouse model of primary MCL to study and develop therapeutics. Here, we describe the successful establishment of MCL xenografts in mice to help understand its underlying biology.

Enxertia de tumor em um modelo do rato de enxerto heterólogo de linfoma de células do manto humano

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches including the promising immunotherapeutic strategies. Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique that induces tumor cell death without destruction of adjacent collagenous structures, thus enabling the procedure to be performed in tumors very close to blood vessels. Unlike thermal ablation techniques, IRE results in gradual apoptotic cell death, along with immediate ablation induced necrosis, and is currently in clinical use for selected patients with locally advanced PC. An ablative, non-target specific procedure like IRE can induce a myriad of responses in the tumor microenvironment. A few studies have addressed the effects of IRE on tumor growth in other tumor types, but none have focused on PC. We have developed a syngeneic mouse model of PC in which subcutaneous (SQ) and orthotopic tumors can be successfully treated with IRE in a highly controlled setting, facilitating various longitudinal studies post procedure. This animal model serves as a robust system to study the effects of IRE and ways to improve the clinical efficacy of IRE.

Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique used for the treatment of locally advanced pancreatic cancer. Being a relatively new technique, the effects of IRE on the tumor growth are poorly understood. We have developed a syngeneic mouse model that facilitates studying the effects of IRE on pancreatic cancer.

Um modelo de Mouse Syngeneic câncer pancreático para estudar os efeitos da eletroporação irreversível

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

Implantação ortotópica guiada por ultrassom do Adenocarcinoma Ductal Pancreático murine

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer (PC). To address this deficiency, we describe a mouse model involving orthotopic implantation of PC followed by distal pancreatectomy and splenectomy. The model has been demonstrated to be safe and suitably flexible for the study of various therapeutic approaches in adjuvant and neo adjuvant settings.
In this model, a pancreatic tumor is first generated by implanting a mixture of human pancreatic cancer cells (luciferase-tagged AsPC-1) and human cancer associated pancreatic stellate cells into the distal pancreas of Balb/c athymic nude mice. After three weeks, the cancer is resected by re-laparotomy, distal pancreatectomy and splenectomy. In this model, bioluminescence imaging can be used to follow the progress of cancer development and effects of resection/treatments. Following resection, adjuvant therapy can be given. Alternatively, neoadjuvant treatment can be given prior to resection.
Representative data from 45 mice are presented. All mice underwent successful distal pancreatectomy/splenectomy with no issues of hemostasis. A macroscopic proximal pancreatic margin greater than 5 mm was achieved in 43 (96%) mice. The technical success rate of pancreatic resection was 100%, with 0% early mortality and morbidity. None of the animals died during the week after resection.
In summary, we describe a robust and reproducible technique for a surgical resection model of pancreatic cancer in mice which mimics the clinical scenario. The model may be useful for the testing of both adjuvant and neoadjuvant treatments.

In the clinical context, patients with localized pancreatic cancer will undergo pancreatectomy followed by adjuvant treatment. This protocol reported here aims to establish a safe and effective method of modelling this clinical scenario in nude mice, through orthotopic implantation of pancreatic cancer followed by distal pancreatectomy and splenectomy.

Um modelo de rato resemcional ortotópico de câncer pancreático

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor types, numerous mouse models have been developed in order to investigate the next generation of cancer therapies. However, in GIST, most in vivo studies use xenograft mouse models which have inherent limitations. Here, we describe an immunocompetent, genetically engineered mouse model of gastrointestinal stromal tumor harboring a KitV558&#916;/+ mutation. In this model, mutant KIT, the oncogene responsible for most GISTs, is driven by its endogenous promoter leading to a GIST which mimics the histological appearance and immune infiltrate seen in human GISTs. Furthermore, this model has been used successfully to investigate both targeted molecular and immune therapies. Here, we describe the breeding and maintenance of a KitV558&#916;/+ mouse colony. Additionally, this paper details the treatment and procurement of GIST, draining mesenteric lymph node, and adjacent cecum in KitV558&#916;/+ mice, as well as sample preparation for molecular and immunologic analyses.

The goal of this manuscript is to describe the KitV558&#916;/+&#160;mouse model and techniques for successful dissection and processing of mouse specimens.

Técnicas moleculares e imunológicas em um modelo de rato geneticamente modificado de tumor estrommal gastrointestinal

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites have been the gold standards for conditional or inducible gene targeting. To provide faster and more efficient experimental models, an ex vivo organoid culture system is developed using adenovirus Cre and normal urothelial cells carrying multiple loxP alleles of the tumor suppressors Trp53, Pten, and Rb1. Normal urothelial cells are enzymatically disassociated from four bladders of triple floxed mice (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). The urothelial cells are transduced ex vivo with adenovirus-Cre driven by a CMV promoter (Ad5CMVCre). The transduced bladder organoids are cultured, propagated, and characterized in vitro and in vivo. PCR is used to confirm gene deletions in Trp53, Pten, and Rb1. Immunofluorescence (IF) staining of organoids demonstrates positive expression of urothelial lineage markers (CK5 and p63). The organoids are injected subcutaneously into host mice for tumor expansion and serial passages. The immunohistochemistry (IHC) of xenografts exhibits positive expression of CK7, CK5, and p63 and negative expression of CK8 and Uroplakin 3. In summary, adenovirus-mediated gene deletion from mouse urothelial cells engineered with loxP sites is an efficient method to rapidly test the tumorigenic potential of defined genetic alterations.

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

This protocol describes the process of the generation and characterization of mouse urothelial organoids harboring deletions in genes of interest. The methods include harvesting mouse urothelial cells, ex vivo transduction with adenovirus driving Cre expression with a CMV promoter, and in vitro as well as in vivo characterization.

Ex Vivo Modelo organoide de deleções genéticas mediadas por Adenovírus-Cre em células uroteliais de camundongos

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...