Name: generation of murine monoclonal antibodies by hybridoma technology
Uploaded: 2017-01-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology at JoVE.com

The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, "Artificial immune reactions," "Camelid antibodies," and "Antibody technologies." We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.

Potsdam&#39;ın University (Potsdam, Almanya), bizim ıslah kolonisinden Balb / c ya da NMRI fareleri (Mus musculus) monoklonal antikorların üretilmesi için kullanıldı. Hayvan çalışmaları, ilgili ulusal ve uluslar arası kurallara göre yapılmıştır. Çalışma Ortamı, Sağlık Brandenburg Bakanlığı ve Tüketiciyi Koruma (referans numarası V3-2347-A16-4-2012) tarafından onaylanmıştır. Immüno 1. Hazırlık <ol><li> Bir taşıyıcıya antijen bağlanması için, amino- ile standart eşleme protokollerini kullanarak, örneğin glutaraldehid, N ile olduğu gibi karboksi ya da sülfo-gruplan, - (3-dimetilaminopropil) - etilkarbodiimid (EDC) veya N - [y-maleimidobutiriloksi ] süksinimid ester (sülfo-GMBS). </li><li> : 1 oranında (glutaraldehitle ör) bağlantı 13, bir 1 hedef proteini veya peptidi ve bir taşıyıcı (ovalbümin, büyükbaş hayvan serum albümini veya anahtar deliği limpet hemosiyanin) kullanın. Hedef pr seyreltinotein veya fosfat tamponlu tuz (PBS) ve 50 mM NaHCO 3 tamponunda taşıyıcı protein peptid. hacim ve aşılar için gerekli miktara konsantrasyonu uyarlayın. <ol><li> Her iki çözüm karıştırın ve% 1.25 glutaraldehid ekleyin. Karıştırınız ve oda sıcaklığında 4 saat (RT) örnek inkübe edilir. hibridoma hücreleri seçmek için aynı immünokonjugatı yapmak, ancak başka bir taşıyıcı ile, sırayla belirsiz taşıyıcı bağlayıcıların seçimi önlemek için. </li></ol></li><li> (Örneğin, Sephadex G25) ticari kaba reçine ile hızlı bir diyaliz gerçekleştirerek bağlantı örneği dialyze. <ol><li> içi boş bir iğne ile bir 1.5 ml reaksiyon şişesine alt delmek ve bir 15 ml tüp içine koyun. Sızdırmazlık için alt cam yünü koyun ve (0.5 mL kalibrasyon işareti) kaba reçine 300 mg ile örtün. </li><li> Dikkatle, 1.5 ml reaksiyon tüpüne 1 ml PBS damla damla koymak ve cam yünü hala perforasyon sızdırmazlık emin olun. kaba reçine s Letiyi ve santrifüj 2 dakika süreyle 500 xg&#39;de sütun. Bu tür bir kolon birleştirme örnek 200 uL diyaliz için kullanılabilir. yüksek miktarlar için, daha fazla sütun yapmak. </li><li> hortumunu değiştirin ve kabarmış kaba reçine üzerine bağlantı çözümü bırakın. Santrifüj tekrar 2 dakika süreyle 500 xg&#39;de. tüpten eluent çıkarın ve bağışıklama için kullanabilirsiniz. </li></ol></li></ol> Hayvanların 2. Bağışıklama <ol><li> immünizasyon için, iki ya da üç 6 ila 12 haftalık Balb / c fareleri seçin. </li><li> 200 ul PBS içinde immüno 200 ug ve tam Freund&#39;s yardımcı madde, 100 uL (CFA) ile karıştırarak - bir hayvan için, 150 hazırlayın. 1 ml şırınga çözelti bir kısa ve ince bir iğne ile 3 kez (0.6 mm çap) karıştırın. fare içine intraperitoneal çözüm enjekte. </li><li> 6 hafta sonra immüno aynı miktarda bir yükseltici enjeksiyonu, ama CFA olmadan. (Retroorbital sinüs dışarı) 7 gün sonra kan ve Koordinatörler alınOda sıcaklığında 4 saat (RT) - 3 için kan inkübe edilerek serum yeniden. <ol><li> 5 dakika boyunca 3.000 xg&#39;de karışımı santrifüj. Serum süpernatant atın ve yeni bir tüp içine aktarın. -20 ° C&#39;de saklayın. pelet atın. </li></ol></li><li> ELISA aracılığıyla sera analiz, füzyon için Adım 3&#39;te açıklandığı gibi, en yüksek serum titresi ile fare seçin. </li><li> Sadece 4 gün füzyon önce adjuvan olmadan PBS 300 uL immüno 200 mikrogram - hücre füzyonu için hazırlık olarak, 150 ile fare artırmak. </li></ol> 3. ELISA <ol><li> PBS içinde 5 mg / mL&#39;lik bir konsantrasyon ile bir antijen çözeltisi hazırlayın ve 96 oyuklu plakanın her bir ELISA içinde 50 uL aktarın. </li><li> 37 ° C ya da gece boyunca nemli bir oda içinde 4 ° C&#39;de 2 saat boyunca inkübasyona bırakılır. </li><li> musluk suyu ile plaka 3 kez yıkayın. Nemli Ch, oda sıcaklığında 1 saat boyunca göz başına PBS /% 5 neonatal dana serumu, 80 uL (NCS) ile kuyu blokekehribar. 1:50 ile başlayan 5 serisi: 1 serum dilüsyonları hazırlayın. hücre kültürü analizi için, seyreltilmemiş kültür süpernatanı kullanımı. </li><li> musluk suyu ile plaka 3 kez yıkayın. Pipet 50 oyuk başına örnek ul ve nemli bir oda içinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. yaban turpu peroksidazı (HRP) konjuge edilmiş bir keçi anti-fare IgG antikoru 5000 seyreltme: 1 ikincil antikor çözeltisi hazırlayın. </li><li> musluk suyu ile plaka 3 kez yıkanır ve her ikincil antikor çözeltisinin 50 ul ekle. nemli bir oda içinde oda sıcaklığında 45 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> taze bir substrat çözeltisi hazırlayın. 0.1 M NaH 2 PO 4 ve% 0.1 hidrojen peroksit stok çözümleri olun. 5 parça NaH 2 PO 4, 4 kısım hidrojen peroksit ve taze alt-tabaka çözeltisi 1 parçası tetrametilbenzidin al. <ol><li> musluk suyu ile plaka 10 kez yıkayın. Pipet 50 kuyulara taze substrat çözeltisi uL ve 5 için inkübe - 10 dakikakaranlık. </li></ol></li><li> 50 uL 1 MH 2 kuyu başına SO 4 ile reaksiyonu durdurun. Bir levha okuyucu ile 630 nm&#39;de bir referans dalga boyu ile 450 nm&#39;de optik yoğunluk ölçülür. </li></ol> Miyelom Hücre Kültürleri 4. hazırlanması <ol><li> Şu andan itibaren, steril koşullar altında tüm çalışmaları gerçekleştirmek. </li><li> Hücre ekimi için taze bir kültür ortamı hazırlayın. % 10 fetal dana serumu (50 mL), 2 mM L-glutamin (5 ml) ve 50 uM merkaptoetanol (5 mL) ile RPMI1640 500 mL Supplement. Her 7 gün glutamin değiştirin. </li><li> Sıcak su içinde murin SP2 / 0 hücre şişe çözülme. 200 x g&#39;de 10 dakika süre ile taze kültür ortamı ve santrifüj 10 ml hücre solüsyonu aktarın. Süpernatant atılır ve taze kültür ortamına 1 mL pelletini. </li><li> 25 cm2 şişeye hücreleri aktarın ve bir kuluçka CO2 37 ° C&#39;de inkübe ve% 5. İki 75-m hücreleri genişletmek 2 şişeler befcevher füzyon. Adım 7&#39;de tarif edildiği gibi, uzun süreli depolama için alikotları koruyun. </li></ol> Besleyici hücreler 5. hazırlanması <ol><li> (; Örneğin, CO 2 inhalasyon yoluyla ulusal ve kurumsal kurallarına göre) 12 haftalık NMRI fare Kurban. kürk çıkarın ve% 70 etanol ile karın temizleyin. </li><li> , Karın içine buz RPMI ortamı 5 ml enjekte edilir bir cımbız ile karın masaj ve besleyici hücre süspansiyonu aspire. Boş 50 ml bir tüp içinde hücreleri yerleştirin. bir kez daha bu adımı gerçekleştirin. besleyici hücre süspansiyonu, 7 ila 10 ml geri alınmalıdır. </li><li> Tam hücre kültür ortamında 90 mL (RPMI 1640,% 10 fetal dana serumu, 2 mM glutamin, ve 50 uM merkaptoetanol) ekleyerek 100 mL&#39;lik besleyici hücre süspansiyonu hazırlamak. Karıştır ve 10 x 96 gözlü hücre kültür levhaları içerisine oyuk başına 100 uL / ​​aktarın. Gece boyunca kuluçka makinesi içinde 37 ° C ve% 5 CO2 de inkübe edin. </li></ol> 6. Hücre Füzyon<ol><li> Servikal dislokasyon veya CO 2 inhalasyon yoluyla bağışıklı fare Kurban ve dalak 14 tüketim. ELISA&#39;da pozitif kontrol olarak, aşama 2.3&#39;de tarif edildiği gibi, kalp ek kan örneği ve serum hazırlamak. </li><li> Bir hücre süzgecinden dalak basarak bir dalak hücre süspansiyonu hazırlayın. Tam hücre kültür ortamı ile 20 ml&#39;ye kadar doldurun. santrifüj ile 50 ml tüpler hücreleri hasat (200 x g&#39;de, 10 dakika, 4 ° C). süpernatant atın. </li><li> Hücre kültür şişesi yıkayın ve santrifüj ile miyeloma hücreleri hasat (200 x g&#39;de, 10 dakika, 4 ° C) ve süpernatant atılır. </li><li> 20 dengeli tuz tamponu (BSS) hücre pelet yeniden süspanse (125 mM NaCI, 5 mM KCI, 4 mM CaCl2, 2.5 mM MgCl2, 5 mM Tris-HCI, pH 7.4) ve santrifüj daha. Yıkama üç kez adımları tekrarlayın. </li><li> splenosit ayarlamak için: miyelom hücre oranı, köknar ikinci yıkama aşamasından sonra hücreleri saymakSt BSS tamponu 1 mL içinde topağın tekrar askıda. 1:10 seyreltme yapın ve bir hücre sayım odasına 10 uL aktarın. Hücre sayımı ve 1 ml hücre konsantrasyonunu belirler. </li><li> 1 ml nihai hacim içinde üç parça splenosit ve tek parçalı bir miyelom hücrelerine BSS tamponu içinde hücre sayısını ayarlar. Hücre süspansiyonunun 200 uL al ve PEG8000 200 uL (BSS 4 ml tampon içinde 1 g) ile karıştırın. 2 mm çapındaki bir elektroporasyon küvetine 400 uL aktarın ve nabız ayarlayın (600-650 V ve 25 ms). <ol><li> nabız sonra küvet içinde 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe hücreleri. hücreleri çıkarın ve HAT ortamı 100 mL (RPMI 1640,% 10 FCS, 2 mM glutamin, 50 uM merkaptoetanol, 100 uM hipoksantin, 5.8 uM azaserin, ve 16 uM timidin) sahip bir Erlenmeyer şişesi içine damlatılmıştır. </li><li> 1-ml toplu harcanan kadar füzyon 4 kez tekrarlayın. 37 ° C ve% 5 CO2 seviyesinde 3 saat Erleni inkübebir kuluçka makinesi içinde. </li></ol></li><li> besleyici katmandaki hücreleri kaplama önce hipoksantin, azaserin ve timidin ile tekrar hücre süspansiyonu Supplement. Besleyici tabaka plakalarına yuva başına hücre süspansiyonu 100 ul ekleyin ve 37 ° C&#39;de ve% 5 (bir kuluçka makinesi içinde) CO2 de inkübe edin. oyuk içindeki nihai konsantrasyon 100 uM hipoksantin, 5.8 uM azaserin, ve 16 uM timidin olmalıdır. </li><li> kuyu mono- ya da poliklonal olup olmadığını tespit etmek amacıyla 7 gün sonra plakanın her bir klonal büyümesi için iyi: mikroskopik analiz (10X objektif lens, 10X göz parça büyütme) uygulayın. Monoklonal hücreler tek bir hücrenin köken hücrelerin bir küme vardır. Poliklonal hücre, bir gözdeki hücrelerin birden çok kümelerdir. 7 gün sonra tam ortam değiştirme ve HAT ortamında 7 gün daha inkübe edilir. </li><li> HAT ortamı değiştirin ve tam hücre kültürü ortamında hücreleri yetiştirmek. Bir E gerçekleştirmek için süpernatant kullanınAşama tarif edildiği gibi lisa 3. Pozitif hibridoma hücreleri özel antikorların üretimi için testlere göre 24 oyuklu plakalar içinde yayılması gerekir. Hücreler poliklonal ise, sınırlı seyreltme (aşama 8&#39;de tarif) yapılmalıdır. </li></ol> Hibridomalar 7. dondurarak korunması <ol><li> Uzun süreli depolama için pozitif mono- ve poliklonal hibridomalar Cryoconserve. santrifüj ile&gt;% 60 bir izdiham ile 24 oyuklu plaka hücreleri hasat (200 x g&#39;de, 10 dakika, 4 ° C). </li><li> Tam hücre kültür ortamının 500 uL pelletini ve cryotube içine aktarın. Dondurarak ortamın 500 uL (RPMI 1640,% 20 FCS ve% 15 dimethylsülfoksit) ekleyin karıştırın ve bir strafor kutu veya özel bir dondurma kutusuna koydu. 3 gün -80 ° C&#39;de saklayın. 3 gün sonra, cryotube uzun süreli saklama için sıvı nitrojen aktarılabilir. </li></ol> 8. Poliklonal hibridomalar sınırlayıcı seyreltme <ol><li> MakEA besleyici tabaka kültürü, Aşama 7.1&#39;de tarif edildiği gibi Adım 5. Hasat pozitif poliklonal hücreleri tarif edildiği gibi. Aşama 6.5 de tarif edildiği gibi, hücre sayımı ve 96 oyuklu bir plaka 10 mL&#39;lik bir son hacme sahip 10 hücre / ml hücre sayısını ayarlamak. 100 uL / ​​oyuk üzerine besleme katmanı ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de 7 gün inkübe ve mikroskopik (büyütme: 10X objektif lens, 10X göz parça) klonal büyüme analiz. Aşama 3&#39;te tarif edildiği gibi, kültür süpernatanı içinde bir ELISA olun ve kütle kültürü için uygun monoklonal hibridomlar tespit. </li></ol> 9. Kütle Kültür ve monoklonal antikorların saflaştırılması, <ol><li> 25 cm2 veya 75 cm2 şişelerde uygun ELISA sinyalleri ile monoklonal hibridomalar transferi ve kültür yüzey 500 mL&#39;ye toplar. özel bir antikor üretimi için kültür haftalık test edin ve 3 muhafaza - Adım 7&#39;de tarif edildiği gibi, uzun süreli depolama için hibridoma başına 5 alikotları. </li><li&gt; Santrifüj kültürünün 4,900 xg&#39;de süpernatan 15 dakika boyunca 4 ° C ve 0.45 mm&#39;lik bir filtreden filtre. : 1 oranında bir 3 tamponu (4 M NaCI ve 2 M glisin NaOH, pH 8.9) bağlayıcı süpernatant karıştırın. </li><li> (: DH 2 O 3 bağlayıcı tampon: 1 seyreltin) yıkama tamponu ile yıkanarak bir protein, bir kolon hazırlanmıştır. kolonu üzerinde Adım 9.2 süpernatant Pass ve flow-through toplamak. 0.1 M sitrat, pH 3.5 ile bağlı antikoru Zehir ve Tris-HCl, 500 uL, pH 9.0 hemen pH nötralize. </li><li> SDS-PAGE, Western Blot, ve ELISA ile elüt antikoru karakterize ve son uygulama için doğrulamak. <ol><li> 5 uL 4 x SDS numune yükleme tamponu (% 8 SDS,% 20 2-merkaptoetanol,% 40 gliserin ve 0.015 ekleyin, şerit (20 uL numune) her saflaştınlmış antikor çözeltisi 5 ug - SDS PAGE için, 3 sunar % bromofenol, indirgenmiş) ve 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de probları ısıtın. Bir kontrol olarak, saflaştırılmış A ile aynı örnek kullanımıAynı izotip ancak özgüllüğü belli olmayan ntibody. </li><li> ,% 12.5 SDS jel örnekleri yükleyin ek şeritte bir boyanmamış protein merdiven 5 uL koyun ve elektroforez ile ayırın. Coomassie Brillant Blue ile jel Leke ve sonuçları belgelemek. Temel SDS protokolü 1970 15 Laemmli tarafından kurulmuştur. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 7 (256), 495-497 (1975).</li><li>Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M., B&#246;ldicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+and+Selection.">Antibodies and Selection.</a> Protein Targeting Compounds. , 11-22 (2015).</li><li>Walsh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopharmaceutical+benchmarks.">Biopharmaceutical benchmarks.</a> Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).</li><li>Pauly, D., Hanack, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+avoid+pitfalls+in+antibody+use.">How to avoid pitfalls in antibody use.</a> F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).</li><li>Bradbury, A., Pl&#252;ckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility:+Standardize+antibodies+used+in+research.">Reproducibility: Standardize antibodies used in research.</a> Nature. 5 (518), 27-29 (2015).</li><li>Polakiewicz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies:+The+solution+is+validation.">Antibodies: The solution is validation.</a> Nature. 26 (518), 483 (2015).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+anarchy:+A+call+to+order.">Antibody anarchy: A call to order.</a> Nature. 26 (527), 545-551 (2015).</li><li>Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fusion+phage:+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface.">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li><li>Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mouse+myeloma+cell+line+that+has+lost+immunoglobulin+expression+but+permits+the+construction+of+antibody-secreting+hybrid+cell+lines.">A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines.</a> J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).</li><li>Shulman, M., Wilde, C. D., K&#246;hler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+better+cell+line+for+making+hybridomas+secreting+specific+antibodies.">A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies.</a> Nature. 16 (276), 269-270 (1978).</li><li>Stoicheva, N. G., Hui, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+induced+fusion+of+mammalian+cells+in+the+presence+of+polyethylene+glycol.">Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol.</a> J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).</li><li>Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+developments+in+hybridoma+technology.">Current developments in hybridoma technology.</a> Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).</li><li>Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaraldehyde:+behavior+in+aqueous+solution,+reaction+with+proteins,+and+application+to+enzyme+crosslinking.">Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking.</a> Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).</li><li>Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Surface+Immunoglobulin+II.+Isolation+and+characterization+of+immunoglobulin+from+mouse+splenic+lymphocytes.">Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes.</a> Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Browne, S. M., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+methods+for+high-producing+mammalian+cell+lines.">Selection methods for high-producing mammalian cell lines.</a> Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).</li><li>Holmes, P., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cell+line+development+by+a+high+throughput+affinity+capture+surface+display+technique+to+select+for+high+secretors.">Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors.</a> J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).</li><li>Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+microdrop+technology+for+rapid+isolation+of+rare+and+high+producer+cells.">Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells.</a> Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).</li><li>Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzl&#246;hner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgA+antibody+production+by+intrarectal+immunization+of+mice+using+recombinant+major+capsid+protein+of+hamster+polyomavirus.">IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus.</a> Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).</li><li>Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomoleküle+freisetzende+zelle+und+deren+selektion+mittels+eines+oberflächenproteins.">Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins.</a> neweramabs GmbH. , (2014).</li></ol>

The authors Pamela Holzl&#246;hner and Katja Hanack are the co-founders of new/era/mabs GmbH, a company that offers the customized generation of monoclonal antibodies.

hibridoma teknolojisi ile monoklonal antikorların üretimi, antikor hedefi kabul ne zaman, özellikle de son uygulama ile ilgili olarak, yoğun ve ayrıntılı epitop analizi gerektirir. Bu genellikle kullanıcılar tarafından hafife ve zayıf performansları ile antikorlara neden olmaktadır. Füzyon işlemi spesifik hibridomlar sonucu bu noktada hücre oranı ve canlılık üzerine son derece bağlı olduğu anlamına gelir, her rastgele. Sınırlı seyreltildikten sonra, hücreler, çok dengesizdirler ve hücre bü...

Bu protokol sunulan hibridoma teknolojisi ilk Köhler ve 1975 yılında Milstein 1 tarafından tarif edilmiştir ve bazı teknik iyileştirmeler dışında, ana prosedür son 40 yıl 2 sırasında önemli ölçüde değişmedi. Bu protokolün amacı, daha uygun bir aşı stratejisi, monoklonal antikorların üretilmesi için standart bir yöntem ve bir doğrulama yöntemi (ELISA) için bir örnek açıklamaktır. Antikorlar inanılmaz araçlar ve hastalık izleme ve tedavi 3 tanı ve tedavi seçenekleri yanı sıra, bu tür flow sitometri, manyetik hücre sıralama, ya da immünofloresan gibi teknolojik yaklaşımlar, geniş bir yelpazede katkıda bulunur. İstenilen hedeflere yönelik monoklonal antikorların, ticari uygunluk antikorlar veya antikor-ilgili ürünlerin 4 yaklaşık sayısız miktarlarda 24 farklı bir web veri tabanları varlığı ile ortaya konmuştur. 2015 yılında, birntibody moleküller nedeniyle uygun doğrulama ve piyasada mevcut antikorların karakterizasyonu ciddi sorunlara uluslararası bir tartışmanın 5-7 parçasıydı. Hedef bir antijen için spesifik antikorları bulmak zor ve pahalı olabilir, ve genellikle, bu afinite ve özgüllük gerekli bulunmamaktadır. Bir antikor üreten hala zaman alıcı ve kudret daha iyi bir satın alma daha ayrı bir antikor üreten, geliştirmek ve antikor doğrulamak için kalifiye personele ihtiyaç duyar rağmen. Nedeniyle antikor üretimi zaman alıcıdır ve deneyim gerektirir olması, bağlama moleküllerinin üretimi için alternatif yöntemler, bu sorunların üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. En yaygın olarak kullanılan alternatif bir yöntem, faj gösterimi ile, tek zincirli antikorların rekombinant üretimi. Değişken bağlayıcı bölge genleri hücrelerinden ekstre edilmiş ve bir faj kaplama proteini ile bir araya getirilmektedir. sIngle zinciri daha sonra bakteriyofaj yüzeyi üzerinde ifade edilir ve birden fazla kaydırma adımda 8 taranır. Tek zincirli antikorların üretimi daha hızlıdır, ancak, aynı zamanda, bir uzman deneye gerektirir. Bazı biraraya getiren tek zincirli antikorların dezavantajları kötü istikrar ve in vitro diagnostik için uygunluk eksikliği vardır. En tanısal testlerde, saptama için bir Fc-reseptörü sonradan yeniden birleştirici tek zincirli antikor eklenmesi ihtiyacı olan gereklidir. Yine, bu zaman alıcı ve hibridoma tekniği daha fazla karmaşıktır. In vitro diagnostik, tam uzunlukta monoklonal fare ve tavşan antikorları en iyi seçenek olarak gösterilmiştir. immüno tasarımı: laboratuarda çalışma başlamadan önce monoklonal antikorların üretilmesi önemli adımlardan biri yapılmalıdır. ele alınması gereken sorular şunlardır: Nihai applicat hedefin fiziksel kompozisyonu nediriyonu ve mevcut olduğu matrisler? hedef uygulamada hangi konsantrasyon olacak? Nihai uygulama nedir ve antikor yerine getirmesi gerektiğini istenenler nelerdir? Her zaman doğrusal bir peptid fragmanı kullanıldığı takdirde, aynı zamanda seçim hedefi nihai epitop doğrusal gerektiği dikkate almak; aksi halde, bir antikor bağlamayacaktır. Tabii ki, tarama yönteminin, bağımsız olarak, antikorlar, farklı uygulamalarda farklı antijenik biçimleri tanıyan seçilebilir, ancak bu çok kesin doğrulanması gerekir. Bu antikor geliştirme ve doğrulama gibi iddialı süreçlerdir nedenleri vardır. bağışıklama için antijenik biçimi seçimi antikor gelişimi için esastır ve bu sürecin başarısını veya başarısızlığını belirler. farenin ilgili bir antikor titresi ifade sonra, dalak hücreleri izole edildi ve miyeloma hücreleri ile birleştirilmiştir. En sık miyeloma hücre çizgilerifare monoklonal antikor gelişimi X63-Ag 8,653 9 ve Balb / c fare suşundan SP2 / 0-Ag 14 10 vardır. Hücreler malign B hücre lenfoması soyundan ve kendi ağır veya hafif zincirlerinin bir salgılar çünkü seçilmiştir. 1 (miyelom hücreleri karşı splenositler): hücreler 1:10 ile 10 arasında bir oranda uyarlanabilir. Stoicheva Hui 11&#39;e göre, 1 ve polietilen glikol (PEG) ve elektrofüzyon ile kaynaşık: Bu protokol, hücrelerin 3 bir oranda uyarlanmıştır. B hücreleri ve miyelom hücrelerinin füzyonu rasgele bir süreçtir. Bu nedenle, iki B lenfositleri ya da iki miyelom hücrelerinin hibridlerinin oluşturulmasına olabilir, ancak bu melez kültürde uzun süre hayatta mümkün olmaz. Hücreleri sadece kaynaşık hibridoma hücreleri nedeniyle pirimidin sentezi de novo yolu kullanan olasılığı dayanabildiği bir hipoksantin, aminopterin ve timidin (HAT) seçimi, tabi tutulur. mon üretimi içinoclonal antikorlar, bir ana hücreden kaynaklanan bir hücre çizgisi elde etmek için gereklidir. monoklonalitenin seyreltme teknikleri ve hücre büyümesinin mikroskobik analizi sınırlayarak sağlanır. hibridom kültür süpernatantları çok ELISA ile spesifik antikor üretimi için ya da akış sitometrisi, ve en iyi bağlayıcılar seçilebilirler. kitle kültürü ve saflaştırmadan sonra, antikor molekülü son karakterize edilebilir ve arzu edilen uygulama için doğrulandı.

<table><tbody><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(3-dimethylaminopropyl)-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-ethylcarbodiimide (EDC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39391-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-GMBS</td><td>Perbio Science Germany</td><td>22324</td><td></td></tr><tr><td>ovalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>keyhole limpet hemocyanin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8283</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 mL</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P91015</td><td></td></tr><tr><td>reaction vials, 1.5 mL</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>CNT2.1</td><td></td></tr><tr><td>hollow needle</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>glass wool</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>6574.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 coarse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GE-17-0034-02</td><td></td></tr><tr><td>Freund&amp;acute;s adjuvant, complete</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F5881-10ML</td><td></td></tr><tr><td>ELISA plates, 96 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>neonatal calf serum</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S1025</td><td></td></tr><tr><td>TipOne Tips 1,000 &amp;micro;L</td><td>Starlab</td><td>S1111-2021</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips 200 &amp;micro;L</td><td>Greiner bio-one</td><td>739291</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td><td>Dianova</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>tetramethylbenzidine</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>6350.2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>peroxide/urea</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sulphuric acid</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>4623.3</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies GmbH</td><td>31870074</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>HN08.2</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>TC-flask 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V025</td><td></td></tr><tr><td>TC-flask 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V075</td><td></td></tr><tr><td>ethanol, 96%</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>P075.1</td><td></td></tr><tr><td>cell strainer</td><td>VWR international</td><td>734-0002</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 50 mL</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P91050</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>electroporation cuvette, 2 mm</td><td>Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K.</td><td>EKL2,25</td><td></td></tr><tr><td>hypoxanthine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9636-25G</td><td></td></tr><tr><td>azaserine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4142</td><td></td></tr><tr><td>thymidine</td><td>USB Europa GmbH</td><td>22305 1 GM</td><td></td></tr><tr><td>TC-plates 96 well</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92696</td><td></td></tr><tr><td>TC-plates 24 well</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92424</td><td></td></tr><tr><td>cryotubes, 1 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V7384-1CS</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>protein A sepharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3391-1G</td><td></td></tr><tr><td>SDS sample loading buffer, Roti-Load 1</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>unstained protein ladder</td><td>BioRad Laboratories</td><td>161-0363</td><td></td></tr><tr><td>comassie brilliant blue R-250</td><td>BioRad Laboratories</td><td>161-0406</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of murine monoclonal antibodies by hybridoma technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

Şekil 1, laboratuarda yapılan bir immünizasyon için antijene özel serum titeri bir örneğini göstermektedir. naif fare serumu ile karşılaştırıldığında 5,000,000: Bu şekilde, bağışıklık serasının A ve B 1:50 1 ila titre edilmiştir. Antijen katı faz üzerinde kaplanmış ve spesifik antikorlar POD-konjuge keçi anti-fare Ig antikoru ile tespit edilmiştir. bağışıklık kazandırılmış farelerin iki sera naif fare ile karşılaştırıldığın...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology at JoVE.com

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

Hibridoma teknolojisi ile murin monoklonal antikorlar üretilmesi

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

generation-of-murine-monoclonal-antibodies-by-hybridoma-technology

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

41.5K Görüntüleme.  University of Potsdam. An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening. 

Video: Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating histoplasmosis caused by the fungus Histoplasma capsulatum and 2) to examine the role of virulence factors as target for therapy. To generate mAbs, mice are immunized, the immune responses are assessed using a solid phase ELISA system developed in our laboratory, and the best responder mice are selected for isolation of splenocytes for fusion with hybridoma cells. C57BL/6 mice have been extensively used to study H. capsulatum pathogenesis and provide the best model for obtaining the data required. In order to assess the role of the mAbs in infection, mice are intraperitoneally administered with either mAb to H. capsulatum or isotype matched control mAb and then infected by either intravenous (i.v.), intraperitoneal (i.p.), or intranasal (i.n.) routes. In the scientific literature, efficacy of mAbs for fungal infections in mice relies on mortality as an end point, in conjunction with colony formin units (CFU) assessments at earlier time points. Survival (time to death) studies are necessary as they best represent human disease. Thus, efficacy of our intervention would not adequately be established without survival curves. This is also true for establishing efficacy of vaccine or testing of mutants for virulence. With histoplasmosis, the mice often go from being energetic to dead over several hours. The capacity of an intervention such as the administration of a mAb may initially protect an animal from disease, but the disease can relapse which would not be realized in short CFU experiments. In addition to survival and fungal burden assays, we examine the inflammatory responses to infection (histology, cellular recruitment, cytokine responses). For survival/time to death experiments, the mice are infected and monitored at least twice daily for signs of morbidity. To assess fungal burden, histopathology, and cytokine responses, the mice are euthanized at various times after infection. Animal experiments are performed according to the guidelines of the Institute for Animal Studies of the Albert Einstein College of Medicine.

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

C57BL/6 mice have been used to study Hc pathogenesis and provide the best model. We are exploring the potential benefits of humoral immunity against this fungus and generated several mAbs [to histone H2B and a heat shock protein 60kDa] that we tested for their protective efficacy after intraperitoneal administration.

Karşı Monoklonal Antikorlar Pasif Yönetim H. capsulatum Ve Diğerleri Fungal Patojenler

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Ölümsüzleştirilmiştir Sıralama B hücrelerinden Rekombinant İnsan IgG Monoklonal Antikorlarının Üretimi

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Doğal ürünler karşı monoklonal antikorların üretimi

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response without any interference such as low protein expression, enzyme inactivity, or structural changes. This makes APN an attractive candidate in the development of vaccines that selectively target the mucosal epithelium. Previous studies have shown that APN is a receptor protein for both enterotoxigenic Escherichia coli (E. coli) F4 and transmissible gastroenteritis virus. Thus, APN shows promise in the development of antibody-drug conjugates or novel vaccines based on APN-specific antibodies. In this study, we compared production of APN-specific monoclonal antibodies (mAbs) using traditional hybridoma technology and recombinant antibody expression method. We also established a stably transfected Chinese hamster ovary (CHO) cell line using pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN and an E. coli expression BL21(DE3) strain harboring the pET28a (+)-rAbs-APN vector. The results show that antibodies expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and mAbs produced using hybridomas could recognize and bind to the APN protein. This provides the basis for further elucidation of the APN receptor function for the development of therapeutics targeting different APN-specific epitopes.

The recombinant antibody protein expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and monoclonal antibodies produced using traditional hybridoma technology can recognize and bind to the porcine aminopeptidase N (APN) protein.

Domuz Bağırsak Mukozal Epitelinde Aminopeptidaz N'yi Hedef Alan Monoklonal Antikorların Üretimi

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Polyclonal antibodies are defined as a collection of antibodies directed against different antigenic determinants of an antigen or several antigens (1). While polyclonal antibodies are powerful tools for identifying biological molecules, there is one important limitation - they are unable to distinguish between antigens that share antigenic determinants. For example, when bovine serum albumin is used to immunize an animal, B cells with different surface Ig will respond to different antigenic determinants on bovine serum albumin. The result is a mixture of antibodies in the antiserum. Because bovine serum albumin shares some epitopes with human serum albumin in evolutionarily conserved regions of the protein, this anti-bovine serum albumin antiserum will also react with human serum albumin. Therefore, this antiserum will not be useful for distinguishing between bovine and human serum albumins.
Several approaches have been taken to overcome the specificity issue of polyclonal antisera. One is by absorbing the unwanted antibodies by passing the antiserum through a chromatography column of immobilized antigens (2). This method is tedious and frequently unable to completely remove the unwanted antibodies. Another approach is to isolate individual antibody-producing B cells and expand them in culture. However, like most normal untransformed cells, B cells do not survive in long-term culture.
To overcome the inability of B cells to survive in culture, one approach is to prepare a myeloma-B cell hybridoma. In 1847, Henry Bence-Jones discovered that patients with multiple myeloma, a lymphoid tumor, produced a large quantity of antibodies (3). B cells in these patients have become malignant and grow uncontrollably. Since the malignant B cells are derived from a single clone, they are identical and produce only a single type of antibody (i.e., a monoclonal antibody, or mAb). However, most of these myeloma cells produce antibodies of unknown specificities. In 1975, by fusing a myeloma cell to a B cell, Cesar Milstein and Georges Kohler succeeded in producing a hybridoma that can be cultured indefinitely in vitro and produces an unlimited number of monoclonal antibodies of known antigenic specificity (4). The rationale behind their approach is to combine the immortal properties of the myeloma cell and the antibody producing properties of the B cell. Their technique revolutionized antibody production and provides a powerful means for identification and purification of biological molecules using monoclonal antibodies.
Generally, preparing a monoclonal antibody requires several months. The general procedure includes the following steps:
<ol>
	<li>Immunization and screening of antibody titer</li>
	<li>Fusion of antibody-producing B cells and myeloma cells</li>
	<li>Selective growth of the hybridoma</li>
	<li>Screening the hybridomas for producing the desired monoclonal antibody</li>
	<li>Cloning by limiting dilution - a process whereby cells are diluted to a concentration to statistically allow for less than 1 cell to be added to the wells of a 96-well plate. Some wells will end up with 0 cells and some will have 1 cell. The wells with seeded with 1 cell will eventually grow into a monoclonal population of cells.</li>
	<li>Growth of the hybridoma and preparation of monoclonal antibody</li>
</ol>
This protocol focuses on the last step - growth of the hybridoma and preparation of the monoclonal antibody. The antibody is purified from the culture supernatant by ammonium sulfate precipitation (often referred to as salting out) - a commonly used method of removing proteins from a solution. Proteins in solution form hydrogen bonds, along with other hydrophilic interactions, with water through their exposed polar and ionic groups. When concentrations of small, highly charged ions (such as ammonium or sulfate) are added, these groups compete with the proteins for binding to water. This removes the water molecules from the protein and decreases its solubility, resulting in precipitation of the protein.

Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

Education

JoVE Science Education

İleri Biyoloji

İmmünoloji

Generating Recombinant Monoclonal Antibodies From Mammalian Cell Cultures

Source: Nogales-Gadea, G. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52830">Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015)
This video demonstrates a method of antibody generation from mammalian cells by introducing plasmid vectors with heavy and light chain genes. These vectors interact with polyethylenimine and enter the cells by forming polyplexes; later, they are translated into individual proteins and assembled into complete antibodies, which are secreted into the extracellular medium.

Memeli Hücre Kültürlerinden Rekombinant Monoklonal Antikorların Üretilmesi

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Isolation of Peripheral Blood ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Antikor Tabanlı Teknolojiler

Üretim ve Saflaştırma

A Hybridoma Technology for Producing Monoclonal Antibodies against a Metallopeptidase

Source: Xia, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62437">Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an assay to produce monoclonal antibodies against porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase, using a traditional hybridoma technology. Upon immunizing a mouse with APN, the spleen cells are harvested and fused with immortal myeloma cells to produce hybridomas. The hybridomas are then selected and proliferated using the HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) medium to produce monoclonal antibodies specific to different APN epitopes.

Bir Metallopeptidaza Karşı Monoklonal Antikorlar Üretmek için Bir Hibridoma Teknolojisi

All animal model procedures have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Animal ...

A Technique to Generate Monoclonal Antibodies from Antigen-Specific B Cells

Source: Devilder, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56508">Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.</a> J. Vis. Exp. (2018).
The video demonstrates a technique for generating monoclonal antibodies from antigen-specific B cells. Eukaryotic expression vectors encoding the heavy and light chains of antibodies, cloned from isolated antigen-specific B cells, are introduced into mammalian cells using polyplexes. Once inside the cells, these vectors undergo translation, and the resulting heavy and light chain peptides assemble into antibodies, which are subsequently secreted by the cells.

Antijene Özgü B Hücrelerinden Monoklonal Antikorlar Üretmek İçin Bir Teknik

1. Production of mAbs

	The day before the transfection, seed 15,000 Human embryonic kidney 293A (HEK 293A) cells in 200 &#181;L of Dulbecco&#39;s ...

Hybridoma Technology

Hybridoma technology is used for the large-scale production of monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies bind to only a single antigenic determinant or epitope. Such antibodies are used in research, diagnostics, and disease therapy. The hybridoma technology established in 1975 by Georges K&#246;hler and Cesar Milstein was awarded the Nobel Prize in Medicine in 1984 for revolutionizing research and therapy.
Hybridoma Selection
Commonly used fusion techniques &#8212; electroporation, polyethylene glycol (PEG) mediated fusion, and the use of fusogenic viruses &#8212; generally produce hybridomas at a very low frequency. Fusion products thus have a high ratio of self-fused B-cells and myeloma cells, or unfused cells, with a low number of hybrid cells.
The hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium is used to select hybridomas by selectively allowing their growth. The aminopterin blocks the default nucleotide synthesis in cells. However, cells can utilize hypoxanthine and thymidine from the medium to synthesize nucleotides via the salvage pathway.
Myeloma cells deficient in the HGPRT enzyme cannot synthesize nucleotides via this pathway and thus, do not grow in HAT medium. Although B-cells produce functional HGPRT enzymes, they cannot divide indefinitely. Thus, only the hybrid cells with functional HGPT from the B-cells and immortality from the myeloma line can grow on the HAT selection medium. Such a culture of hybrid cells is called a hybridoma, which can be screened for monoclonal antibody production.
Hybridoma Screening
Hybridoma cultures from the HAT selection are plated onto a 96-well plate; each well containing only one cell. Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), each cell is screened for the production of antibodies specific to the epitope of interest. Cells that test positive are then selected and grown in a larger culture vessel to establish hybridoma cell lines. These cell lines are a permanent source of unlimited monoclonal antibodies. Thus hybridoma technology is a convenient and cost-effective method for mass production of monoclonal antibodies.

Hibridoma Teknolojisi

Hybridoma technology is used for the large-scale production of monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies bind to only a single antigenic determinant or ...