Este método permite a determinação do metabolismo celular assassino natural. Um parâmetro-chave na ativação medindo o consumo de oxigênio e as alterações de pH no meio extracelular. A vantagem do analisador de fluxo extracelular é que ele é totalmente automatizado e capaz de testar até 92 amostras em tempo real com baixas quantidades de células.
Permitindo assim telas de alto rendimento. Um método válido para determinar a glicólise e a respiração em células inky é muito importante na clínica. Uma vez que existem muitas doenças, incluindo obesidade e câncer, onde o metabolismo celular inky é prejudicado.
Comece por tubos de 20 mililitros de meio de separação de linfócitos em um tubo cônico de 50 mililitros. Mantendo o tubo no ângulo de 30 graus, gentilmente pipeta 20 mililitros de sangue sobre o meio. Criando uma interface visível e bem definida entre os dois fluidos.
Centrifugar os tubos por 25 minutos a 1000 vezes G.Em seguida, retire cuidadosamente os tubos da centrífuga e coloque-os em um rack. Verifique se há uma camada visível de células na interface entre LSM e plasma. Aspire suavemente a camada de célula mononuclear com uma pipeta de plástico de 10 mililitros e coloque-a em um novo tubo cônico de 50 mililitros.
Lave as células mononucleares duas vezes com 45 mililitros de PBS. E centrifuá-los a 800 vezes G por cinco minutos. Para isolar as células assassinas naturais ou engaves, conte os mares PVM e resuspensá-los no tampão de separação NK em uma vez 10 para as oitavas células por mililitro.
Em seguida, transfira 10 mililitros da suspensão celular para um novo tubo de 50 mililitros. Adicione 500 microliters da mistura de anticorpos de isolamento celular NK. E 10 microliters de anti CD três mistura de anticorpos de isolamento positivo para os PBMCs.
E incuba-los à temperatura ambiente por 10 minutos. Contas magnéticas de vórtice e adicione um mililitro aos PBMCs e anticorpos. Em seguida, incubar o MIGS por 10 minutos em temperatura ambiente com agitação ocasional.
Adicione 35 mililitros de tampão de isolamento NK e coloque o tubo no ímã por 15 minutos. Colete cuidadosamente o supernatante com uma pipeta de plástico de 50 mililitros sem tocar nas laterais ou na parte inferior do tubo. Conte as células e centrífuga-as a 800 vezes G por cinco minutos.
Para estimular as células NK com corredor solúvel 15, resuspenque 750.000 células em 100 microliters de IMDM contendo 10%HS em um poço de uma placa de poço 96. Diluir corredor humano 15 a um micrograma por mililitro no IMDM e 10% HS. E adicione 100 microliters do corredor humano diluído 15 às células.
Repare uma amostra de controle com células não estimuladas e coloque ambas as amostras na incubadora a 37 graus Celsius. Estimule as células por 48 horas e realize o ensaio de fluxo extracelular. Um dia antes do experimento, ligue o analisador e deixe aquecer até 37 graus Celsius.
Abra o pacote do cartucho de censura e separe o cartucho da placa de utilidade. Em seguida, adicione 200 microliters da solução calibrante a cada poço da placa de utilidade. E coloque o cartucho central de volta para garantir que os sensores estão completamente submersos.
Para obter resultados ideais, incubar o cartucho durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora livre de dióxido de carbono. Que corretamente umidificado. Para preparar uma lâmina revestida de adesivo, pipeta 25 microliters da solução adesiva celular para cada poço da placa.
E incubado à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, remova a solução e lave a placa duas vezes com 200 microliters de água estéril por poço. Mantenha a placa aberta por 15 minutos dentro do capô de cultura celular para permitir que os poços sequem.
Centrifugar as células NK anteriormente isoladas adicionam 200 vezes G por cinco minutos. Em seguida, remova os supernacantes e lave as células em meio de teste de estresse mitocondrial aquecido ou meio de teste de estresse glicólise. Pelotar as células novamente e resuspensá-las para a concentração celular preferida no mesmo meio.
Coloque 180 microliters de suspensão celular por poço na placa de ensaio. Use poços A, A 12 H um e H 12 como poços de controle para correção de fundo. Adicionando 180 microliters do meio de ensaio a estes Poços Incubar a placa por 30 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora livre de dióxido de carbono.
Centrifugar a placa a 200 vezes G por cinco minutos. Em seguida, observe as células sob o microscópio para verificar se elas formam uma camada mano na parte inferior do poço. Incubar as células por mais 25 minutos.
Soluções de trabalho quentes a 37 graus Celsius. E reajustar o pH para 7,4, se necessário. Carregue os compostos previamente preparados para um teste de estresse mitocondrial ou para um teste de estresse de glicolise nas placas A, B e C do cartucho de censura hidratado Coloque o cartucho de censura carregado de volta na incubadora durante a configuração do programa.
Para configurar o protocolo de ensaio de fluxo extracelular, abra o software e use as definições do Grupo para definir as condições de pré-tratamento. Use a guia Mapa Placa para indicar os grupos de poços que possuem condições semelhantes Também indique a correção de fundo e os poços vazios. Em seguida, defina o programa na guia protocolos.
Inicie o programa e coloque o cartucho do sensor e a placa de utilidade na bandeja. Após a etapa de calibração, substitua a placa calibrante pela placa de ensaio pelas células anexadas. Uma vez concluída a execução, recupere os dados e analise-os.
A fim de avaliar a pureza e viabilidade das células NK. O pequeno Alec Watts dos mares PVM e a população isolada de células NK foram manchados e analisados por citometria de fluxo. A pureza da população celular NK foi estabelecida por dupla permanência contra CD três e CD 56 ou NKP 46.
Muitas taxas de consumo de oxigênio mitocondrial para as células NK humanas são mostradas aqui. Como esperado, os números de células I apresentaram valores OCR mais altos. Os números celulares também se correlacionam linearmente com a quantidade de DNA ou proteína no poço.
Por outro lado, os números de células mais elevados não foram ótimos. Porque após a adição de DNP, a concentração de oxigênio no poço foi totalmente esgotada em cada ciclo. O que impediu o cálculo preciso do OCR.
Nas células NK humanas, 100 DNP micromolar foram encontrados como a dose ideal. Um típico experimento de teste de estresse mitocondrial com 750.000 células NK por poço é mostrado aqui. Neste teste, a oligomicina leva a uma redução drástica no consumo de oxigênio.
E um aumento no ECAR. O que representa uma mudança para a glicólise e um esforço para manter os níveis de ATP celulares. A ativação das células NK pelo corredor 15 causou um aumento tanto no consumo mitocondrial de oxigênio quanto na acidificação extracelular.
A respiração ligada a Basal Maximal e ATP aumentou, mas não o vazamento de prótons ou a respiração não mitocondrial. Além disso, a taxa de OCR/ECA diminuiu indicando uma mudança para um metabolismo glicóltico após a estimulação do IL 15. Ao realizar este protocolo, é muito importante obter uma população celular pura e saudável para determinar o número ideal da célula e para titular a concentração de uncablers.
