Name: generation of murine monoclonal antibodies by hybridoma technology
Uploaded: 2017-01-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology at JoVE.com

The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, "Artificial immune reactions," "Camelid antibodies," and "Antibody technologies." We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.

Balb / c או עכברים NMRI (musculus Mus) מהמושבה הרבייה שלנו באוניברסיטת פוטסדאם (Potsdam, גרמניה) שימשו לייצור נוגדנים חד שבטיים. עבודת החיה נערכת על פי הנחיות לאומיות ובינלאומיות הנוגעות לעניין. המחקר אושר על ידי ברנדנבורג המשרד לאיכות הסביבה, בריאות, הגנת הצרכן (מספר אסמכתא V3-2347-A16-4-2012). 1. הכנת Immunoconjugates <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור צימוד האנטיגן על מפעיל, להשתמש בפרוטוקולים צימוד רגיל באמצעות amino-, carboxy, או sulfo-קבוצות, כגון על ידי glutaraldehyde, N - (3-dimethylaminopropyl) - N -ethylcarbodiimide (EDC), או N - [y-maleimidobutyryloxy ] אסתר succinimide (sulfo-GMBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור צימוד (למשל, עם glutaraldehyde) 13, השתמש חלבון המטרה או הפפטיד לבין הספק (ovalbumin, אלבומין בסרום שור, או hemocyanin עלוקה חור המנעול) ביחס של 1: 1. לדלל את יחסי ציבור היעדotein או פפטיד בופר פוספט (PBS) ואת החלבון המוביל 50 מ&quot;מ NaHCO 3 חיץ. להתאים את עוצמת הקול ואת הריכוז את הסכום הדרוש עבור חיסונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים שני פתרונות ולהוסיף 1.25% glutaraldehyde. מערבבים דגירה המדגם עבור 4 שעות בטמפרטורת החדר (RT). לבחירת תאי hybridoma, להפיק את אותה immunoconjugate, אבל עם חברת תעופה אחרת, על מנת למנוע את הבחירה של קלסרים מובילים נוקבים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze המדגם צימוד על ידי ביצוע דיאליזה מהר עם שרף גס מסחרי (למשל, Sephadex G25). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחורר בתחתית בקבוקון 1.5 תגובה מ&quot;ל עם מחט חלולה ומניחים אותו בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל. שים צמר זכוכית בתחתית לאיטום ולכסות אותו עם 300 מ&quot;ג של שרף גס (על גובה הכיול של 0.5 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות, לשים 1 מ&quot;ל PBS dropwise לתוך צינור 1.5 תגובה מ&quot;ל ולוודא כי צמר זכוכית עדיין איטום הניקוב. תן s השרף הגסהגם צנטריפוגות הטור ב XG 500 במשך 2 דקות. ניתן להשתמש עמודה אחת כזו dialyze 200 μL של מדגם הצימוד. עבור אמצעי אחסון גבוה יותר, להרוויח יותר עמודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את הצינור ושחררת פתרון הצימוד על השרף הגס תפח. צנטריפוגה שוב XG ב 500 במשך 2 דקות. הסר את eluent מהצינור ולהשתמש בו עבור חיסון. </li></ol></li></ol> חיסון 2. של בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שניים או שלושה 6 ל- 12 שבועות בן עכברים Balb / c לחיסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חיה אחת, להכין 150 - 200 מיקרוגרם של immunoconjugate ב 200 μL של PBS ומערבב אותו עם 100 μL של אדג&#39;ובנט Freund&#39;s המלא (CFA). מערבבים את הפתרון 3 פעמים עם מחט נמוכה ורזה (0.6 מ&quot;מ קוטר) על מזרק 1 מ&quot;ל. להזריק את הפתרון intraperitoneally לתוך העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן הזרקה מאיצה 6 שבועות לאחר מכן עם אותה הכמות של immunoconjugate, אבל בלי CFA. קח דם 7 ימים לאחר מכן (מתוך הסינוס retroorbital) ו prepaמחדש את הנסיוב על ידי דוגרי הדם במשך 3 - 4 שעות בטמפרטורת חדר (RT). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התערובת על 3,000 XG במשך 5 דקות. קח את supernatant בסרום ולהעביר אותו לתוך צינור חדש. ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס. וזורק את הכדור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את סרה באמצעות ELISA, כמתואר שלב 3. היתוך, לבחור את העכבר עם כייל בסרום הגבוה ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקראת איחוי תאים, להגביר את העכבר עם 150 - 200 מיקרוגרם של immunoconjugate ב 300 μL של PBS ללא אדג&#39;ובנט רק 4 ימים לפני ההיתוך. </li></ol> 3. ELISA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון אנטיגן עם ריכוז של 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​PBS ולהעביר 50 μL לתוך כל ELISA גם צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת למשך 2 שעות ב 37 ° C או לילה ב 4 מעלות צלזיוס בתא לח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם מי ברז. חסום את הבארות עם 80 μL של PBS / 5% נסיוב עגל בילוד (NCS) לכל טוב עבור 1 ש &#39;ב RT בתוך פרק לחעַנבָּר. כן הדילולים בסרום של 1: סדרת 5 החל 1:50. לניתוח של תרבית תאים, השתמש supernatant התרבות חי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם מי ברז. פיפטה 50 μL של המדגם לכל היטב דגירה של 1 ש &#39;ב RT בתא לח. הכן את הפתרון נוגדנים משני ביחס של 1: דילול -5,000 נוגדן עיזים אנטי עכבר IgG מצומדות כדי peroxidase חזרת (HRP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם מי ברז ולהוסיף 50 μL של פתרון נוגדנים משני לכל טוב. דגירה במשך 45 דקות ב RT בתא לח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון מצע טרי. הפוך פתרונות מניות של 0.1 M לאא 2 PO 4 ו -0.1 מי חמצן%. קח 5 חלקים לאא 2 PO מי חמצן 4, 4 חלקים, חלק 1 tetramethylbenzidine לפתרון המצע הטרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 10 פעמים עם מי ברז. פיפטה 50 μL של פתרון מצע טרי לתוך בארות דגירה במשך 5 - 10 דק &#39;באפל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את התגובה עם 50 μL 1 MH 2 SO 4 לכל טוב. באמצעות קורא צלחת, למדוד את הצפיפות האופטית ב 450 ננומטר עם אורך גל התייחסות ב 630 ננומטר. </li></ol> 4. הכנת תא תרבויות מיאלומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעתה ואילך, לבצע כל עבודה בתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני תרבות טרי לגידול תאים. מוסף 500 מ&quot;ל של RPMI1640 עם 10% נסיוב עגל עוברית (50 מ&quot;ל), 2 מ&quot;מ L- גלוטמין (5 מ&quot;ל), ו -50 מיקרומטר mercaptoethanol (5 מ&quot;ל). החליפו את גלוטמין כל 7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר בקבוקון של murine SP2 / 0 תאים במים חמים. מעבירים את הפתרון הנייד לתוך 10 מ&quot;ל של מדיום צנטריפוגות תרבות טרי במשך 10 דקות ב 200 x ז. בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של מדיום תרבות טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים בבקבוק 25 ס&quot;מ 2 דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור. הרחב את התאים לשני 75-מ 2 צלוחיות BEFהיתוך עפרות. חסוך aliquots עבור אחסון לטווח ארוך, כמתואר שלב 7. </li></ol> 5. הכנת תאים מזינים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורבן עכבר NMRI 12 שבועות בן (על פי הנחיות לאומיות ומוסדיות; למשל, על ידי שאיפת CO 2). הסר את הפרווה ולנקות את הבטן עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 5 מ&quot;ל של מדיום RPMI קר קרח לתוך הבטן, לעסות את הבטן עם פינצטה, לשאוב את ההשעיה תא מזין. מניחים את התאים בצינור 50 מ&quot;ל ריק. בצע פעולה זו שוב. 7 עד 10 מ&quot;ל של ההשעיה תא מזין צריך להישלף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן השעית תא מזין 100 מיליליטר על ידי הוספת 90 מיליליטר של מדיום תרבית תאים מלאים (RPMI 1640, 10% נסיוב עגל עוברי, גלוטמין מ&quot;מ 2, ו -50 מיקרומטר mercaptoethanol). מערבבים אותה ולהעביר 100 μL / גם לתוך 10 x צלחות תרבית תאים 96-היטב. דגירה צלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור. </li></ol> 6. איחוי תאים<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר שחוסנו על ידי נקע בצוואר הרחם או שאיפת CO 2, ולהסיר את הטחול 14. קח דם נוסף מהלב ולהכין את הנסיוב, כמתואר בשלב 2.3, כביקורת חיובית ELISA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן השעית תא טחול על ידי לחיצה על הטחול דרך מסננת תא. מלאו עד 20 מ&quot;ל עם תרבית תאים בינוניים מלא. קציר התאים ב 50 מ&quot;ל צינורות ידי צנטריפוגה (200 XG, 10 דק &#39;, ו -4 מעלות צלזיוס). בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את בקבוק תרבית תאים ו לקצור את תאי מיאלומה ידי צנטריפוגה (200 XG, 10 דק &#39;, ו -4 מעלות צלזיוס) וזורקי supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורי תא 20 מ&quot;ל של חיץ מלח מאוזנת (BSS) (125 mM NaCl, KCl 5 מ&quot;מ, 4 מ&quot;מ 2 CaCl, 2.5 מ&quot;מ MgCl 2, ו -5 מ&quot;מ טריס-HCl; pH 7.4) ו צנטריפוגות שוב. חזור על כביסת שלבי שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאמת splenocyte: יחס תא מיאלומה, לספור את התאים לאחר שלב הכביסה השני על ידי אשוחרח resuspending גלולה ב 1 מ&quot;ל של חיץ BSS. הפוך 1:10 דילול ולהעביר 10 μL אל חדר ספירת תאים. ספירת התאים לקבוע את הריכוז תא 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המספרים תא למאגר BSS כדי splenocytes שלושה חלקים ותאי מיאלומה חד חלק בנפח סופי 1 מ&quot;ל. קח 200 μL של ההשעיה תא ומערבבים אותו עם 200 μL של PEG8000 (1 גרם 4 מ&quot;ל של חיץ BSS). מעבירים את 400 μL לתוך קובט electroporation בקוטר של 2 מ&quot;מ ולהגדיר את הדופק (600 - 650 V ו -25 מילי-שניות). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הדופק, דגירה התאים ב RT במשך 3 דקות קובט. הסרת תאים ולשים אותם dropwise לתוך בקבוק Erlenmeyer עם 100 מ&quot;ל של HAT בינוני (RPMI 1640, 10% FCS, 2 מ&quot;מ גלוטמין, 50 מיקרומטר mercaptoethanol, 100 מיקרומטר hypoxanthine, 5.8 מיקרומטר azaserine, ו -16 מיקרומטר thymidine). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על היתוך 4 פעמים עד אצווה 1 מ&quot;ל הוא בילה. דגירה את הבקבוק Erlenmeyer במשך 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2באינקובטור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים את ההשעיה תא שוב עם hypoxanthine, azaserine, ו thymidine לפני ציפוי התאים על שכבת מזין. הוספת 100 μL של השעית התא לכל היטב את צלחות שכבת מזין דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (באינקובטור). הריכוז הסופי בתוך הבאר צריך להיות 100 מיקרומטר hypoxanthine, 5.8 מיקרומטר azaserine, ו -16 thymidine מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח מיקרוסקופי (גדלה: עדשה אובייקטיבית 10X, 10X עין מקשה) לצמיחה משובטת היטב בכל הצלחת לאחר 7 ימים על מנת לקבוע אם הבארות הם מונו או polyclonal. תאים חד-שבטיים הם מקבץ אחד של תאים שמקורם תא בודד אחד. תאי Polyclonal הם אשכולות מרובים של תאים היטב אחד. שנה את התקשורת המלאה לאחר 7 ימי דגירה שוב למשך 7 ימים במדיום HAT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי המדיום HAT ולטפח את התאים בינוני תרבית תאים מלאה. השתמש supernatant לבצע ELISA, כמתואר בשלב 3. תאי hybridoma חיוביים חייבים להיות מורחב ב 24 גם צלחות פי המבחנים לייצור נוגדנים ספציפיים. אם התאים הם polyclonal, דילול מוגבל צריכה להתבצע (כמתואר בשלב 8). </li></ol> 7. Cryoconservation של Hybridomas <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoconserve מונה חיובי hybridomas polyclonal עבור אחסון לטווח ארוך. קציר תאים מצלחת 24 גם עם מפגש של&gt; 60% על ידי צנטריפוגה (200 XG, 10 דק &#39;, ו -4 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 500 μL של תקשורת בתרבות מלאה תא ולהעביר אותו לתוך cryotube. הוספת 500 μL של מדיום הקפאה (RPMI 1640, 20% FCS, ו -15% dimethylsulfoxide), לערבב אותו, ולשים אותו בתוך קופסא קלקר או קופסא הקפאה מיוחדת. חנות ב -80 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. לאחר 3 ימים, cryotube ניתן להעביר חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך. </li></ol> 8. הגבלת דילול של Polyclonal Hybridomas <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Makתרבות שכבת מזין ea, כמתואר שלב 5. תאי polyclonal חיוביים קציר, כמתואר שלב 7.1. ספירת התאים, כמתואר שלב 6.5, ולהתאים את מספר הסלולרי עד 10 תאים / מ&quot;ל, עם נפח סופי של 10 מ&quot;ל עבור צלחת 96-היטב. הוספת 100 μL / גם על שכבת מזין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגירה של 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס ולנתח את הצמיחה המשובטת (גדלה: עדשה אובייקטיבית 10X, מקשת עין 10X) מיקרוסקופי. תן ELISA של supernatant התרבות, כמתואר שלב 3, ולזהות את hybridomas monoclonal המתאים תרבות המונים. </li></ol> תרבות טיהור 9. המוניים של חד-שבטיים נוגדנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את hybridomas חד שבטיים עם אותות ELISA המתאים ל -25 ס&quot;מ 2 או 75 ס&quot;מ 2 צלוחיות ולאסוף עד 500 מ&quot;ל של supernatant התרבות. בדוק את שבועי תרבות לייצור נוגדנים ספציפיים לחסוך 3 - 5 aliquots לכל hybridoma עבור אחסון לטווח ארוך, כמתואר בשלב 7. </li><li&gt; צנטריפוגה supernatant התרבות ב 4,900 XG ו -4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולסנן אותו דרך פילטר 0.45 מיקרומטר. מערבבים את supernatant עם חיץ מחייב (4 M NaCl ו -2 מ &#39;גליצין NaOH, pH 8.9) בתוך היחס 3: 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו חלבון טור על ידי שטיפה עם חיץ כביסה (לדלל למאגר מחייב 1: 3 ב DH 2 O). להעביר את supernatant משלב 9.2 על העמודה לאסוף את הזרימה דרך. Elute הנוגדן כבול עם 0.1 M ציטראט, pH 3.5 ולנטרל את ה- pH מיד עם 500 μL של טריס-HCl, 9.0 pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין את הנוגדן eluted על ידי SDS-PAGE, כתם המערבי, ELISA, ולאמת אותה עבור היישום הסופי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עמוד SDS, לקחת 3 - 5 מיקרוגרם של פתרון נוגדנים מטוהרים לכל ליין (מדגם 20-μL), להוסיף 5 μL של חיץ טעינת מדגם 4x SDS (% 8 SDS, 20% 2-mercaptoethanol, 40% גליצרין, ו 0.015 bromophenol%, מופחת), ומחממים חלליות על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. כביקורת, השתמש מדגם זהה עם א א מטוהריםntibody מאותו אלוטיפ אך סגוליות רלוונטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדגימות על ג&#39;ל 12.5% ​​SDS, מקום 5 μL של סולם חלבון בלא כתם בתוך נתיב נוסף, ולהפריד אותם על ידי אלקטרופורזה. הכתם ג&#39;ל עם Coomassie מבריק כחול ולתעד את התוצאות. פרוטוקול בסיסי SDS הוקם על ידי Laemmli בשנת 1970 15. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 7 (256), 495-497 (1975).</li><li>Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M., B&#246;ldicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+and+Selection.">Antibodies and Selection.</a> Protein Targeting Compounds. , 11-22 (2015).</li><li>Walsh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopharmaceutical+benchmarks.">Biopharmaceutical benchmarks.</a> Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).</li><li>Pauly, D., Hanack, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+avoid+pitfalls+in+antibody+use.">How to avoid pitfalls in antibody use.</a> F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).</li><li>Bradbury, A., Pl&#252;ckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility:+Standardize+antibodies+used+in+research.">Reproducibility: Standardize antibodies used in research.</a> Nature. 5 (518), 27-29 (2015).</li><li>Polakiewicz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies:+The+solution+is+validation.">Antibodies: The solution is validation.</a> Nature. 26 (518), 483 (2015).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+anarchy:+A+call+to+order.">Antibody anarchy: A call to order.</a> Nature. 26 (527), 545-551 (2015).</li><li>Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fusion+phage:+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface.">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li><li>Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mouse+myeloma+cell+line+that+has+lost+immunoglobulin+expression+but+permits+the+construction+of+antibody-secreting+hybrid+cell+lines.">A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines.</a> J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).</li><li>Shulman, M., Wilde, C. D., K&#246;hler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+better+cell+line+for+making+hybridomas+secreting+specific+antibodies.">A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies.</a> Nature. 16 (276), 269-270 (1978).</li><li>Stoicheva, N. G., Hui, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+induced+fusion+of+mammalian+cells+in+the+presence+of+polyethylene+glycol.">Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol.</a> J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).</li><li>Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+developments+in+hybridoma+technology.">Current developments in hybridoma technology.</a> Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).</li><li>Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaraldehyde:+behavior+in+aqueous+solution,+reaction+with+proteins,+and+application+to+enzyme+crosslinking.">Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking.</a> Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).</li><li>Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Surface+Immunoglobulin+II.+Isolation+and+characterization+of+immunoglobulin+from+mouse+splenic+lymphocytes.">Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes.</a> Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Browne, S. M., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+methods+for+high-producing+mammalian+cell+lines.">Selection methods for high-producing mammalian cell lines.</a> Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).</li><li>Holmes, P., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+cell+line+development+by+a+high+throughput+affinity+capture+surface+display+technique+to+select+for+high+secretors.">Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors.</a> J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).</li><li>Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+microdrop+technology+for+rapid+isolation+of+rare+and+high+producer+cells.">Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells.</a> Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).</li><li>Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzl&#246;hner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgA+antibody+production+by+intrarectal+immunization+of+mice+using+recombinant+major+capsid+protein+of+hamster+polyomavirus.">IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus.</a> Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).</li><li>Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomoleküle+freisetzende+zelle+und+deren+selektion+mittels+eines+oberflächenproteins.">Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins.</a> neweramabs GmbH. , (2014).</li></ol>

The authors Pamela Holzl&#246;hner and Katja Hanack are the co-founders of new/era/mabs GmbH, a company that offers the customized generation of monoclonal antibodies.

הדור של נוגדנים חד שבטיים ידי טכנולוגיית hybridoma דורש ניתוח epitope אינטנסיבי ומפורט, במיוחד בכל הנוגע ליישום הסופי, כאשר הנוגדן אמור לזהות את היעד. זה לזלזל לעתים קרובות על ידי משתמשים ומוביל נוגדנים עם הופעות חלשות. תהליך ההיתוך הוא תמיד אקראי, כלומר שתוצאת hybridomas הספציפי...

הטכנולוגיה hybridoma שהוצגו בפרוטוקול זה תוארה לראשונה על ידי קוהלר ומילשטיין 1 בשנת 1975, למעט כמה שיפורים טכניים, ההליך העיקרי לא השתנה באופן דרמטי במהלך 40 השנים האחרונות 2. מטרת פרוטוקול זה היא להסביר אסטרטגית חיסון מתאימה יותר, שיטה סטנדרטית ההדורה של נוגדנים חד שבטיים, ודוגמא שיטת אימות (ELISA). נוגדנים הם כלים מדהימים לתרום למגוון רחב של גישות טכנולוגיות, כגון cytometry זרימה, מיון תא מגנטי, או immunofluorescence, כמו גם אפשרויות אבחון וטיפול לניטור מחלה וטיפול 3. הזמינות המסחרית של נוגדנים חד שבטיים עבור מטרות רצויות מודגמת על ידי הנוכחות של מעל 24 מסדי נתוני אינטרנט שונים עם כמויות אינספור כמעט של נוגדנים או מוצרים הקשורים נוגדן 4. בשנת 2015,מולקולות ntibody היו חלק בדיון בינלאומי 5-7 בשל בעיות חמורות אימות נאה ואפיון של נוגדנים זמינים מסחרי. זה יכול להיות קשה ויקר למצוא נוגדנים ספציפיים לנוגדן ממוקד, ולעתים קרובות, אין להם הזיקה או הסגולי צורכת. למרות שהניב נוגדן עדיין זמן רב ודורש כוח אדם מיומן לפתח ולאמת את הנוגדן, ייצור נוגדן בנפרד אולי טוב יותר מאשר לקנות אחד. בשל העובדה כי ייצור נוגדנים הוא גוזל זמן ודורש ניסיון, שיטות חלופיות לייצור מולקולות מחייב פותחו כדי להתגבר על בעיות אלה. בשיטה החלופית הנפוצה ביותר היא ייצור רקומביננטי של נוגדנים חד-שרשרת באמצעות תצוגה הפאג. הגנים לאזור המחייב משתנה המחולצים תאים ובשילוב עם חלבון הציפוי של הפאג. ה- sשרשרת ingle מתבטאת אז על פני השטח של בקטריופאג ו הוקרנה בכמה פנורמי צעדים 8. הפקת נוגדנים חד שרשרת היא קצת יותר מהר, אבל זה גם דורש בניסויים מיומנים. החסרונות של כמה נוגדנים חד שרשרת רקומביננטי הם יציבות עניות וחוסר התאמת לאבחון במבחנה. ברוב הבדיקות דיאגנוסטי בנוסף קולטן Fc לגילוי יש צורך, אשר צריך להתווסף נוגדן חד שרשרת רקומביננטי לאחר מכן. שוב, זה זמן רבים עוד יותר מורכב מאשר טכניקת hybridoma. אבחון במבחנה, עכבר חד שבטי באורך מלא ונוגדני ארנב הוכחו להיות הבחירה הטובה ביותר. אחד הצעדים המרכזיים ביצירת נוגדנים חד שבטיים חייב להיעשות לפני העבודה במעבדה מתחילה: העיצוב של immunoconjugate. שאלות שצריכות לטפל הן: מהו הרכב הפיזי של היעד הסופי מוצר היישוםיון, ואשר מטריצות נוכחות? איזה ריכוז יהיה היעד ביישום? מהו היישום הסופי, ומה הן הדרישות כי הנוגדן חייב למלא? תמיד לקחת בחשבון שאם שבר פפטיד ליניארית משמש, זה גם צריך להיות ליניארי של epitope הסופי ביעד של בחירה; אחרת, הנוגדן לא יחייב. כמובן, ללא תלות בשיטת ההקרנה, נוגדנים יכולים להיבחר להכיר פורמטים אנטיגני שונים ביישומים שונים, אך זה חייב להיות מאומת בדיוק רב. אלו הן הסיבות מדוע פיתוח ותיקוף נוגדנים הם תהליכים כאלה שאפתנים. הבחירה של פורמט אנטיגני לחיסון הוא בסיסי לפיתוח נוגדנים וקובע את ההצלחה או הכישלון של תהליך זה. לאחר העכברים להביע כיילו נוגדנים רלוונטיים, תאי הטחול מבודדים התמזגו עם תאי מיאלומה. שורות התאים מיאלומה הנפוצות ביותר עבורפיתוח נוגדנים חד שבטיים murine הם X63-Ag 8.653 9 ו- SP2 / 0-Ag 14 10 מתוך זן עכבר Balb / c. תאי צאצאים של לימפומה של תאי B ממאירים נבחרו כי הם לא מפרישים כל חלק מהרשתות קלות או כבד משלהם. התאים יכולים להיות מותאמים יחס בין 1:10 ו 10: 1 (splenocytes לעומת תאי מיאלומה). בפרוטוקול זה, התאים הותאמו יחס של 3: 1 ו התמזגו ידי פוליאתילן גליקול (PEG) ו electrofusion, על פי Stoicheva ו הואי 11. השילוב של תאי B ותאי מיאלומה הוא תהליך אקראי. לכן, בני כלאיים של שני B לימפוציטים או שני תאי מיאלומה יכולים להיוצר, אבל אלה הכלאיים לא יוכל לשרוד במשך זמן רב בתרבות. התאים עוברים hypoxanthine, aminopterin, ו thymidine (HAT) בחירה, שבאמצעותו התמזגו רק תאי hybridoma יכולים לשרוד בשל האפשרות של שימוש במסלול דה נובו של סינתזת פירימידין. עבור הדור של monנוגדני oclonal, יש צורך להשיג קו תא שמקורם בתא אמא אחת. Monoclonality מובטחת על ידי הגבלת טכניקות דילול ואת הניתוח המיקרוסקופי של גדילת תא. את supernatants תרבות hybridoma מוקרנים על ייצור נוגדנים ספציפיים, בעיקר על ידי ELISA או cytometry זרימה, ואת קלסרים הטובים ביותר נבחרו. אחרי תרבות המונים וטיהור, מולקולת הנוגדן יכול סוף סוף להיות מאופיינת ומאומתת עבור היישום הרצוי.

<table><tbody><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(3-dimethylaminopropyl)-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-ethylcarbodiimide (EDC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39391-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-GMBS</td><td>Perbio Science Germany</td><td>22324</td><td></td></tr><tr><td>ovalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>keyhole limpet hemocyanin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8283</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 mL</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P91015</td><td></td></tr><tr><td>reaction vials, 1.5 mL</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>CNT2.1</td><td></td></tr><tr><td>hollow needle</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>glass wool</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>6574.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 coarse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GE-17-0034-02</td><td></td></tr><tr><td>Freund&amp;acute;s adjuvant, complete</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F5881-10ML</td><td></td></tr><tr><td>ELISA plates, 96 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>neonatal calf serum</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S1025</td><td></td></tr><tr><td>TipOne Tips 1,000 &amp;micro;L</td><td>Starlab</td><td>S1111-2021</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips 200 &amp;micro;L</td><td>Greiner bio-one</td><td>739291</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td><td>Dianova</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>tetramethylbenzidine</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>6350.2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>peroxide/urea</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sulphuric acid</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>4623.3</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies GmbH</td><td>31870074</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>HN08.2</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>TC-flask 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V025</td><td></td></tr><tr><td>TC-flask 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V075</td><td></td></tr><tr><td>ethanol, 96%</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>P075.1</td><td></td></tr><tr><td>cell strainer</td><td>VWR international</td><td>734-0002</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 50 mL</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P91050</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>electroporation cuvette, 2 mm</td><td>Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K.</td><td>EKL2,25</td><td></td></tr><tr><td>hypoxanthine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9636-25G</td><td></td></tr><tr><td>azaserine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4142</td><td></td></tr><tr><td>thymidine</td><td>USB Europa GmbH</td><td>22305 1 GM</td><td></td></tr><tr><td>TC-plates 96 well</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92696</td><td></td></tr><tr><td>TC-plates 24 well</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92424</td><td></td></tr><tr><td>cryotubes, 1 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V7384-1CS</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>protein A sepharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3391-1G</td><td></td></tr><tr><td>SDS sample loading buffer, Roti-Load 1</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>unstained protein ladder</td><td>BioRad Laboratories</td><td>161-0363</td><td></td></tr><tr><td>comassie brilliant blue R-250</td><td>BioRad Laboratories</td><td>161-0406</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of murine monoclonal antibodies by hybridoma technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

איור 1 מציג דוגמה של כייל בסרום אנטיגן ספציפי עבור חיסון אחד ביצע במעבדה. בנתון זה, א הסרה החיסונית ו- B היו טיטרציה מ 01:50 עד 1: 5,000,000 בהשוואת סרום של עכבר נאיבי. האנטיגן היה מצופה על השלב המוצק, ואת הנוגדנים הספציפיים התגלו עם נוגדן POD-מצומדות עז...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology at JoVE.com

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

הדור של Murine חד-שבטיים נוגדנים על ידי Hybridoma טכנולוגיה

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

generation-of-murine-monoclonal-antibodies-by-hybridoma-technology

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

41.5K Views.  University of Potsdam. An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening. 

Video: Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating histoplasmosis caused by the fungus Histoplasma capsulatum and 2) to examine the role of virulence factors as target for therapy. To generate mAbs, mice are immunized, the immune responses are assessed using a solid phase ELISA system developed in our laboratory, and the best responder mice are selected for isolation of splenocytes for fusion with hybridoma cells. C57BL/6 mice have been extensively used to study H. capsulatum pathogenesis and provide the best model for obtaining the data required. In order to assess the role of the mAbs in infection, mice are intraperitoneally administered with either mAb to H. capsulatum or isotype matched control mAb and then infected by either intravenous (i.v.), intraperitoneal (i.p.), or intranasal (i.n.) routes. In the scientific literature, efficacy of mAbs for fungal infections in mice relies on mortality as an end point, in conjunction with colony formin units (CFU) assessments at earlier time points. Survival (time to death) studies are necessary as they best represent human disease. Thus, efficacy of our intervention would not adequately be established without survival curves. This is also true for establishing efficacy of vaccine or testing of mutants for virulence. With histoplasmosis, the mice often go from being energetic to dead over several hours. The capacity of an intervention such as the administration of a mAb may initially protect an animal from disease, but the disease can relapse which would not be realized in short CFU experiments. In addition to survival and fungal burden assays, we examine the inflammatory responses to infection (histology, cellular recruitment, cytokine responses). For survival/time to death experiments, the mice are infected and monitored at least twice daily for signs of morbidity. To assess fungal burden, histopathology, and cytokine responses, the mice are euthanized at various times after infection. Animal experiments are performed according to the guidelines of the Institute for Animal Studies of the Albert Einstein College of Medicine.

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

C57BL/6 mice have been used to study Hc pathogenesis and provide the best model. We are exploring the potential benefits of humoral immunity against this fungus and generated several mAbs [to histone H2B and a heat shock protein 60kDa] that we tested for their protective efficacy after intraperitoneal administration.

מינהל פסיבי של נוגדנים חד שבטיים נגד ח capsulatum ואחרים פתוגנים פטרייתיים

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

דור של רקומביננטי אדם IgG נוגדנים חד שבטיים מתאים הממוינים B הונצחו

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

דור של נוגדנים חד-שבטיים כנגד מוצרים טבעיים

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response without any interference such as low protein expression, enzyme inactivity, or structural changes. This makes APN an attractive candidate in the development of vaccines that selectively target the mucosal epithelium. Previous studies have shown that APN is a receptor protein for both enterotoxigenic Escherichia coli (E. coli) F4 and transmissible gastroenteritis virus. Thus, APN shows promise in the development of antibody-drug conjugates or novel vaccines based on APN-specific antibodies. In this study, we compared production of APN-specific monoclonal antibodies (mAbs) using traditional hybridoma technology and recombinant antibody expression method. We also established a stably transfected Chinese hamster ovary (CHO) cell line using pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN and an E. coli expression BL21(DE3) strain harboring the pET28a (+)-rAbs-APN vector. The results show that antibodies expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and mAbs produced using hybridomas could recognize and bind to the APN protein. This provides the basis for further elucidation of the APN receptor function for the development of therapeutics targeting different APN-specific epitopes.

The recombinant antibody protein expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and monoclonal antibodies produced using traditional hybridoma technology can recognize and bind to the porcine aminopeptidase N (APN) protein.

ייצור נוגדנים חד-שבטיים המכוונים לאמינופפטידאז N באפיתל רירית המעי החזירי

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Polyclonal antibodies are defined as a collection of antibodies directed against different antigenic determinants of an antigen or several antigens (1). While polyclonal antibodies are powerful tools for identifying biological molecules, there is one important limitation - they are unable to distinguish between antigens that share antigenic determinants. For example, when bovine serum albumin is used to immunize an animal, B cells with different surface Ig will respond to different antigenic determinants on bovine serum albumin. The result is a mixture of antibodies in the antiserum. Because bovine serum albumin shares some epitopes with human serum albumin in evolutionarily conserved regions of the protein, this anti-bovine serum albumin antiserum will also react with human serum albumin. Therefore, this antiserum will not be useful for distinguishing between bovine and human serum albumins.
Several approaches have been taken to overcome the specificity issue of polyclonal antisera. One is by absorbing the unwanted antibodies by passing the antiserum through a chromatography column of immobilized antigens (2). This method is tedious and frequently unable to completely remove the unwanted antibodies. Another approach is to isolate individual antibody-producing B cells and expand them in culture. However, like most normal untransformed cells, B cells do not survive in long-term culture.
To overcome the inability of B cells to survive in culture, one approach is to prepare a myeloma-B cell hybridoma. In 1847, Henry Bence-Jones discovered that patients with multiple myeloma, a lymphoid tumor, produced a large quantity of antibodies (3). B cells in these patients have become malignant and grow uncontrollably. Since the malignant B cells are derived from a single clone, they are identical and produce only a single type of antibody (i.e., a monoclonal antibody, or mAb). However, most of these myeloma cells produce antibodies of unknown specificities. In 1975, by fusing a myeloma cell to a B cell, Cesar Milstein and Georges Kohler succeeded in producing a hybridoma that can be cultured indefinitely in vitro and produces an unlimited number of monoclonal antibodies of known antigenic specificity (4). The rationale behind their approach is to combine the immortal properties of the myeloma cell and the antibody producing properties of the B cell. Their technique revolutionized antibody production and provides a powerful means for identification and purification of biological molecules using monoclonal antibodies.
Generally, preparing a monoclonal antibody requires several months. The general procedure includes the following steps:
<ol>
	<li>Immunization and screening of antibody titer</li>
	<li>Fusion of antibody-producing B cells and myeloma cells</li>
	<li>Selective growth of the hybridoma</li>
	<li>Screening the hybridomas for producing the desired monoclonal antibody</li>
	<li>Cloning by limiting dilution - a process whereby cells are diluted to a concentration to statistically allow for less than 1 cell to be added to the wells of a 96-well plate. Some wells will end up with 0 cells and some will have 1 cell. The wells with seeded with 1 cell will eventually grow into a monoclonal population of cells.</li>
	<li>Growth of the hybridoma and preparation of monoclonal antibody</li>
</ol>
This protocol focuses on the last step - growth of the hybridoma and preparation of the monoclonal antibody. The antibody is purified from the culture supernatant by ammonium sulfate precipitation (often referred to as salting out) - a commonly used method of removing proteins from a solution. Proteins in solution form hydrogen bonds, along with other hydrophilic interactions, with water through their exposed polar and ionic groups. When concentrations of small, highly charged ions (such as ammonium or sulfate) are added, these groups compete with the proteins for binding to water. This removes the water molecules from the protein and decreases its solubility, resulting in precipitation of the protein.

Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

יצירת נוגדנים: ייצור נוגדנים חד שבטיים באמצעות היברידיות

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Immunology

Generating Recombinant Monoclonal Antibodies From Mammalian Cell Cultures

Source: Nogales-Gadea, G. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52830">Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015)
This video demonstrates a method of antibody generation from mammalian cells by introducing plasmid vectors with heavy and light chain genes. These vectors interact with polyethylenimine and enter the cells by forming polyplexes; later, they are translated into individual proteins and assembled into complete antibodies, which are secreted into the extracellular medium.

יצירת נוגדנים חד-שבטיים רקומביננטיים מתרביות תאים של יונקים

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Isolation of Peripheral Blood ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Antibody-Based Technologies

Production and Purification

A Hybridoma Technology for Producing Monoclonal Antibodies against a Metallopeptidase

Source: Xia, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62437">Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an assay to produce monoclonal antibodies against porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase, using a traditional hybridoma technology. Upon immunizing a mouse with APN, the spleen cells are harvested and fused with immortal myeloma cells to produce hybridomas. The hybridomas are then selected and proliferated using the HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) medium to produce monoclonal antibodies specific to different APN epitopes.

טכנולוגיית Hybridoma לייצור נוגדנים חד-שבטיים כנגד מטלופפטידאז

All animal model procedures have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Animal ...

A Technique to Generate Monoclonal Antibodies from Antigen-Specific B Cells

Source: Devilder, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56508">Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.</a> J. Vis. Exp. (2018).
The video demonstrates a technique for generating monoclonal antibodies from antigen-specific B cells. Eukaryotic expression vectors encoding the heavy and light chains of antibodies, cloned from isolated antigen-specific B cells, are introduced into mammalian cells using polyplexes. Once inside the cells, these vectors undergo translation, and the resulting heavy and light chain peptides assemble into antibodies, which are subsequently secreted by the cells.

טכניקה ליצירת נוגדנים חד-שבטיים מתאי B ספציפיים לאנטיגן

1. Production of mAbs

	The day before the transfection, seed 15,000 Human embryonic kidney 293A (HEK 293A) cells in 200 &#181;L of Dulbecco&#39;s ...

Hybridoma Technology

Hybridoma technology is used for the large-scale production of monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies bind to only a single antigenic determinant or epitope. Such antibodies are used in research, diagnostics, and disease therapy. The hybridoma technology established in 1975 by Georges K&#246;hler and Cesar Milstein was awarded the Nobel Prize in Medicine in 1984 for revolutionizing research and therapy.
Hybridoma Selection
Commonly used fusion techniques &#8212; electroporation, polyethylene glycol (PEG) mediated fusion, and the use of fusogenic viruses &#8212; generally produce hybridomas at a very low frequency. Fusion products thus have a high ratio of self-fused B-cells and myeloma cells, or unfused cells, with a low number of hybrid cells.
The hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium is used to select hybridomas by selectively allowing their growth. The aminopterin blocks the default nucleotide synthesis in cells. However, cells can utilize hypoxanthine and thymidine from the medium to synthesize nucleotides via the salvage pathway.
Myeloma cells deficient in the HGPRT enzyme cannot synthesize nucleotides via this pathway and thus, do not grow in HAT medium. Although B-cells produce functional HGPRT enzymes, they cannot divide indefinitely. Thus, only the hybrid cells with functional HGPT from the B-cells and immortality from the myeloma line can grow on the HAT selection medium. Such a culture of hybrid cells is called a hybridoma, which can be screened for monoclonal antibody production.
Hybridoma Screening
Hybridoma cultures from the HAT selection are plated onto a 96-well plate; each well containing only one cell. Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), each cell is screened for the production of antibodies specific to the epitope of interest. Cells that test positive are then selected and grown in a larger culture vessel to establish hybridoma cell lines. These cell lines are a permanent source of unlimited monoclonal antibodies. Thus hybridoma technology is a convenient and cost-effective method for mass production of monoclonal antibodies.

טכנולוגיית Hybridoma

Hybridoma technology is used for the large-scale production of monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies bind to only a single antigenic determinant or ...