The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, "Artificial immune reactions," "Camelid antibodies," and "Antibody technologies." We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.

Balb / c ou ratinhos NMRI (Mus musculus) da nossa colónia de reprodução da Universidade de Potsdam (Potsdam, Germany) foram utilizados para a produção de anticorpos monoclonais. O trabalho animal foi conduzido de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais relevantes. O estudo foi aprovado pelo Ministério Brandenburg do Meio Ambiente, Saúde e Defesa do Consumidor (referência V3-2347-A16-4-2012). 1. Preparação de imunoconjugados <ol><li> Para o acoplamento do antigénio a um veículo, usar protocolos padrão de acoplamento por meio de amino, carboxi ou sulfo-grupos, tais como por glutaraldeído, N - (3-dimetilaminopropil) - N etilcarbodiimida (EDC), ou N - [Y-maleimidobutiriloxi ] succinimida (sulfo-GMBS). </li><li> Para o acoplamento (por exemplo, com glutaraldeído) 13, utilizar a proteína ou péptido alvo e o transportador (ovalbumina, albumina de soro bovino ou hemocianina de lapa) em uma proporção de 1: 1. Dilui-se a pr-alvootein ou péptido em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e a proteína transportadora em NaHCO 3 50 mM de tampão. Adaptar o volume ea concentração ao montante necessário para imunizações. <ol><li> Misturar as duas soluções e adiciona 1,25% glutaraldeído. Misturar e incubar a amostra durante 4 horas a temperatura ambiente (RT). Para seleccionar as células de hibridoma, fazer o mesmo imunoconjugado, mas com um outro portador, a fim de evitar a selecção dos ligantes veiculares inespecíficas. </li></ol></li><li> Dializar a amostra de acoplamento através da realização de uma diálise rápido com resina comercial grosseiro (por exemplo, Sephadex G25). <ol><li> Perfurar a parte inferior de um frasco de reacção de 1,5 ml com uma agulha oca e colocá-lo em um tubo de 15 mL. Coloque a lã de vidro na parte inferior para selar e cobri-lo com 300 mg de resina grossa (à marca de referência de 0,5 mL). </li><li> Com cuidado, coloque 1 mL PBS, gota a gota em um tubo de reacção de 1,5 mL e certifique-se de que a lã de vidro ainda está selando a perfuração. Deixe a resina s grossabem e centrifuga-se a coluna a 500 xg durante 2 min. Uma tal coluna pode ser utilizado para dialisar 200 ul da amostra de acoplamento. Para volumes maiores, fazer mais colunas. </li><li> Alterar o tubo e soltar a solução de acoplamento sobre a resina grossa inchou. Centrifugar novamente a 500 xg durante 2 min. Remover o eluente a partir do tubo e usá-lo para a imunização. </li></ol></li></ol> 2. Imunização de Animais <ol><li> Escolha ratinhos Balb / c de dois ou três de 6 a 12 semanas de idade para imunização. </li><li> Para um animal, preparar 150-200 ug do imunoconjugado em 200 uL de PBS e misturá-lo com 100 uL de adjuvante completo Freund&#39;s (CFA). Misture a solução 3 vezes com uma agulha curta e fina (0,6 mm de diâmetro) numa seringa de 1 mL. Injectar a solução por via intraperitoneal no rato. </li><li> Dá uma injecção de reforço 6 semanas mais tarde com a mesma quantidade do imunoconjugado, mas sem CFA. Tome sangue 7 dias mais tarde (para fora do seio retro-orbital) e prepare o soro por incubação do sangue durante 3 - 4 h à temperatura ambiente (RT). <ol><li> Centrifugar a mistura a 3000 xg durante 5 min. Leve o sobrenadante soro e transferi-lo para um novo tubo. Armazená-lo a -20 ° C. Descartar o sedimento. </li></ol></li><li> Analisar os soros por meio de ELISA, tal como descrito no Passo 3. Por fusão, escolher com o rato com o título mais elevado de soro. </li><li> Em preparação para a fusão celular, aumentar o mouse com 150-200 mg do imunoconjugado em 300 mL de PBS sem adjuvante apenas 4 dias antes da fusão. </li></ol> 3. ELISA <ol><li> Prepara-se uma solução de antigénio com uma concentração de 5 ug / ml em PBS e transferir 50 ul em cada poço de ELISA de uma placa de 96 poços. </li><li> Incubar a placa durante 2 horas a 37 ° C ou durante a noite a 4 ° C numa câmara húmida. </li><li> Lavar a placa 3 vezes com água da torneira. Bloquear os poços com 80 mL de soro de vitelo neonatal PBS / 5% (NCS) por poço durante 1 h à temperatura ambiente numa CH húmidaâmbar. Prepare as diluições do soro em um 1: 5 série começando com 1:50. Para a análise da cultura de células, utilizar o sobrenadante de cultura não diluído. </li><li> Lavar a placa 3 vezes com água da torneira. Pipetar 50 ul de amostra por poço e incubar durante 1 h à temperatura ambiente numa câmara húmida. Preparar a solução de anticorpo secundário numa diluição de 1: 5000 de um anticorpo anti-rato IgG de cabra conjugado com peroxidase de rábano (HRP). </li><li> Lavar a placa 3 vezes com água da torneira e adicionar 50 ul de solução de anticorpo secundário por poço. Incubar durante 45 min à temperatura ambiente numa câmara húmida. </li><li> Prepara-se uma solução de substrato fresca. Faça soluções estoque de M NaH 2 PO peróxido de hidrogênio 0,1 4 e 0,1%. Tome 5 partes NaH 2 PO 4, 4 partes de peróxido de hidrogênio e uma parte tetrametilbenzidina para a solução de substrato fresco. <ol><li> Lave a placa 10 vezes com água da torneira. Pipetar 50 ul de solução de substrato fresca para os poços e incubar durante 5 - 10 min noescuro. </li></ol></li><li> Parar a reacção com 50 ul 1 H 2 SO 4 por poço. Utilizando um leitor de placa, à medida da densidade óptica a 450 nm com um comprimento de onda de referência a 630 nm. </li></ol> 4. Preparação de culturas de células de mieloma <ol><li> A partir de agora, realizar todo o trabalho em condições estéreis. </li><li> Prepare um meio de cultura fresco para o cultivo de células. Suplemento 500 ml de RPMI 1640 com 10% de soro fetal de vitelo (50 ml), 2 mM de L-glutamina (5 mL), e 50 uM de mercaptoetanol (5 mL). Substituir a glutamina a cada 7 dias. </li><li> Descongelar um frasco de SP2 0 células / murino em água morna. Transferir a solução de células para 10 ml de meio de cultura fresco e centrifuga-se durante 10 min a 200 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de meio de cultura fresco. </li><li> Transferir as células num de 25 cm2 balão e incubar a 37 ° C e 5% de CO2 numa incubadora. Expandir as células a dois de 75 m 2 frascos beffusão do minério. Conserve alíquotas para armazenamento a longo prazo, tal como descrito no Passo 7. </li></ol> 5. Preparação de células alimentadoras <ol><li> Sacrificar um rato de 12 semanas de idade NMRI (de acordo com as diretrizes nacionais e institucionais, por exemplo, por inalação de CO 2). Retire a pele e limpar o abdômen com etanol 70%. </li><li> Injectar 5 ml de meio RPMI gelado no abdômen, massagear o abdômen com uma pinça, e aspirar a suspensão de células de alimentação. Colocar as células em um tubo vazio de 50 ml. Executar este passo mais uma vez. 7 a 10 ml da suspensão de células de alimentação deve ser recuperado. </li><li> Prepara-se uma suspensão de células de alimentação de 100 ml por adição de 90 mL de meio de cultura celular completo (RPMI 1640, 10% de soro fetal de vitelo, glutamina 2 mM, e 50 uM de mercaptoetanol). Misturar-e transferir 100 ul / cavidade em placas de cultura de células de 10 x 96 cavidades. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C e 5% de CO2 numa incubadora. </li></ol> Fusão 6. celular<ol><li> Sacrificar o rato imunizado por deslocamento cervical ou inalação de CO 2 e extirpar o baço 14. Aqui adicional de sangue a partir do coração e preparar o soro, tal como descrito na etapa 2.3, como um controlo positivo no ELISA. </li><li> Prepara-se uma suspensão de células do baço pressionando o baço através de um filtro de células. Encha até 20 mL com meio de cultura celular completo. Colher as células em tubos de 50 mL por centrifugação (200 xg, 10 min, e 4 ° C). Descartar o sobrenadante. </li><li> Lavar o balão de cultura de células e colheita das células de mieloma por centrifugação (200 xg, 10 min, e 4 ° C) e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as peletes de células em 20 mL de tampão de sal equilibrada (BSS) (NaCl 125 mM, KCl 5 mM, CaCl 2 4 mM, MgCl 2 2,5 mM, e Tris-HCl 5; pH 7,4) e centrifuga-se novamente. Repita os passos de lavagem três vezes. </li><li> Para ajustar o esplenócitos: proporção de células de mieloma, contar as células após o segundo passo de lavagem por abetor ressuspensão do sedimento em 1 ml de tampão BSS. Fazer uma diluição 1:10 e transferir 10 ul de uma câmara de contagem de células. Contar as células e determinar a concentração de células em 1 ml. </li><li> Ajustar os números de células no tampão BSS para três peças de esplenócitos e de células de mieloma de uma parte em um volume final de 1 ml. Tome 200 uL da suspensão de células e misturá-lo com 200 uL de PEG8000 (1 g em 4 mL de tampão BSS). Transferir 400 uL numa cuveta de electroporação com um diâmetro de 2 mm e definir o pulso (600-650 V e 25 ms). <ol><li> Após o pulso, as células incubar à TA durante 3 minutos na cuvete. Remover as células e colocá-los gota a gota a um balão de Erlenmeyer com 100 mL de meio HAT (meio RPMI 1640, FCS a 10%, glutamina 2 mM, mercaptoetanol 50 uM, 100 uM de hipoxantina, 5,8 ^ M azaserina, e 16 ^ M de timidina). </li><li> Repetir a fusão até 4 vezes o lote de 1 ml é gasto. Incubar o balão de Erlenmeyer de 3 h a CO 2 37 ° C e 5%numa incubadora. </li></ol></li><li> Suplemento da suspensão de células novamente com hipoxantina, azaserina, e timidina antes do plaqueamento das células na camada alimentadora. Adicionam-se 100 uL da suspensão de células por poço, às placas de camada alimentadora e incubar as placas a 37 ° C e 5% de CO 2 (numa incubadora). A concentração final no poço deverá ser de 100 uM de hipoxantina, 5,8 ^ M azaserina, e 16 ^ M de timidina. </li><li> Realizar uma análise microscópica (ampliação: 10x lente objectiva, 10X olho peça) para o crescimento clonal em cada poço da placa, após 7 dias, a fim de determinar se os poços são mono- ou policlonal. células monoclonais são um aglomerado de células que se originam a partir de uma única célula. células policlonais são múltiplos grupos de células num poço. Mudar o meio completo após 7 dias e novamente incubar durante 7 dias em meio HAT. </li><li> Alterar o meio HAT e cultivar as células em meio de cultura celular completo. Utilizar o sobrenadante para executar um ELISA, tal como descrito no passo 3. As células de hibridoma positivas deve ser expandido em placas de 24 cavidades de acordo com os ensaios para a produção de anticorpos específicos. Se as células são policlonais, uma diluição limitada tem de ser realizada (descrito no passo 8). </li></ol> 7. crioconservação de hibridomas <ol><li> Cryoconservé mono- positiva e hibridomas policlonais para armazenamento a longo prazo. Colheita das células a partir de uma placa de 24 poços com uma confluência de&gt; 60% por centrifugação (200 xg, 10 min, e 4 ° C). </li><li> Ressuspender o sedimento em 500 ul de meio de cultura celular completo e transferi-lo para um tubo criogénico. Adicionar 500 mL de meio de congelamento (RPMI 1640, 20% FCS, e 15% de dimetilsulfóxido), misturá-lo e colocá-lo em em uma caixa de isopor ou uma caixa de congelamento especial. Armazenar a -80 ° C durante 3 dias. Após 3 dias, o tubo criogénico pode ser transferida para azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo. </li></ol> 8. diluição limitante de anticorpos policlonais Os hibridomas <ol><li> MakEA cultura camada de alimentação, tal como descrito no Passo 5. colheita de células policlonais positivas, conforme descrito no Passo 7.1. Contar as células, tal como descrito no passo 6.5, e ajustar o número de células para 10 células / ml, com um volume final de 10 ml para uma placa de 96 poços. Adicionam-se 100 ul / poço para a camada alimentadora. </li><li> Incubar durante 7 dias a 37 ° C e analisar o crescimento clonal microscopicamente (ampliação: 10x lente objectiva, 10X olho peça). Realizar uma ELISA do sobrenadante da cultura, tal como descrito no Passo 3, e identificar os hibridomas monoclonais adequados para a cultura em massa. </li></ol> 9. cultura de massa e purificação de anticorpos monoclonais <ol><li> Transferir os hibridomas monoclonais com os sinais adequados ELISA a 25 cm2 ou 75 cm 2 frascos e recolher-se a 500 mL do sobrenadante da cultura. Testar o semanal de cultura para produção de anticorpos específicos e de conservação 3 - 5 aliquotas por hibridoma para armazenamento a longo prazo, tal como descrito no passo 7. </li><li&gt; Centrifugar o sobrenadante da cultura a 4.900 x g e 4 ° C durante 15 minutos e filtrar através de um filtro de 0,45? M. Misturar-se o sobrenadante com tampão (NaCl 4 M e 2 M de glicina NaOH, pH 8,9) de ligação na proporção de 3: 1. </li><li> Prepara-se uma coluna de proteína A por lavagem com tampão de lavagem (tampão de ligação diluir a 1: 3 em dH 2 O). Passa-se o sobrenadante a partir do passo 9.2 sobre a coluna e recolher o fluxo de passagem. Elui-se o anticorpo ligado com citrato 0,1 M, pH 3,5 e neutralizar o pH imediatamente com 500 mL de Tris-HCl, pH 9,0. </li><li> Caracterizar o anticorpo eluído por SDS-PAGE, Western Blot, e ELISA, e validar para a aplicação final. <ol><li> Para o SDS-PAGE, tomar 3-5 ug de solução de anticorpo purificada por pista (uma amostra de 20 mL), adicionam-se 5 mL de 4x SDS tampão de carregamento de amostra (8% de SDS, 20% de 2-mercaptoetanol, 40% de glicerina, e 0,015 bromofenol%, reduzido), e aquecer as sondas a 95 ° C durante 5 min. Como controlo, usa o mesmo com uma amostra de uma purificadontibody do mesmo isotipo, mas de especificidade irrelevante. </li><li> Coloque as amostras em um gel SDS 12,5%, coloque 5 mL de uma escada de proteína imaculada em uma faixa adicional, e separá-los por electroforese. Manchar o gel com Coomassie Brilliant Blue e documentar os resultados. Um protocolo básico SDS foi estabelecida por Laemmli, em 1970 15. </li></ol></li></ol>

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The authors Pamela Holzl&#246;hner and Katja Hanack are the co-founders of new/era/mabs GmbH, a company that offers the customized generation of monoclonal antibodies.

A geração de anticorpos monoclonais por tecnologia de hibridoma requer uma análise epitopo intensa e detalhada, especialmente no que respeita à aplicação final, quando o anticorpo deve reconhecer o alvo. Este é muitas vezes subestimada pelos usuários e leva a anticorpos com performances fracas. O processo de fusão, é aleatória, o que significa que o resultado de hibridomas específicos é altamente dependente da proporção de células e a vitalidade neste ponto. Após diluição limitada, as células são mu...

A tecnologia de hibridoma apresentadas neste protocolo foi descrita pela primeira vez por Kohler e Milstein 1 em 1975 e, com exceção de algumas melhorias técnicas, do processo principal não mudou dramaticamente durante os últimos 40 anos 2. O objectivo do presente protocolo é a explicar uma estratégia mais adequada a imunização, um método padrão para a geração de anticorpos monoclonais, e um exemplo de um método de validação (ELISA). Os anticorpos são ferramentas incrível e contribuem para uma grande variedade de abordagens tecnológicas, tais como citometria de fluxo, separação de células magnético, ou imunofluorescência, bem como para possibilidades de diagnóstico e terapêuticas para o controlo e tratamento da doença 3. A disponibilidade comercial de anticorpos monoclonais para os alvos desejados é demonstrada pela presença de mais de 24 bases de dados da web com diferentes quantidades de cerca de inúmeros anticorpos ou de produtos relacionados com o Anticorpo 4. Em 2015, ummoléculas ntibody eram parte de uma discussão internacional 5-7 devido a problemas graves na validação adequada e caracterização de anticorpos disponíveis comercialmente. Pode ser difícil e caro para encontrar os anticorpos específicos para um antigénio alvo, e, muitas vezes, eles não têm a afinidade ou especificidade necessárias. Apesar de gerar um anticorpo ainda é demorado e requer pessoal qualificado para desenvolver e validar o anticorpo, produzindo um anticorpo individualmente poderia melhor do que comprar um. Devido ao facto de a produção de anticorpos é demorada e exige experiência, foram desenvolvidos métodos alternativos para a produção de moléculas de ligação para superar estes problemas. O método alternativo mais utilizada é a produção recombinante de anticorpos de cadeia simples através de apresentação de fagos. Os genes para a região variável de ligação são extraídos a partir de células e combinado com a proteína de revestimento de um fago. os single cadeia é então expresso na superfície de uma bacteriófago e rastreados em vários passos panning 8. A produção de anticorpos de cadeia única é um pouco mais rápido, mas também requer um experimentalista especializado. As desvantagens de alguns anticorpos de cadeia simples recombinantes são fraca estabilidade e falta de aptidão para o diagnóstico in vitro. Na maioria dos testes de diagnóstico, um receptor de Fc para detecção é necessário, o que tem de ser adicionado a um anticorpo de cadeia única recombinante depois. Mais uma vez, esta é morosa e ainda mais complexa do que a técnica de hibridoma. Em diagnóstico in vitro, de anticorpos de comprimento completo monoclonal de ratinho e de coelho foram demonstradas para ser a melhor escolha. Um dos principais passos na geração de anticorpos monoclonais deve ser feito antes que o trabalho começa no laboratório: o desenho do imunoconjugado. Questões que precisam ser abordadas são: Qual é a composição física do alvo na última application, e em que as matrizes estão presentes? Onde a concentração será o alvo tem na sua aplicação? Qual é a aplicação final, e quais são os requisitos que o anticorpo deve cumprir? Ter sempre em conta que, se um fragmento de péptido linear é usado, tem também de ser linear, no epitopo final no alvo de escolha; caso contrário, o anticorpo não se ligarão. Claro que, independentemente do método de rastreio, os anticorpos podem ser seleccionadas para reconhecer diferentes formatos antigénicos em diferentes aplicações, mas este deve ser validado de forma muito precisa. Estas são as razões pelas quais o desenvolvimento de anticorpos e validação são tais processos ambiciosos. A escolha do formato antigénico para a imunização é fundamental para o desenvolvimento de anticorpos e determina o sucesso ou a falha do presente processo. Uma vez que os ratinhos expressam um título de anticorpo necessário, as células do baço são isoladas e fundidas com células de mieloma. As linhas celulares de mieloma mais comuns paradesenvolvimento anticorpo monoclonal murino são X63-Ag 8.653 9 e Sp2 / 0-Ag 14 10 a partir de um / c estirpe de ratinhos Balb. As células são descendentes de um linfoma de células B malignas e foram selecionados porque eles não secretam qualquer de suas próprias cadeias pesadas ou leves. As células podem ser adaptadas a uma razão entre 1:10 e 10: 1 (em comparação com células de mieloma esplenócitos). Neste protocolo, as células foram adaptadas para uma proporção de 3: 1 e fundida por polietileno-glicol (PEG) e de electrofusão, de acordo com Stoicheva e Hui 11. A fusão de células B e células de mieloma é um processo aleatório. Portanto, dois híbridos de linfócitos B ou duas células de mieloma pode ser gerada, mas esses híbridos não seriam capazes de sobreviver durante um longo período de tempo em cultura. As células passam por uma selecção de hipoxantina, aminopterina, e timidina (HAT), pelo que apenas as células de hibridoma fundidas podem sobreviver devido à possibilidade de utilizar a via de novo da síntese de pirimidina. Para a geração de monoclonal anticorpos, é necessário para obter uma linha de células proveniente de uma célula mãe. O monoclonalidade é assegurada por limitar as técnicas de diluição e a análise microscópica de crescimento celular. Os sobrenadantes da cultura de hibridoma são rastreados quanto à produção de anticorpos específicos, principalmente por meio de ELISA ou citometria de fluxo, e os melhores ligantes são seleccionados. Após cultura em massa e a purificação, a molécula de anticorpo pode, finalmente, ser caracterizado e validado para a aplicação desejada.

<table><tbody><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(3-dimethylaminopropyl)-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-ethylcarbodiimide (EDC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39391-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-GMBS</td><td>Perbio Science Germany</td><td>22324</td><td></td></tr><tr><td>ovalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>keyhole limpet hemocyanin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8283</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 mL</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P91015</td><td></td></tr><tr><td>reaction vials, 1.5 mL</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>CNT2.1</td><td></td></tr><tr><td>hollow needle</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>glass wool</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>6574.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 coarse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GE-17-0034-02</td><td></td></tr><tr><td>Freund&amp;acute;s adjuvant, complete</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F5881-10ML</td><td></td></tr><tr><td>ELISA plates, 96 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>neonatal calf serum</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S1025</td><td></td></tr><tr><td>TipOne Tips 1,000 &amp;micro;L</td><td>Starlab</td><td>S1111-2021</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips 200 &amp;micro;L</td><td>Greiner bio-one</td><td>739291</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td><td>Dianova</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>tetramethylbenzidine</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>6350.2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>peroxide/urea</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sulphuric acid</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>4623.3</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies GmbH</td><td>31870074</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>HN08.2</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>TC-flask 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V025</td><td></td></tr><tr><td>TC-flask 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V075</td><td></td></tr><tr><td>ethanol, 96%</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>P075.1</td><td></td></tr><tr><td>cell strainer</td><td>VWR international</td><td>734-0002</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 50 mL</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P91050</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>electroporation cuvette, 2 mm</td><td>Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K.</td><td>EKL2,25</td><td></td></tr><tr><td>hypoxanthine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9636-25G</td><td></td></tr><tr><td>azaserine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4142</td><td></td></tr><tr><td>thymidine</td><td>USB Europa GmbH</td><td>22305 1 GM</td><td></td></tr><tr><td>TC-plates 96 well</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92696</td><td></td></tr><tr><td>TC-plates 24 well</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92424</td><td></td></tr><tr><td>cryotubes, 1 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V7384-1CS</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>protein A sepharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3391-1G</td><td></td></tr><tr><td>SDS sample loading buffer, Roti-Load 1</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>unstained protein ladder</td><td>BioRad Laboratories</td><td>161-0363</td><td></td></tr><tr><td>comassie brilliant blue R-250</td><td>BioRad Laboratories</td><td>161-0406</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of murine monoclonal antibodies by hybridoma technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

A Figura 1 mostra um exemplo do título do soro específico de antigénio para uma imunização realizados no laboratório. Nesta figura, o soro imune A e B foram titulados a partir de 1:50 até 1: 5.000.000, em comparação com um soro de um rato ingénuos. O antigénio foi revestido em fase sólida, e os anticorpos específicos foram detectados com um anticorpo Ig anti-ratinho de cabra conjugado com POD. Ambos os soros dos ratinhos imunizados apresentaram títulos sign...

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Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

Geração de anticorpos monoclonais murinos pelo hibridoma Tecnologia

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

generation-of-murine-monoclonal-antibodies-by-hybridoma-technology

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

41.6K visualizações.  University of Potsdam. An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening. 

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Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating histoplasmosis caused by the fungus Histoplasma capsulatum and 2) to examine the role of virulence factors as target for therapy. To generate mAbs, mice are immunized, the immune responses are assessed using a solid phase ELISA system developed in our laboratory, and the best responder mice are selected for isolation of splenocytes for fusion with hybridoma cells. C57BL/6 mice have been extensively used to study H. capsulatum pathogenesis and provide the best model for obtaining the data required. In order to assess the role of the mAbs in infection, mice are intraperitoneally administered with either mAb to H. capsulatum or isotype matched control mAb and then infected by either intravenous (i.v.), intraperitoneal (i.p.), or intranasal (i.n.) routes. In the scientific literature, efficacy of mAbs for fungal infections in mice relies on mortality as an end point, in conjunction with colony formin units (CFU) assessments at earlier time points. Survival (time to death) studies are necessary as they best represent human disease. Thus, efficacy of our intervention would not adequately be established without survival curves. This is also true for establishing efficacy of vaccine or testing of mutants for virulence. With histoplasmosis, the mice often go from being energetic to dead over several hours. The capacity of an intervention such as the administration of a mAb may initially protect an animal from disease, but the disease can relapse which would not be realized in short CFU experiments. In addition to survival and fungal burden assays, we examine the inflammatory responses to infection (histology, cellular recruitment, cytokine responses). For survival/time to death experiments, the mice are infected and monitored at least twice daily for signs of morbidity. To assess fungal burden, histopathology, and cytokine responses, the mice are euthanized at various times after infection. Animal experiments are performed according to the guidelines of the Institute for Animal Studies of the Albert Einstein College of Medicine.

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

C57BL/6 mice have been used to study Hc pathogenesis and provide the best model. We are exploring the potential benefits of humoral immunity against this fungus and generated several mAbs [to histone H2B and a heat shock protein 60kDa] that we tested for their protective efficacy after intraperitoneal administration.

Administração passiva de anticorpos monoclonais contra H. capsulatum E outros patógenos fúngicos

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Imunologia e Infecção

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Geração de IgG Humana Recombinante de Anticorpos Monoclonais As células seleccionadas a partir de B imortalizadas

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Geração de anticorpos monoclonais contra produtos naturais

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response without any interference such as low protein expression, enzyme inactivity, or structural changes. This makes APN an attractive candidate in the development of vaccines that selectively target the mucosal epithelium. Previous studies have shown that APN is a receptor protein for both enterotoxigenic Escherichia coli (E. coli) F4 and transmissible gastroenteritis virus. Thus, APN shows promise in the development of antibody-drug conjugates or novel vaccines based on APN-specific antibodies. In this study, we compared production of APN-specific monoclonal antibodies (mAbs) using traditional hybridoma technology and recombinant antibody expression method. We also established a stably transfected Chinese hamster ovary (CHO) cell line using pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN and an E. coli expression BL21(DE3) strain harboring the pET28a (+)-rAbs-APN vector. The results show that antibodies expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and mAbs produced using hybridomas could recognize and bind to the APN protein. This provides the basis for further elucidation of the APN receptor function for the development of therapeutics targeting different APN-specific epitopes.

The recombinant antibody protein expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and monoclonal antibodies produced using traditional hybridoma technology can recognize and bind to the porcine aminopeptidase N (APN) protein.

Produção de anticorpos monoclonais contra aminopeptidase N no epitélio da mucosa intestinal suína

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Polyclonal antibodies are defined as a collection of antibodies directed against different antigenic determinants of an antigen or several antigens (1). While polyclonal antibodies are powerful tools for identifying biological molecules, there is one important limitation - they are unable to distinguish between antigens that share antigenic determinants. For example, when bovine serum albumin is used to immunize an animal, B cells with different surface Ig will respond to different antigenic determinants on bovine serum albumin. The result is a mixture of antibodies in the antiserum. Because bovine serum albumin shares some epitopes with human serum albumin in evolutionarily conserved regions of the protein, this anti-bovine serum albumin antiserum will also react with human serum albumin. Therefore, this antiserum will not be useful for distinguishing between bovine and human serum albumins.
Several approaches have been taken to overcome the specificity issue of polyclonal antisera. One is by absorbing the unwanted antibodies by passing the antiserum through a chromatography column of immobilized antigens (2). This method is tedious and frequently unable to completely remove the unwanted antibodies. Another approach is to isolate individual antibody-producing B cells and expand them in culture. However, like most normal untransformed cells, B cells do not survive in long-term culture.
To overcome the inability of B cells to survive in culture, one approach is to prepare a myeloma-B cell hybridoma. In 1847, Henry Bence-Jones discovered that patients with multiple myeloma, a lymphoid tumor, produced a large quantity of antibodies (3). B cells in these patients have become malignant and grow uncontrollably. Since the malignant B cells are derived from a single clone, they are identical and produce only a single type of antibody (i.e., a monoclonal antibody, or mAb). However, most of these myeloma cells produce antibodies of unknown specificities. In 1975, by fusing a myeloma cell to a B cell, Cesar Milstein and Georges Kohler succeeded in producing a hybridoma that can be cultured indefinitely in vitro and produces an unlimited number of monoclonal antibodies of known antigenic specificity (4). The rationale behind their approach is to combine the immortal properties of the myeloma cell and the antibody producing properties of the B cell. Their technique revolutionized antibody production and provides a powerful means for identification and purification of biological molecules using monoclonal antibodies.
Generally, preparing a monoclonal antibody requires several months. The general procedure includes the following steps:
<ol>
	<li>Immunization and screening of antibody titer</li>
	<li>Fusion of antibody-producing B cells and myeloma cells</li>
	<li>Selective growth of the hybridoma</li>
	<li>Screening the hybridomas for producing the desired monoclonal antibody</li>
	<li>Cloning by limiting dilution - a process whereby cells are diluted to a concentration to statistically allow for less than 1 cell to be added to the wells of a 96-well plate. Some wells will end up with 0 cells and some will have 1 cell. The wells with seeded with 1 cell will eventually grow into a monoclonal population of cells.</li>
	<li>Growth of the hybridoma and preparation of monoclonal antibody</li>
</ol>
This protocol focuses on the last step - growth of the hybridoma and preparation of the monoclonal antibody. The antibody is purified from the culture supernatant by ammonium sulfate precipitation (often referred to as salting out) - a commonly used method of removing proteins from a solution. Proteins in solution form hydrogen bonds, along with other hydrophilic interactions, with water through their exposed polar and ionic groups. When concentrations of small, highly charged ions (such as ammonium or sulfate) are added, these groups compete with the proteins for binding to water. This removes the water molecules from the protein and decreases its solubility, resulting in precipitation of the protein.

Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Geração de anticorpos: produzindo anticorpos monoclonais usando hibridomas

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

Education

JoVE Science Education

Biologia Avançada

Imunologia

Generating Recombinant Monoclonal Antibodies From Mammalian Cell Cultures

Source: Nogales-Gadea, G. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52830">Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015)
This video demonstrates a method of antibody generation from mammalian cells by introducing plasmid vectors with heavy and light chain genes. These vectors interact with polyethylenimine and enter the cells by forming polyplexes; later, they are translated into individual proteins and assembled into complete antibodies, which are secreted into the extracellular medium.

Geração de anticorpos monoclonais recombinantes a partir de culturas de células de mamíferos

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Isolation of Peripheral Blood ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Antibody-Based Technologies

Production and Purification

A Hybridoma Technology for Producing Monoclonal Antibodies against a Metallopeptidase

Source: Xia, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62437">Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an assay to produce monoclonal antibodies against porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase, using a traditional hybridoma technology. Upon immunizing a mouse with APN, the spleen cells are harvested and fused with immortal myeloma cells to produce hybridomas. The hybridomas are then selected and proliferated using the HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) medium to produce monoclonal antibodies specific to different APN epitopes.

Uma tecnologia de hibridoma para produção de anticorpos monoclonais contra uma metalopeptidase

All animal model procedures have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Animal ...

A Technique to Generate Monoclonal Antibodies from Antigen-Specific B Cells

Source: Devilder, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56508">Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.</a> J. Vis. Exp. (2018).
The video demonstrates a technique for generating monoclonal antibodies from antigen-specific B cells. Eukaryotic expression vectors encoding the heavy and light chains of antibodies, cloned from isolated antigen-specific B cells, are introduced into mammalian cells using polyplexes. Once inside the cells, these vectors undergo translation, and the resulting heavy and light chain peptides assemble into antibodies, which are subsequently secreted by the cells.

Uma técnica para gerar anticorpos monoclonais a partir de células B específicas do antígeno

1. Production of mAbs

	The day before the transfection, seed 15,000 Human embryonic kidney 293A (HEK 293A) cells in 200 &#181;L of Dulbecco&#39;s ...

Hybridoma Technology

Hybridoma technology is used for the large-scale production of monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies bind to only a single antigenic determinant or epitope. Such antibodies are used in research, diagnostics, and disease therapy. The hybridoma technology established in 1975 by Georges K&#246;hler and Cesar Milstein was awarded the Nobel Prize in Medicine in 1984 for revolutionizing research and therapy.
Hybridoma Selection
Commonly used fusion techniques &#8212; electroporation, polyethylene glycol (PEG) mediated fusion, and the use of fusogenic viruses &#8212; generally produce hybridomas at a very low frequency. Fusion products thus have a high ratio of self-fused B-cells and myeloma cells, or unfused cells, with a low number of hybrid cells.
The hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium is used to select hybridomas by selectively allowing their growth. The aminopterin blocks the default nucleotide synthesis in cells. However, cells can utilize hypoxanthine and thymidine from the medium to synthesize nucleotides via the salvage pathway.
Myeloma cells deficient in the HGPRT enzyme cannot synthesize nucleotides via this pathway and thus, do not grow in HAT medium. Although B-cells produce functional HGPRT enzymes, they cannot divide indefinitely. Thus, only the hybrid cells with functional HGPT from the B-cells and immortality from the myeloma line can grow on the HAT selection medium. Such a culture of hybrid cells is called a hybridoma, which can be screened for monoclonal antibody production.
Hybridoma Screening
Hybridoma cultures from the HAT selection are plated onto a 96-well plate; each well containing only one cell. Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), each cell is screened for the production of antibodies specific to the epitope of interest. Cells that test positive are then selected and grown in a larger culture vessel to establish hybridoma cell lines. These cell lines are a permanent source of unlimited monoclonal antibodies. Thus hybridoma technology is a convenient and cost-effective method for mass production of monoclonal antibodies.

Tecnologia de Hibridoma

Hybridoma technology is used for the large-scale production of monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies bind to only a single antigenic determinant or ...