Name: observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, bursaphelenchus xylophilus
Uploaded: 2016-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus at JoVE.com

Najie Zhu e Liqun Bai contribuíram igualmente para este trabalho. Este trabalho foi financiado pelo Fundo Especial para Pesquisa Científica Florestal na Public Welfare (201204501) ea National Science Foundation Natural da China (31170604, 31270688 e 31570638). Agradecemos ao Dr. Holighaus Gerrit e Dr. Danielle Hickford por suas sugestões úteis sobre Inglês escrito.

1. Aquisição de Virgin Adulto Nematóides <ol><li> Pinewood isolado nematóide e condições de cultura NOTA: O B. xylophilus isolar Nxy61 foi originalmente extraído de uma massoniana Pinus doente na área de Ningbo, província de Zhejiang, na China. <ol><li> Prepare Potato Dextrose Agar (PDA, consulte a Tabela de Materiais) placas para o cultivo de Botrytis cinerea. </li><li> Para inoculação, perfurar um pedaço de tapete de fungos com diâmetro de 10 mm a partir de um tapete de B. cinerea e colocá-lo no meio de uma nova placa de PDA. Cultura de B. cinerea por 5 d, a 25 ° C no escuro. </li><li> Cultura os nematóides de pinho em placa de Petri contendo preparado de B. cinerea a 25 ° C no escuro. </li></ol></li><li> Aquisição de B. xylophilus ovos <ol><li> Coloque um tubo de borracha fixada abaixo de um funil e prender o funil preparado em um rack para montar oaparelho de funil de Baermann. Colocar duas camadas de papel de filtro em vez de gaze na boca do funil. </li><li> Transferir as culturas de fungos com a configuração de funil e adicionar água até o tapete fúngico está imerso. Aguarde 2 h, e nematóides vai sair a partir da cultura fúngica, atravessar o papel de filtro, e se estabelecer na parte mais baixa do funil de Baermann. </li><li> Reunir o primeiro par de gotas de água a partir do fundo do tubo para um tubo de 15 ml e recolher os nemátodos, libertando lentamente o grampo no tubo. </li><li> Centrifugar as colecções acima a 3000 xg durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover a camada superior da água com uma pipeta e ressuspender com 1 ml de estéril duplamente destilada (dd) H 2 O. </li><li> Com uma pipeta, transferir a ressuspensão de cima para um prato de Petri de vidro novo (6 cm de diâmetro). Adicionar 3 ml de estéril dd H2O para a placa de Petri para assegurar que os nemátodos são capazes de nadar livremente. </li><li> Mantenha os nematóides nos glass uma placa de Petri durante 10 minutos a 25 ° C no escuro. Os ovos serão estabelecidas por fêmeas grávidas. Devido à sua superfície a glicoproteína, os ovos serão agarradas ao fundo da placa de Petri de vidro. </li><li> Retire a água e vermes cuidadosamente, sem perturbar os ovos. Adicionar 3 ml de estéril dd H2O ao prato de Petri de vidro imediatamente para evitar que os ovos de secar. </li><li> Repetir o passo 1.2.8 3x para remover todas as larvas e adultos, e obter os ovos puro. Adicionar um extra de 2 ml (5 mL no total) de estéril dd H2O para a placa de Petri. </li></ol></li><li> Aquisição dos juvenis quarta-fase (larvas J4) <ol><li> Chocar os ovos recolhidos durante 24 horas no escuro a 25 ° C para se obter larvas J2. </li><li> Transferir as larvas J2 com uma pipeta para um tubo de 15 ml, de centrifugação a 3000 xg durante 2 min, e remover a camada superior da água. </li><li> Ressuspender as larvas J2 com 200 mL de estéril dd H2O, e depois transferi-los paraa placa PDA contendo B. cinerea. </li><li> Cultura das larvas J2, durante 52 h a 25 ° C no escuro. Neste ponto de tempo, a maioria das larvas J2 terão desenvolvido na fase inicial de larvas J4. </li></ol></li><li> Aquisição de nematóides adultos virgens <ol><li> Prepare uma agulha para pegar nematóides pelo desenho de um capilar de vidro, depois de aquecer-lo sobre um queimador de álcool. NOTA: A ponta da agulha capilar tem normalmente de ser de 50 um de diâmetro, mais ou menos a largura do corpo de um nemátodo adulto, de modo que ele pode ser usado como uma ferramenta para retirar um único nemátodo. </li><li> Montar um funil de Baermann e extrair nematóides das culturas de fungos durante 2 h, como descrito nos passos 1.2.1 - 1.2.3. </li><li> Transfira a J4 com água em um prato limpo Petri. </li><li> Observe os nematóides sob um microscópio estereoscópico e distinguir entre machos e fêmeas por morfologia genital, como descrito por Mamiya e Kiyohara 8 (Figura 1 </strong&gt;). Pegar um nematóide do sexo desejado com a agulha capilar preparada e transferi-lo para a placa de fungos-cultura apropriado para homens ou fêmeas. NOTA: Existem mais mulheres que homens, com a porcentagem de fêmeas em 60 - 70%. A vulva da mulher é obviamente diferente da espícula macho. Em comparação com o adulto, a espícula ou vulva em J4 em estágio inicial é menor, mas eles ainda podem ser facilmente visto e distinto. O nemátodo está sempre em movimento na água, o que, por vezes, aumenta a dificuldade em distinguir machos e fêmeas. </li><li> Cultura das larvas J4 por mais 24 h a 25 ° C no escuro. NOTA: Todos os nematóides deve desenvolver em adultos, mas uma vez que são unmated, eles são considerados como adultos virgens. </li><li> Montar dois funis de Baermann e extrair os adultos virgens de as culturas de fungos durante 2 h, como descrito nos passos 1.2.1 - 1.2.3, e transferir os machos adultas virgens e fêmeas, em duas placas de Petri limpo separadas. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Observação e gravação de vídeo do comportamento de acasalamento <ol><li> Preparar várias lâminas côncavas e adicionar 200 ul de estéril dd H2O a cada um dos seus poços. </li><li> Pegar o macho preparado virgem adulto ou e feminino com uma agulha capilar e colocar apenas um nematóide na água de cada slide côncava. </li><li> Mantenha os adultos virgens no interior do poço durante 1 h para deixá-los se adaptar ao novo ambiente aquoso. </li><li> Emparelhar um macho virgem e feminino, transferindo um deles de um poço para outro usando uma pipeta. </li><li> Observar o comportamento de acasalamento da 1♀ 1♂ combinação + no slide côncava sob microscópio estereoscópico. </li><li> Para analisar a eficiência de acasalamento dos adultos virgens, calcular a sua taxa de cruzamento de sucesso (R) e compará-la com a de pares adultos selecionados aleatoriamente. Calcular R como a percentagem de repetições em que se observou a cópula em comparação com o número total de repetições estudados. </li><li&gt; Para investigar escolha de acasalamento e da concorrência intrasexual, grupo e observar nematóides virgens de duas combinações diferentes: 1♀ + 3♂ e 3♀ + 1♂. </li><li> Para a coleta de dados para análise qualitativa e quantitativa, filmar o comportamento de acasalamento usando microscopia de vídeo. Normalmente, todo o processo de acasalamento, a partir do momento em que os nemátodos são colocadas no poço do slide côncava para o momento em que eles se movem para longe após copulação, é completada dentro de 2 h. Portanto, o processo de acasalamento gravar continuamente durante pelo menos 2 h, como um replicado. Complete pelo menos 30 repetições no total para cada combinação. NOTA: Adicionar mais estéril dd H2O (normalmente 50 uL) a cada 0,5 h ao poço para compensar a evaporação durante o processo de gravação. </li></ol> 3. Recolha de Dados <ol><li> Veja todos os vídeos com cuidado sobre uma tela de computador e caracterizar as sub-comportamentos qualitativamente. </li><li> Medir o tempo de acasalamento usando thfunção e quadro-a-quadro do gravador de vídeo. subtrair manualmente o tempo a partir do ponto final. </li><li> Para a combinação 1♀ + 1♂, analisar cada gravação de vídeo e medir a duração dos seguintes eventos: <ol><li> Medir a duração de busca (ou seja, o tempo a partir de quando o macho e fêmea são introduzidos na cavidade da corrediça côncava para o momento em que se encontram e contactam entre si). </li><li> Medir o tempo de contacto de (isto é, o tempo desde o primeiro contacto com o momento em que o macho é precisamente posicionada na vulva da fêmea para a primeira cópula). </li><li> Medir a duração da cópula (isto é, o tempo a partir de quando o macho é precisamente posicionada na vulva da fêmea até que ele desliza para baixo a partir do corpo da fêmea após a ejaculação). Nota: Alguns nemátodos podem copular várias vezes em 2 h. Em tais casos, medir a duração da cópula da primeira cópula para o final do lasT uma, incluindo o tempo no meio. </li><li> Medir a duração da prolongado (isto é, o período após a cópula até o mergulho macho e fêmea de distância um do outro e estão separados por uma distância de mais do que o comprimento do corpo dos nemátodos (geralmente 1 mm)). </li></ol></li><li> Contagem da freqüência de cópula e duração de cada cópula ea duração média de todas as cópulas em 2 h para cada um dos diferentes combinações (ou seja, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ e 1♀ + 3♂). </li><li> Calcular a taxa de sucesso de acasalamento para o primeiro contato (P) para as diferentes combinações como a taxa de sucesso de acasalamento após o primeiro contato, que é realizado imediatamente e sem qualquer interrupção. Na fase de contacto, vários contatos pode ser observado antes da cópula real. <ol><li> Quando a distância entre dois indivíduos é mais do que o comprimento do corpo, considere um contato para ser terminado. Para uma réplica, ficha P como 100% quando a cópula is observado imediatamente após o primeiro contato, sem interrupção, ou 0,00%, se não foi observada a cópula ou se houve cópula, mas depois de dois ou mais contatos. NOTA: Não foram 30 repetições para cada combinação descrita aqui. </li></ol></li></ol>

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	<li>Tokushige, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursaphelenchus+sp.+in+the+wood+of+dead+pine+trees.">Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees.</a> J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).</li><li>Sun, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursaphelenchus+xylophilus+was+discovered+in+Sun+Yet-sen's+mausoleum+in+Nanjing.">Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing.</a> J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47 (1982).</li><li>Mota, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+report+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+Portugal+and+in+Europe.">First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe.</a> Nematology. 1, 727-734 (1999).</li><li>Robertson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+the+pine+wood+nematode+Bursaphelenchus+xylophlius+Steiner+&amp;+Buhrer,+1934+(Nickle,+1970)+in+Spain.">Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner &amp; Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain.</a> Nematology. 13, 755-757 (2011).</li><li>Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pine+wilt+disease:+a+threat+to+European+forestry.">Pine wilt disease: a threat to European forestry.</a> Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).</li><li>Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursaphelenchus+xylophilus:+opportunities+in+comparative+genomics+and+molecular+host-parasite+interactions.">Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions.</a> Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).</li><li>Mamiya, Y., Furukawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecundity+and+reproduction+of+Bursaphelenchus+lignicolus.">Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus.</a> Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).</li><li>Mamiya, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+Bursaphelenchus+lignicolus.+n.+sp.+(Nematoda:+Aphelenchoididae)+from+pine+wood+and+histophathology+of+nematode-infested+trees.">Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees.</a> Nematologica. 18, 120-124 (1972).</li><li>Liu, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+features+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+the+mating+process.">Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process.</a> Nematology. 16, 895-902 (2014).</li><li>Simon, J. M., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+mate+finding+cue+in+the+hermaphrodite+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).</li><li>Barr, M. M., Garcia, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+mating+behaviour.">Male mating behaviour.</a> The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).</li><li>Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+attraction+and+mating+in+Bursaphelenchus+okinawaensis+and+B.+xylophilus.">Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus.</a> J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Os testes comportamentais são um aspecto fundamental da ecologia química, neurobiologia, biologia molecular e genética. Nematóides e, em particular C. elegans, são usados extensivamente para estudos nessas áreas. O comportamento de acasalamento de C. elegans foi investigada anteriormente 10-11. No entanto, B. xylophilus é gonochoristic e diferente dos hermafroditas C. elegans, e seu processo de acoplamento tem diferentes características comportamentais 9....

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle, is one of the most destructive invasive species, causing the wilting and eventual death of pine trees. This pathogenic nematode is believed to be native to the USA, but it was transported to several countries, including China, Japan, South Korea, and Portugal. Recently, it has also been reported in Spain, killing millions of pine trees at huge economic losses and threatening forest production and ecological stability1-5.
Once a host pine tree is infected by pinewood nematodes, thousands of millions of offspring are propagated rapidly within the trunk. This causes xylem dysfunction, resulting in wilting and eventually in the death of the host tree6. However, there is currently no efficient way to control this disease. Mating behavior might play an important role in the high fecundity of this nematode7. We therefore investigated the mating behavior of B. xylophilus in the laboratory, trying to find an effective way of disturbing its mating and decreasing its fecundity. 
This protocol is intended to introduce the detailed methods of how to obtain the virgin adults of B. xylophilus and how to observe and analyze the mating behavior using a video recorder and a stereomicroscope. This protocol can also be used as a reference for behavioral studies of other nematodes.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;B. xylophilus&lt;/em&gt; isolate &lt;em&gt;Nxy61&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Extracted from &lt;em&gt;Pinus massoniana&lt;/em&gt; in Ningbo area of China</td></tr><tr><td>Grey mold strain</td><td></td><td></td><td>Obtained from Forestry Academy of China</td></tr><tr><td>Baermann funnels</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>falcon tubes</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipette</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sterile dd H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>Sterilized by high pressure of steam at 121 &amp;deg;C for 30 min.</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDA medium</td><td>Huankai Bio.</td><td>021050</td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glass capillary</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Leica</td><td>LED5000 RL</td><td></td></tr><tr><td>inverted stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>concave slides</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, bursaphelenchus xylophilus

Um método para observar e quantificar o comportamento de acasalamento do nemátodo do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, foi criada sob microscópio estereoscópico. Para melhorar a eficiência de acoplamento de B. Xylophilus e aumentar as chances de observação de acasalamento, os adultos virgens foram cultivadas e utilizadas para a investigação. Os ovos foram obtidas, mantendo os nemátodos em água e permitindo que as fêmeas a pôr ovos durante 10 min. Os juvenis de segundo estádio (J2) foram sincronizadas por incubação dos ovos durante 24 h a 25 ° C no escuro, e o início J4 foram obtidos por cultura do J2 com bolor cinzento, Botrytis cinerea, por outro 52 h. Neste ponto do tempo, a maioria dos nematóides J4 podia ser claramente distinguida como sendo do sexo masculino ou feminino com sua morfologia genital. O macho e fêmea J4 foram recolhidas e cultivadas separadamente em dois pratos de Petri diferentes durante 24 h para obter nemátodos adultos virgens. Um macho e uma fêmea virgem virgem foram emparelhados em uma gota de watER no poço de uma lâmina côncava. O comportamento de acasalamento foi filmado com um gravador de vídeo sob microscópio estereoscópico. todo o período do processo de acasalamento foi de 82,8 ± 3,91 min (média ± SE) e pode ser dividido em 4 fases distintas: pesquisa, contactando, copulando, e remanescentes. Os médios minutos de duração foram 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 e 7,2 ± 0,5, respectivamente. Onze sub-comportamentos foram descritos: cruzeiro, aproximando-se, encontrando, tocando, hooping, localizar, prender, ejacular, separar, quietude, e roaming. Curiosamente, óbvia a concorrência intra-sexual foi observada quando uma fêmea foi agrupada com 3 machos ou um macho com 3 fêmeas. Este protocolo é útil e valioso, não só na investigação do comportamento de acasalamento de B. xylophilus, mas também em atuar como referência para estudos etológicas dos outros nematóides.

A taxa de sucesso de acasalamento (R) de adultos virgem foi de 86,67%, em média, o que foi significativamente mais elevado do que o dos adultos seleccionadas aleatoriamente: 13,33 ± 4,65% (M = 1301,71, df = 1, P = 0,0001) (Figura 2). Esta descoberta sugere que é mais fácil de observar o comportamento de acasalamento de B. xylophilus com adultos virgens do que com adultos selecionados aleatoriamente. <p class="jove_content" fo:keep-toget...

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Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

Observação e quantificação do comportamento de acasalamento no nemátodo do pinheiro,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

observation-quantification-mating-behavior-pinewood-nematode

Research

JoVE Journal

Biology

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

9.4K visualizações.  Zhejiang Agricultural & Forestry University. A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

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Technique for Studying Arthropod and Microbial Communities within Tree Tissues

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms. Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear young, feed, or hide from natural enemies or harsh environmental conditions outside of the tree. Organisms that persist within the phloem habitat are difficult to observe given their location under bark. We provide a technique to preserve intact phloem and prepare it for experimentation with invertebrates and microorganisms. The apparatus is called a &#8216;phloem sandwich&#8217; and allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms. This technique has resulted in a better understanding of the feeding behaviors, life-history traits, reproduction, development, and interactions of organisms within tree phloem. The strengths of this technique include the use of inexpensive materials, variability in sandwich size, flexibility to re-open the sandwich or introduce multiple organisms through drilled holes, and the preservation and maintenance of phloem integrity. The phloem sandwich is an excellent educational tool for scientific discovery in both K-12 science courses and university research laboratories.

We provide a technique to preserve intact tree phloem and prepare it for observation. We create an apparatus called a phloem sandwich that allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms that inhabit phloem tissues.

Técnica de Estudos de Artrópodes e comunidades microbianas dentro Árvore Tecidos

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms.  Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear ...

Ambiente

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both "corpse assays" and "bite assays" on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.

Ensaiar comportamentos alimentares predadores em<em&gt; Pristionchus</em&gt; E outros nematóides

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including ...

Induction and Evaluation of Inbreeding Crosses Using the Ant, Vollenhovia Emeryi

The genetic and molecular components of the sex-determination cascade have been extensively studied in the honeybee, Apis mellifera, a hymenopteran model organism. However, little is known about the sex-determination mechanisms found in other non-model hymenopteran taxa, such as ants. Because of the complex nature of the life cycles that have evolved in hymenopteran species, it is difficult to maintain and conduct experimental crosses between these organisms in the laboratory. Here, we describe the methods for conducting inbreeding crosses and for evaluating the success of those crosses in ant Vollenhovia emeryi. Inducing inbreeding in the laboratory using V. emeryi, is relatively simple because of the unique biology of the species. Specifically, this species produces androgenetic males, and female reproductives exhibit wing polymorphism, which simplifies identification of the phenotypes in genetic crosses. In addition, evaluating the success of inbreeding is straightforward as males can be produced continuously by inbreeding crosses, while normal males only appear during a well-defined reproductive season in the field. Our protocol allow for using V. emeryi as a model to investigate the genetic and molecular basis of the sex determination system in ant species.

Induction and Evaluation of Inbreeding Crosses Using the Ant, Vollenhovia Emeryi

In this protocol, methods for conducting inbreeding crosses, and for evaluating the success of those crosses, are described for the ant Vollenhovia emeryi. These protocols are important for experiments aimed at understanding the genetic basis of sex determination systems in Hymenoptera.

Indução e avaliação de cruzes de endogamia utilizando o Ant, Vollenhovia Emeryi

The genetic and molecular components of the sex-determination cascade have been extensively studied in the honeybee, Apis mellifera, a hymenopteran model ...

Genética

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors remains poorly understood. In Drosophila melanogaster, environmental cues, such as food availability, affect mating activity offering a tractable system to investigate the mechanisms modulating sexual behavior. In D. melanogaster, environmental cues are often sensed via the chemosensory gustatory and olfactory systems. Here, we present a method to test the effect of environmental chemical cues on mating behavior. The assay consists of a small mating arena containing food medium and a mating couple. The mating frequency for each couple is continuously monitored for 24 h. Here we present the applicability of this assay to test environmental compounds from an external source through a pressurized air system as well as manipulation of the environmental components directly in the mating arena. The use of a pressurized air system is especially useful to test the effect of very volatile compounds, while manipulating components directly in the mating arena can be of value to ascertain a compound's presence. This assay can be adapted to answer questions about the influence of genetic and environmental cues on mating behavior and fecundity as well as other male and female reproductive behaviors.

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

We demonstrate an assay to analyze the environmental and genetic cues that influence mating behavior in the fruit fly Drosophila melanogaster.

Um método para testar o efeito de sugestões ambientais no comportamento de acoplamento em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

Comportamento

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Copepods of the genus Tigriopus, which are common zooplankton in rocky tide pools, show precopulatory mate-guarding behavior where a male clasps a potential mate to form a pair. While this phenomenon has attracted interest of researchers, methods for its analysis have not been well described. Here we describe procedures for: 1) individual culturing and staging of Tigriopus juveniles and adults, and 2) video-based analysis of their mate-guarding behavior. The culturing method enables experimental control of paring experience of animals as well as the ability to track their development before behavioral tests. The analysis method allows quantitative evaluation of several aspects of the mate-guarding behavior, including capturing attempts by males and swimming trajectory of mate-guarding pairs. Although these methods were originally established for ethological studies on Tigriopus, with proper modifications they can also be applied to studies of other zooplankton in different research fields, such as physiology, toxicology, and ecological genetics.

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Mate-guarding behavior plays an important role in reproduction of intertidal copepods of the genus Tigriopus. However, methods for studying this behavior have not been well described. Here we describe methods for: 1) individual culture of virgin Tigriopus animals, and 2) quantitative analysis of their mate-guarding behavior.

Cultivo individual de copépodes Tigriopus e análise quantitativa de seu comportamento companheiro-guarda

Copepods of the genus Tigriopus, which are common zooplankton in rocky tide pools, show precopulatory mate-guarding behavior where a male clasps a ...

Rapid Isolation of Wild Nematodes by Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild nematodes in their natural environments are valuable for understanding many aspects of biology, including the selective regimes in which distinctive genomic and phenotypic characters evolve, the genetic basis for complex trait variation, and the natural genetic diversity fundamental to all animal populations. This manuscript describes a simple and efficient method for extracting nematodes from their natural substrates, including rotting fruits, flowers, fungi, leaf litter, and soil. The Baermann funnel method, a classical nematology technique, selectively isolates active nematodes from their substrates. Because it recovers nearly all active worms from the sample, the Baermann funnel technique allows for the recovery of rare and slow-growing genotypes that co-occur with abundant and fast-growing genotypes, which might be missed in extraction methods that involve multiple generations of reproduction. The technique is also well suited to addressing metagenetic, population-genetic, and ecological questions. It captures the entire population in a sample simultaneously, allowing an unbiased view of the natural distribution of ages, sexes, and genotypes. The protocol allows for deployment at scale in the field, rapidly converting substrates into worm plates, and the authors have validated it through fieldwork on multiple continents.

This protocol outlines a method for efficiently extracting live nematodes from natural substrates in the field.

Isolamento Rápido de Nematoides Selvagens por Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild ...

<meta charset="utf8"></head><body>Extração e quantificação de respostas voláteis de feromônios sexuais em C. elegans

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and computations governing these signals remains an active area of research. The nematode Caenorhabditis elegans provides a powerful model for studying these processes as it produces a volatile sex pheromone. This pheromone is synthesized by virgin females or sperm-depleted hermaphrodites and serves as an attractant for males.
This protocol describes a detailed method for isolating the volatile sex pheromone from several C. elegans strains (WT strain N2, daf-22, and fog-2) and C. remanei. We also provide a protocol for quantifying the male chemotaxis response to the volatile sex pheromone. Our analysis utilizes measurements such as chemotaxis index (C.I.), arrival time (A.T.), and a trajectory plot to compare male responses under various conditions accurately. This method allows for robust comparisons between males of different genetic backgrounds or developmental stages. Furthermore, the experimental setup outlined here is adaptable to investigating other chemoattraction chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: examinando a influência volátil do feromônio sexual no comportamento masculino de C. elegans

This protocol establishes methods for extracting and quantifying responses to the volatile sex pheromone in C. elegans, providing tools to study chemical communication and navigation trajectory.

Extração de feromônios sexuais voláteis e ensaio de quimioatração em Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and ...

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, reductionist, and scalable system for in-depth investigation of motivation using the mating drive of male Drosophila&#160;melanogaster (Drosophila), the methods for which we detail here. The behavioral paradigm centers on the finding that male mating drive decreases alongside fertility over the course of repeated copulations and recovers over ~3 d. In this system, the powerful neurogenetic tools available in the fly converge with the genetic accessibility and putative wiring diagram available for sexual behavior. This convergence allows rapid isolation and interrogation of small neuronal populations with specific motivational functions. Here we detail the design and execution of the satiety assay that is used to measure and alter courtship motivation in the male fly. Using this assay, we also demonstrate that low male mating drive can be overcome by stimulating dopaminergic neurons. The satiety assay is simple, affordable, and robust to influences of genetic background. We expect the satiety assay to generate many new insights into the neurobiology of motivational states.

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

This article describes a behavioral assay that uses male mating drive in Drosophila melanogaster to study motivation. Using this method, researchers can utilize advanced fly neurogenetic techniques to uncover the genetic, molecular, and cellular mechanisms that underlie this motivation.

Observação e quantificação do comportamento de acasalamento no nemátodo do pinheiro,

Resumo

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Isolamento Rápido de Nematoides Selvagens por Baermann Funnel

Extração de feromônios sexuais voláteis e ensaio de quimioatração em Caenorhabditis elegans

Extração de feromônios sexuais voláteis e ensaio de quimioatração em Caenorhabditis elegans

Extração de feromônios sexuais voláteis e ensaio de quimioatração em Caenorhabditis elegans

Medir e alterando Acasalamento Drive em Male