Desenvolvemos um protocolo rápido e eficiente para gerar organoides de câncer de bexiga através da edição de genes ex vivo de células uroteliais normais do rato carregando alelos floxados em genes de interesse. Este método ex vivo tem um fluxo de trabalho de uma a duas semanas em vez de anos de reprodução de camundongos, e é altamente eficiente na transdução de adenovírus nas exclusões genéticas mediadas por Cre. Para começar, prepare todos os instrumentos estéreis e reagentes, incluindo tesoura, fórceps, DPBS em pratos de cultura de 35 mililitros, 70% de etanol, gaze e toalhas de papel limpas.
Em seguida, limpe todas as superfícies da área de dissecção e cubra a área de dissecção com uma toalha de papel limpa. Coloque o rato eutanizado sobre a gaze na área de dissecção e pulverize 70% de etanol no abdômen do camundongo, em seguida, usando uma tesoura de dissecção estéril, faça uma incisão abdominal média inferior para expor a bexiga. Agora, use os fórceps para agarrar e puxar suavemente a bexiga para identificar a junção ureterovesical bilateral.
Usando uma tesoura, remova o fundus da bexiga, seguindo a linha de fronteira entre as duas aberturas de ureter e transfira a bexiga para um prato estéril contendo 2 mililitros de DPBS, em seguida, remova o tecido gorduroso e conjuntivo e coloque a bexiga em um novo prato contendo 2 mililitros de DPBS. Remova também o adenovírus do armazenamento Celsius de menos 80 graus e mantenha-o no gelo. Para dissociação celular, prepare todos os instrumentos e reagentes estéreis como descrito no manuscrito, em seguida, em um armário de biossegurança, transfira a bexiga para um prato de 35 milímetros e lave com 2 mililitros de DPBS estéreis.
Colete tecidos da bexiga de quatro ratos em um prato com um mililitro de meio de cultura completa sem FBS despojados de carvão. Em seguida, usando uma lâmina cirúrgica, pique cada bexiga em quatro pedaços iguais, em seguida, usando fórceps, desdobre a bexiga para expor a superfície do urotélio ao meio. Transfira as peças da bexiga e o meio em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Lave o prato duas vezes com 2 mililitros de meio de cultura completa sem FBS despojados de carvão e adicione a lavagem ao tubo de centrífuga, elevando o volume total para 5 mililitros. Em seguida, adicione uma mistura de colagem e hialuronidase e coloque o tubo horizontalmente em uma incubadora de shaker orbital de 37 graus Celsius por 30 minutos a 200 RPM. Após a digestão do tecido, adicione um volume igual de FBS e DPBS descascados de carvão de 10% no tubo e centrífuga a 200 vezes g por 5 minutos.
Depois de descartar o supernasce, adicione 2 mililitros de trippsina substitua a pelota celular e misture bem, depois incubar o tubo a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 4 minutos. Após a incubação, pipete as células para cima e para baixo 10 vezes com uma ponta P1000 padrão e adicione 5 mililitros de FBS e DPBS 10% de carvão. Coe as células dissociadas através de um coador de células estéreis de 100 micrômetros e colete a suspensão celular em um tubo de 50 mililitros.
Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros e centrífuga a 200 vezes g durante 5 minutos. Depois de remover o supernasce, resuspense a pelota em 1 mililitro de meio de cultura completa. Conte o número de células usando um hemótmetro e placa 0,5 vezes 10 a 6ª células em cada poço de uma placa de 24 poços com 0,5 mililitros de meio de cultura completa fresco.
Em seguida, retire os extratos matriciais de células de sarcoma de rato Engelbreth-Holm-Swarm de menos 20 graus Celsius e descongele-as no gelo. Além disso, pré-aquecimento uma placa de 6 poços em uma incubadora de células Celsius de 37 graus. Para transdução adenoviral, adicione 2 microliters de adenovírus na placa de 24 poços e misture bem com as células dissociadas da urotelia.
Para melhorar a eficácia da transdução, realize a spinoculação centrifugando a placa a 300 vezes g por 30 minutos, em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 1 hora. Transfira células e médias do poço para um tubo de 15 mililitros e centrífuga a 200 vezes g por 5 minutos. Depois de descartar o supernascer, adicione 50 microliters de meio de cultura completa e misture bem com as células na parte inferior.
Em seguida, adicione 140 microliters de extrato de matriz e misture suavemente bem para evitar bolhas de ar, em seguida, crie cúpulas para organoides adicionando rapidamente 50 microliters da solução por cúpula na placa pré-ensacado de 6 poços. Incubar a placa e permitir que as cúpulas se solidifiquem por 5 minutos. Após 5 minutos, vire a placa de 6 poços de cabeça para baixo e continue a solidificação por mais 25 minutos.
Após a incubação, adicione 2,5 mililitros de cultura completa a cada poço e coloque a placa em uma incubadora para cultura organoide. A proteína fluorescente verde foi detectada em quase 100% das células, sugerindo alta eficiência da transdução do adenovírus. A coloração de hematoxilina e eosina e a imunohistoquímica de tumores organoides triplos eliminar mostraram a morfologia do carcinoma urotelial de alto grau com expressão proteica positiva de marcadores de subtipos basais de CK5 e p63.
Os alelos floxados não recombinados foram detectados em células uroteliais, não tratadas com adenovírus, enquanto os alelos recombinados foram observados nos organoides triplos nocauteados. Em geral, 2 a 3 semanas foram necessárias para formar um tumor subcutâneo de 2 centímetros. A imunohistoquímica de organoides triplos nocautes, in vivo xenoenxertos, exibiu expressão positiva das proteínas CK7, CK5 e p63.
A expressão negativa foi detectada para proteínas CK8 e uroplakin. O marcador de mesenquime, vimentina, foi detectado apenas na cápsula do tumor ou estroma. A dissociação da bexiga do rato não deve exceder 30 minutos.
Um tempo de dissociação mais longo pode aumentar na porcentagem das células estroma, como células endoteliais e os fibroblastos Essa abordagem pode ser combinada com a classificação celular ou o tipo celular de um adenovírus específico para gerar o tipo celular de organoides específicos, como lúmen versus organoides basais.
