The authors thank Mike Crickmore, Dragana Rogulja, and Michelle Frank for comments on the manuscript. Pavel Gorelik provided technical support for manufacturing the behavioral arenas. This work was conducted in Mike Crickmore's lab and is also supported by the Whitehall Foundation (Principal Investigator: Dragana Rogulja). S.X.Z. is a Stuart H.Q. and Victoria Quan Fellow at Harvard Medical School.

NOTA: Este protocolo descreve a preparação (Seções 1 - 3), execução (Seção 4), e análise (Seção 4) de ensaios de saciedade 2-D. Em seguida, utilizando estimulação dopaminérgica, como exemplo, a secção 5 mostra como combinar estimulação termogênico com ensaios de saciedade 2-D para induzir hipersexualidad. Secção 6 descreve 3 maneiras de verificar os resultados de ensaios de saciedade 2-D. Finalmente, a Seção 7 mostra como medir a recuperação da unidade de acasalamento em moscas macho. 1. Confecção de 8 e 32 câmaras Arenas Comportamentais NOTA: cada arena comportamental consiste em diversas camadas de folhas de plástico cortadas a laser mantidas juntas por meio de parafusos e porcas sextavadas polegar em cada um dos quatro cantos (Figura 1A). <ol><li> Fabricar as camadas de arena. Fabricar cada camada utilizando um cortador laser para cortar folhas de plástico acrílico com a forma adequada (ver Figura 1B, 1C pelo produto). NOTA: Muitos institutio pesquisans tem cortadores de laser em suas lojas de máquinas ou espaços fabricante. Se a instituição tem acesso a um cortador de laser, continue com as seguintes etapas. Se não, então siga as instruções na etapa 1.2, em vez. <ol><li> Para cada camada, abra o padrão de design no software do cortador a laser. NOTA: Os desenhos podem ser encontrados em arquivos PDF apropriadamente nomeado (por exemplo, 8-Câmara Arena - Layer 2 - Doors.pdf) em material suplementar 1. Este arquivo também contém anotações para o tipo de plástico a ser utilizado (por exemplo, 1 / 8 polegadas (ou seja, 3,175 mm) acrílico). A espessura exacta de cada camada não é crítica. O principal requisito é permitir que 0,12 polegadas (3 mm) ou mais de espaço livre vertical nas câmaras. </li><li> Ajuste as configurações de laser (energia, foco, etc.) para o tipo e espessura do plástico para ser usado. Coloque plástico na cama cortador de laser e executar o corte a laser. NOTA: Estas definições variam amplamente com base na cutte a laserModelo R e a força de seu laser. Encontrar as configurações adequadas com base na experiência do passado ou fazendo cortes de teste em sucata de plástico. As gravuras hexagonais profundas estão incluídas no projeto de recesso as cabeças dos parafusos hex. Este recurso permite que para o aperto de uma mão das porcas polegar e permite que as arenas para descansar plana no banco (sem salientes cabeças dos parafusos). No entanto, fazendo gravuras profundas é muitas vezes difícil de alcançar, e, usando um cortador a laser demorado. Este passo é opcional e pode ser ignorada sem afetar os resultados comportamentais. </li><li> Ao cortar a moldura da porta (Layer 2, Figura 1A), também usam as configurações de laser adequadas para a gravura os números de câmara incluídos no projeto (como na Figura 1B, 1C). </li></ol></li><li> Coloque uma ordem com um fabricante de corte a laser online. Carregar todos os arquivos de projeto em PDF para a arena 8 e / ou 32 câmaras e especificar o tipo de material (por exemplo, 1/8 de polegada (ou seja, 3,175 mm) clear acrílico) com base nas anotações nos arquivos. Os resultados aparecerão como nas Figuras 1B (arena de 8 câmaras) e 1C (arena de 32 câmaras). </li><li> Montar arenas usando quatro parafusos sextavados e quatro porcas polegar para alinhar e manter unidas as camadas de plástico (Figura 1A). As arenas aparece como na Figura 1D, 1E (8-câmara) e Figura 1F, 1G (32-câmara). NOTA: A parede de alimentos (Camada 4 na Figura 1A) é utilizado apenas para os ensaios de saciedade 2-D e é omitida em arenas 32-câmara, que são utilizados em ensaios de corte. </li></ol> 2. Preparação de Alimentos para 2-D Saciedade Assay Observação: Uma vez que um ensaio de saciedade 2-D estende por 4,5 h, mosca alimentar é usado na arena para fornecer nutrição e água. Este protocolo utiliza, mas não se restringe a, a farinha de milho-agar convencional mosca alimentos. <ol><li> Parcialmente montar o 2-D arena de saciedade (8 câmaras) com camadas 3-6(veja a Figura 1A para atribuições de camadas) e aperte-o com nozes polegar e parafusos sextavados. </li><li> Coloque os alimentos frescos fly em um frasco limpo, micro-ondas. Adicionar água suficiente para cobrir a superfície do fundo do frasco (Figura 2A). </li><li> comida de microondas em alta por 30 - 45 s. Verificar o progresso e mexa a cada 15 s até derreter (Figura 2B). CUIDADO! alimentos voar ferve facilmente sobre. </li><li> Usar um embotados-1000 uL ponta da pipeta (Figura 2C) para transferir lentamente ~ 1 mL derretido alimentos em cada uma das câmaras (Figura 2D). </li><li> Permitir que o alimento resolidify a 4 ° C durante ~ 10 min (Figura 2E), antes de montar completamente na arena (Figura 2F). </li><li> Use a arena concluída para experiências (ver Secção 4) ou armazenar a 4 ° C. </li><li> Armazenar o alimento restante a 4 ° C e reutilização. </li></ol> 3. Preparar Virgens fêmeas para ensaios comportamentais NOTA: 2-D ensaios de saciedade utilizar um grande número de moscas fêmeas virgens (~ 120 - 160 para uma arena comportamental cheio) que são difíceis de recolher, utilizando métodos convencionais. Esta seção descreve uma abordagem alternativa utilizando o transgene HS-HID no cromossoma Y 28, que tem sido utilizado com sucesso em ensaios de corte 25, 29. O estoque usado para gerar fêmeas virgens de olhos brancos tem o w1118 genótipo (X) / hs-HID (Y); + / +; + / + (Bloomington estoque número 24638). <ol><li> Virar voa em uma nova garrafa, uma vez 20 - 50% das pupas têm eclosed (veja a Figura 3A, por exemplo) e há bastante sexo masculino (5 - 10) para propagar as ações. </li><li> Choque térmico a garrafa original em um banho de água quente a 37 ° C durante 1 h para activar suficientemente HS-HID para matar os machos (Figura 3B). Após o choque térmico, a apenas fêmeas Eclose destes frascos e assim permanecerá virgem até oensaios. NOTA: Certifique-se de todos os lados da garrafa são uniformemente aquecido (ver Figura 3A para a linha de água). Estender esse tempo para até 2 h se 1 h não é suficiente para sacrificar todos os homens. </li><li> Isolar fêmeas coletadas por pelo menos 3 d antes de experiências para garantir que eles são velhos o suficiente para ser sexualmente receptiva 25, 29. NOTA: os machos cromossomo Y-menos ocasionalmente surgem a partir deste estoque. Estes machos têm olhos brancos e não são afetados pelo choque térmico, porque eles não contêm o transgene hs-HID. Eles não podem produzir esperma e, portanto, não pode diminuir a receptividade em mulheres de 30, 31. </li></ol> 4. A realização e marcando 2-D saciedade Ensaios NOTA: É importante para controlar a idade do macho voa como alterações de unidade de acoplamento com a idade. Este protocolo usa machos que são 3-4 d velha 25 </sup&gt;. <ol><li> Ajuste da incubadora para a temperatura desejada (por exemplo, 23 ° C durante padrão, experiências de RT) e humidade (&gt; 30%). No caso de incubadoras sem controle de umidade, deixando um copo de água na incubadora é suficiente. </li><li> Coloque um 2-D arena de ensaio de saciedade no incubador durante ~ 30 minutos para equilibrar a temperatura e para evitar a condensação nas câmaras durante o decurso da experiência. As portas rotativas deve estar na posição aberta. </li><li> Use um aspirador de fly 32 para aspirar 15 - 20 fêmeas virgens em cada câmara da arena (Figura 4). NOTA: É importante que as fêmeas e machos não são anestesiados, no mesmo dia como o ensaio. Em nossa experiência, isso pode afetar a receptividade feminina e comportamento de acasalamento dos machos. </li><li> Aspirar 1 macho em cada câmara. </li><li> Coloque a arena carregado na incubadora sob uma câmara de vídeo de consumo normal (Figura 5) e a película durante 4,5 h. </li><li> Pontuação vídeos observando quando cada macho mosca começa e termina cada (ou seja, a cópula) acasalamento. Este passo pode ser no primeiro demorado. Com a prática, pode-se marcar os vídeos com velocidade 5x ou superior. Observação: Uma vez que as moscas acasalar para ~ 20 min a ~ 23 ° C (duração mais curto a temperaturas mais elevadas) 29, pode-se percorrer os primeiros 15 minutos de cada acoplamento. </li><li> Após o login todos os momentos de acasalamento, somar o número de acasalamentos para cada mosca (ver resultados representativos). </li><li> Use o código fornecido para gerar um etograma. Ver material suplementar para o código 2, instruções e dados de exemplo. </li><li> Use CO 2 ou temperatura fria para anestesiar as moscas antes de removê-los. </li></ol> 5. Usando a manipulação termogênico para inverter Saciedade em 2-D saciedade Ensaios NOTA: Este teste de protocolo se a estimulação termogênico de uma população neuronal definido pode superar saciedade. O FLI experimentales expressam o canal de cátions sensível ao calor TRPA1 em populações definidas de neurónios (UAS-TRPA1). As etapas a seguir aplicam-se à estimulação dos neurónios dopaminérgicos (TH-Gal4), que foram mostrados para promover a unidade de acoplamento 25. Estes passos podem ser usados ​​em conjunto com os outros condutores neuronais para descobrir outras populações que promovem a unidade de acoplamento. <ol><li> Para induzir thermogenetically comportamentos de acoplamento em moscas saciados, aumente a temperatura na incubadora (por exemplo, a partir de 23 ° C a 28,5 ° C) depois de completar um 4,5 H 2-D experimento saciedade completa. </li><li> Depois da incubadora atingir a temperatura desejada, continue a estimulação de calor e marcar os acasalamentos (ie. Cópulas) dos machos para 1 h (ver resultados representativos). NOTA: A temperatura e a duração da estimulação pode variar dependendo do genótipo por isso, é necessário solucionar as condições óptimas que impedem a sobre-estimulação dos neurónios, enquanto continua produzindo um Robufenótipo st. </li></ol> 6. Usando Courtship e locomoção para Verifique Saciedade Nota: Esta secção descreve métodos de 3 opcionais que podem ser utilizados para verificar os resultados de ensaios de saciedade 2-D. Eles não são necessários para cada ensaio. <ol><li> Use ensaios de corte para verificar a saciedade. <ol><li> Aspirar um macho e uma fêmea virgem em cada uma das câmaras 32 numa arena de corte. </li><li> Filmar as moscas para ~ 20 min, utilizando uma câmara de vídeo padrão. </li><li> Pontuação do índice de namoro (CI) para quantificar o namoro 25; esta é a fração de tempo gasto na execução de comportamento de corte (cantando, seguindo, etc.) e acasalamento (ou seja, a cópula) ao longo de uma janela de 5 min. Esta janela começa a partir da primeira instância do comportamento de corte. Se uma mosca macho não iniciar corte nos primeiros 15 min, a sua IC é 0. moscas Naive WT deve mostrar um CI superior a 0,9, ao passo que uma mosca totalmente saciado deve ter um IC below 0,2. Outras medidas de corte também pode ser considerado 23, 33. </li></ol></li><li> Marcando o namoro em ensaios de saciedade 2-D <ol><li> Conseguir a quantidade de tempo que uma mosca macho passa cortejando, ao longo de um período de tempo de um ensaio de saciedade 2-D (por exemplo, o primeiro h). O namoro é definido como o macho de executar qualquer etapa do ritual (cantando, seguindo, etc.). Ao contrário no ponto 6.1.3, este passo não inclui o tempo o macho passa o acasalamento. </li><li> Dividir o tempo de corte acima pelo tempo total do macho não foi acasalamento (ou seja, não copular) no mesmo período de tempo. Por exemplo, se um macho fazer cortes durante 15 min e companheiros durante 20 minutos ao longo da primeira hora, a proporção é de 15 min / (60 min - 20 min) = 0,375. A relação é mostrada como &quot;Fração de nonmating tempo no namoro&quot; em resultados representativos. </li></ol></li><li> Usando o ensaio de locomoção para avaliar exaustão <ol><li> Parcialmente montar o 32-Arena câmara com todas as peças, mas a folha de contraste. </li><li> Aspirar uma mosca macho (sem moscas fêmeas) em cada uma das câmaras 32 numa arena de corte. </li><li> Filmar as moscas para ~ 10 min, utilizando uma câmara de vídeo padrão. </li><li> Acompanhe as moscas com o plugin MTrack2 em ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html). </li></ol></li></ol> 7. Recuperando Acasalamento unidade depois de 2-D Saciedade Assay <ol><li> Realizar um ensaio de saciedade 2-D, tal como descrito na secção 4, mas aspirar o moscas macho no final do ensaio. </li><li> Isolar as moscas macho a 23 ° C durante o número pretendido de dias. </li><li> Realizar um ensaio de saciedade 2-D com os machos recuperados e marcar seus cruzamentos (ou seja, cópulas) por apenas 1 h (ver resultados representativos). </li></ol>

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	<li>Sturtevant, A. H., Bridges, C. B., Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+relations+of+genes.">The spatial relations of genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 5 (5), 168-173 (1919).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+Approaches+to+Biological+Rhythms+in+Drosophila.">Systems Approaches to Biological Rhythms in Drosophila.</a> Methods in Enzymology. 393, 61-185 (2005).</li><li>Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+neuronal+morphogenesis.">Rho GTPases in neuronal morphogenesis.</a> Nature reviews. Neuroscience. 1 (3), 173-180 (2000).</li><li>Schmucker, D., Clemens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dscam+Is+an+Axon+Guidance+Receptor+Exhibiting+Extraordinary+Molecular+Diversity.">Drosophila Dscam Is an Axon Guidance Receptor Exhibiting Extraordinary Molecular Diversity.</a> Cell. 101 (6), 671-684 (2000).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLH+proteins,+fly+neurogenesis,+and+vertebrate+myogenesis.">HLH proteins, fly neurogenesis, and vertebrate myogenesis.</a> Cell. 75 (5), 827-830 (1993).</li><li>Stockinger, P., Kvitsiani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuitry+that+governs+Drosophila+male+courtship+behavior.">Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior.</a> Cell. 121 (5), 795-807 (2005).</li><li>Yu, J. Y., Kanai, M. I., Demir, E., Jefferis, G. S. X. E., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Organization+of+the+Neural+Circuit+that+Drives+Drosophila+Courtship+Behavior.">Cellular Organization of the Neural Circuit that Drives Drosophila Courtship Behavior.</a> Current biology. 20 (18), 1602-1614 (2010).</li><li>Zhou, C., Pan, Y., Robinett, C. C., Meissner, G. W., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Brain+Neurons+Expressing+doublesex+Regulate+Female+Receptivity+in+Drosophila.">Central Brain Neurons Expressing doublesex Regulate Female Receptivity in Drosophila.</a> Neuron. 83 (1), 149-163 (2014).</li><li>Rideout, E. J., Dornan, A. J., Neville, M. C., Eadie, S., Goodwin, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+sexual+differentiation+and+behavior+by+the+doublesex+gene+in+Drosophila+melanogaster.">Control of sexual differentiation and behavior by the doublesex gene in Drosophila melanogaster.</a> Nature neuroscience. 13 (4), 458-466 (2010).</li><li>Manoli, D. S., Foss, M., Villella, A., Taylor, B. J., Hall, J. C., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-specific+fruitless+specifies+the+neural+substrates+of+Drosophila+courtship+behaviour.">Male-specific fruitless specifies the neural substrates of Drosophila courtship behaviour.</a> Nature. 436 (7049), 395-400 (2005).</li><li>Kimura, K. I., Ote, M., Tazawa, T., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruitless+specifies+sexually+dimorphic+neural+circuitry+in+the+Drosophila+brain.">Fruitless specifies sexually dimorphic neural circuitry in the Drosophila brain.</a> Nature. 438 (7065), 229-233 (2005).</li><li>Cachero, S., Ostrovsky, A. D., Yu, J. Y., Dickson, B. J., Jefferis, G. S. X. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+the+fly+brain.">Sexual dimorphism in the fly brain.</a> Current biology. 20 (18), 1589-1601 (2010).</li><li>Clowney, E. J., Iguchi, S., Bussell, J. J., Scheer, E., Ruta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+Chemosensory+Circuits+Controlling+Male+Courtship+in+Drosophila.">Multimodal Chemosensory Circuits Controlling Male Courtship in Drosophila.</a> Neuron. 87 (5), 1036-1049 (2015).</li><li>Kallman, B. R., Kim, H., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+and+inhibition+onto+central+courtship+neurons+biases+Drosophila+mate+choice.">Excitation and inhibition onto central courtship neurons biases Drosophila mate choice.</a> eLife. 4, e11188 (2015).</li><li>von Philipsborn, A. C., Liu, T., Yu, J. Y., Masser, C., Bidaye, S. S., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+control+of+Drosophila+courtship+song.">Neuronal control of Drosophila courtship song.</a> Neuron. 69 (3), 509-522 (2011).</li><li>Zhou, C., Franconville, R., Vaughan, A. G., Robinett, C. C., Jayaraman, V., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+neural+circuitry+mediating+courtship+song+perception+in+male+Drosophila.">Central neural circuitry mediating courtship song perception in male Drosophila.</a> eLife. 4, e08477 (2015).</li><li>Kohatsu, S., Koganezawa, M., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+contact+activates+male-specific+interneurons+that+trigger+stereotypic+courtship+behavior+in+Drosophila.">Female contact activates male-specific interneurons that trigger stereotypic courtship behavior in Drosophila.</a> Neuron. 69 (3), 498-508 (2011).</li><li>Kohatsu, S., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visually+induced+initiation+of+Drosophila+innate+courtship-like+following+pursuit+is+mediated+by+central+excitatory+state.">Visually induced initiation of Drosophila innate courtship-like following pursuit is mediated by central excitatory state.</a> Nature Communications. 6, 6457 (2015).</li><li>Fan, P., Manoli, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+neural+mechanisms+that+inhibit+Drosophila+from+mating+with+other+species.">Genetic and neural mechanisms that inhibit Drosophila from mating with other species.</a> Cell. 154 (1), 89-102 (2013).</li><li>Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+class+of+olfactory+neurons+mediates+behavioural+responses+to+a+Drosophila+sex+pheromone.">A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone.</a> Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).</li><li>Ejima, A., Smith, B. P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalization+of+Courtship+Learning+in+Drosophila+Is+Mediated+by+cis-Vaccenyl+Acetate.">Generalization of Courtship Learning in Drosophila Is Mediated by cis-Vaccenyl Acetate.</a> Current Biology. 17, 599-605 (2007).</li><li>Keleman, K., Vrontou, E., Kr&#252;ttner, S., Yu, J. Y., Kurtovic-Kozaric, A., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neurons+modulate+pheromone+responses+in+Drosophila+courtship+learning.">Dopamine neurons modulate pheromone responses in Drosophila courtship learning.</a> Nature. 489 (7414), 145-149 (2012).</li><li>Pan, Y., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Identification+and+Separation+of+Innate+and+Experience-Dependent+Courtship+Behaviors+in+Drosophila.">Genetic Identification and Separation of Innate and Experience-Dependent Courtship Behaviors in Drosophila.</a> Cell. 156 (1-2), 236-248 (2014).</li><li>Zhang, S. X., Rogulja, D., Crickmore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Circuitry+Underlying+Mating+Drive.">Dopaminergic Circuitry Underlying Mating Drive.</a> Neuron. 91 (1), 168-181 (2016).</li><li>Bowers, M. B., Van Woert, M., Davis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+behavior+during+L-dopa+treatment+for+Parkinsonism.">Sexual behavior during L-dopa treatment for Parkinsonism.</a> The American journal of psychiatry. 127 (12), 1691-1693 (1971).</li><li>Sacks, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Awakenings. , (1999).</li><li>Dietzl, G., Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).</li><li>Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+dopaminergic+and+GABAergic+neurons+control+the+duration+and+persistence+of+copulation+in+Drosophila.">Opposing dopaminergic and GABAergic neurons control the duration and persistence of copulation in Drosophila.</a> Cell. 155 (4), 881-893 (2013).</li><li>Peng, J., Chen, S., Busser, S., Liu, H., Honegger, T., Kubli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradual+Release+of+Sperm+Bound+Sex-Peptide+Controls+Female+Postmating+Behavior+in+Drosophila.">Gradual Release of Sperm Bound Sex-Peptide Controls Female Postmating Behavior in Drosophila.</a> Current biology. 15 (3), 207-213 (2005).</li><li>Yapici, N., Kim, Y. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor+that+mediates+the+post-mating+switch+in+Drosophila+reproductive+behaviour.">A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour.</a> Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).</li><li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Sensillum+Recordings+in+the+Insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae.">Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> Journal of Visualized Experiments. 36 (36), 1-5 (2010).</li><li>Cook, R., Cook, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Attractiveness+to+males+of+female+Drosophila+melanogaster:+effects+of+mating,+age+and+diet.">The Attractiveness to males of female Drosophila melanogaster: effects of mating, age and diet.</a> Animal behaviour. 23, 521-526 (1975).</li><li>Toates, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Motivational Systems (Problems in the Behavioural Sciences). , (1986).</li><li>Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mating+of+a+fly.">The mating of a fly.</a> Science. 264 (5166), 1702-1714 (1994).</li><li>Simpson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+manipulating+neural+circuits+in+the+fly+brain.">Mapping and manipulating neural circuits in the fly brain.</a> Advances in genetics. 65 (9), 79-143 (2009).</li><li>Venken, K. J. T., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Manipulation+of+Genes+and+Cells+in+the+Nervous+System+of+the+Fruit.">Genetic Manipulation of Genes and Cells in the Nervous System of the Fruit.</a> Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).</li><li>Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Bellen, H. J., Levis, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BDGP+gene+disruption+project:+single+transposon+insertions+associated+with+40%+of+Drosophila+genes.">The BDGP gene disruption project: single transposon insertions associated with 40% of Drosophila genes.</a> Genetics. 167 (2), 761-781 (2004).</li><li>Spradling, A. C., Stern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Berkeley+Drosophila+Genome+Project+gene+disruption+project:+Single+P-element+insertions+mutating+25%+of+vital+Drosophila+genes.">The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes.</a> Genetics. 153 (1), 135-177 (1999).</li><li>Parks, A. L., Cook, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+generation+of+high-resolution+deletion+coverage+of+the+Drosophila+melanogaster+genome.">Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome.</a> Nature genetics. 36 (3), 288-292 (2004).</li><li>Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+resources+for+Drosophila:+the+expanding+universe.">Research resources for Drosophila: the expanding universe.</a> Nature reviews. Genetics. 6 (3), 179-193 (2005).</li><li>Ni, J. Q., Liu, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+resource+of+transgenic+RNAi+lines+for+neurogenetics.">A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics.</a> Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).</li><li>Ni, J. Q., Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+shRNA+resource+for+transgenic+RNAi+in+Drosophila.">A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila.</a> Nature. 8 (5), 405-407 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Estados motivacionais pode ser saciado, mantidos e recuperados 34. Nós apresentamos um ensaio de saciedade 2-D que rapidamente e de forma robusta mede todos esses aspectos do acasalamento unidade na mosca. Este ensaio abre-se a possibilidade de utilizar mosca avançada manipulações genéticas para estudar os componentes moleculares e um circuito de comportamento motivado. O ensaio de saciedade confia na capacidade do homem para o tribunal com sucesso e copular, e para terminar cópulas no momento apropriado. Embora moscas tribunal hipossexuais menos, moscas baixa de corte não são necessariamente hipossexuais; eles podem, por exemplo, têm dificuldade em reconhecer ou rastrear as fêmeas 35. Por esse motivo, o ensaio de saciedade é mais adequado para hipersexualidad teste, um fenótipo que não pode ser observada de forma fiável em um ensaio padrão de corte, porque sem tratamento prévio com os machos de tipo selvagem mostram os índices de corte se aproximam 1. Hipersexualidade no ensaio SH saciedadeould ser considerado em relação à idade do sexo masculino em nossa experiência, os homens mais velhos tendem a acasalar um pouco mais frequentemente do que os 3 dias de idade machos usados ​​aqui. Utilizou-se estimulação de neurónios dopaminérgicos termogênico para exemplificar as manipulações neurogenéticos que podem ser usados ​​neste sistema para investigar os componentes subjacentes motivação. Além disso, os pesquisadores também possível utilizar estimulação termogênico ao longo de um ensaio de saciedade 2-D e olhar para o sexo masculino hipersexuais que são mais lentos para atingir a saciedade. Claro, ensaios de saciedade também podem ser combinados com ferramentas de silenciamento neuronais 36, 37, 38, optogenética mutações genéticas 39, 40, 41, RNAi knockdown 28, 42, 43, 44, etc. </em&gt; Esses recursos tornam possível um interrogatório exaustivo de motivação na mosca que está atualmente inatingível em outros sistemas. O ensaio de saciedade é acessível e escalável. Cada arena pode ser fabricado para o valor de materiais ~ 10 dólares norte-americanos &quot;(mais os custos de corte a laser, se houver) e ocupa menos espaço do que um livro de bolso. Marcando os vídeos também é uma tarefa relativamente simples. Um pesquisador treinado pode marcar um 4,5 horas de vídeo com 8 do sexo masculino voa em ~ 1,5 h. Para mais rastreio de alto rendimento, pode-se marcar apenas o último 2 h, quando as moscas normais apresentam níveis muito baixos de unidade de acoplamento. Alternativamente, pode-se verificar no local os ensaios a cada 30 minutos, pois isso irá capturar a maioria dos ~ 20 acasalamentos mínimo de duração. Esperamos que este sistema será amplamente adaptado e irá contribuir para o surgimento de Drosophila como um sistema poderoso para desvendar os segredos da motivação.

Trabalho em Drosophila tem proporcionado uma visão profunda e pioneira em muitos fenómenos biológicos, incluindo a natureza do gene 1, os princípios do desenvolvimento embrionário 2, ritmos circadianos 3, bem como o desenvolvimento e a fiação do sistema nervoso 4, 5, 6. A motivação permanece bastante menos conhecidas do que estes fenómenos, talvez por causa das limitações dos sistemas que foram estudados até agora. A motivação da mosca é estudado principalmente no contexto de fome, que apresenta diversos desafios devido a sua ingestão de alimentos muito pequeno por ataque de alimentação e impede que exoesqueleto sinais evidentes de deposição de gordura. Por conseguinte, existe uma necessidade de expandir os sistemas utilizados para estudar a motivação em tempo real. Nós descrevemos um quadro comportamental para o estudo da unidade de acasalamento emDrosophila. Este sistema tira vantagem das ferramentas neurogenéticos em tempo real, bem como a acessibilidade 7, 8, 9, 10, 11, 12 e o putativo conectoma de seus circuitos dimorfismo sexual 8, 13. Além disso, grande parte da inata 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 e aprendeu 22, 23, 24 circuito sensório-motor namoro controle foi elaborado em detalhes, proporcionando uma rara oportunidadepara localizar o nó de circuito exato em que a motivação colide. Recentemente, relatou que, em tempo real, como nos seres humanos, os níveis de dopamina são centrais para a unidade de acoplamento 25, 26, 27. Ganhamos o acesso genética para o nível do circuito molecular-e detalhada e recebimento de neurônios na mosca, facilitando produtoras de dopamina relevantes análises deste fenómeno conservada utilizando os ensaios aqui descrita 25. Nós adicionar aos ensaios comportamentais em Zhang et ai. 25 uma nova arena comportamental plana que permite pontuação de vídeo, que chamamos de um ensaio de saciedade 2-dimensional (2-D), uma importante melhoria em relação aos métodos anteriores. Consequentemente, o novo ensaio é mais escalável e quantificável e, portanto, mais adequado para telas genéticas de genes e de neurônios envolvidas na motivação. Usamos este novo ensaio, juntamente com ensaios de namoro e neurogemanipulações magnética, para demonstrar como medir e alterar unidade de acasalamento na mosca.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1195">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1/16 inch clear acrylic</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">8589K12</td>
			<td style="width:743px;">Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/8 inch clear acrylic</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td>8589K42</td>
			<td>Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3/16 inch clear acrylic</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td>8560K219</td>
			<td>Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/32 inch black delrin</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td>8575K132</td>
			<td>Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hex screws, 1 inch long (50x)</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td>92314A115&#160;</td>
			<td>Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thumb nuts (25x)</td>
			<td style="width:119px;">McMaster-Carr</td>
			<td>92741A100</td>
			<td>Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Camcorder</td>
			<td style="width:119px;">Canon</td>
			<td>Vixia HF R700</td>
			<td>Can be replaced by any consumer comcorder.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring and altering mating drive in male drosophila melanogaster

Apesar de décadas de investigação, as bases neuronais e moleculares de estados motivacionais permanecem misteriosas. Recentemente, desenvolvemos um romance, reducionista e sistema escalável para investigação aprofundada de motivação usando a unidade de acasalamento dos machos Drosophila melanogaster (Drosophila), os métodos para as quais detalhes aqui. O paradigma comportamental centra-se na constatação de que a unidade de acasalamento dos machos diminui ao lado de fertilidade ao longo de cópulas repetidas e recupera mais ~ 3 d. Neste sistema, as poderosas ferramentas neurogenéticos disponíveis na mosca convergir com a acessibilidade genética e esquema de ligação putativo disponíveis para o comportamento sexual. Esta convergência permite o isolamento rápido e interrogatório de pequenas populações neuronais com funções motivacionais específicos. Aqui nós detalhe a concepção e execução do ensaio saciedade que é usado para medir e alterar a motivação corte na mosca masculino. usando esteensaio, que também demonstram que a baixa unidade de acasalamento dos machos pode ser superado através da estimulação neurónios dopaminérgicos. O ensaio de saciedade é simples, acessível e robusto às influências de fundo genético. Esperamos que o ensaio de saciedade para gerar muitos novos insights sobre a neurobiologia de estados motivacionais.

Para caracterizar unidade de acoplamento de Drosophila, de 3 dias de idade, Canton WT-S machos foram testados num ensaio de saciedade 2-D. Durante o curso do ensaio (4,5 h), machos acasalam uma média de 4,8 ± 0,3 (média ± erro padrão da média, SEM) vezes. Acasalamentos iniciar principalmente nas primeiras 2 h (78%) (Figura 6A, 6B) e tornam-se menos frequentes como o ensaio avança (Figura 6A, 6B). Esta redução não é devido à falta de parceiros de acasalamento (74% do sexo feminino permanecem unmated ao longo do ensaio) ou fadiga física (Figura 6F). Pelo contrário, este efeito é provavelmente explicada por uma diminuição em corte do macho durante o ensaio, a partir de 42,6 ± 8,0% (média ± SEM) (1 r h) a 2.0 ± 0.7% (média ± SEM) (última hora) de tempo nonmating (Figura 6C). Este declínio no namoro também é visto quando os machos são testados em ensaios de namoro com novas fêmeas (Figura 6D, 6E) </strong&gt;, e recupera depois os machos foram isolados a partir de fêmeas durante 3 d (Figura 6G, 6H). Estes resultados mostram que a unidade de acoplamento mantido internamente em moscas macho pode ser saciado em um ensaio de saciedade 2-D e podem recuperar com o tempo. O ensaio de saciedade 2-D também pode ser facilmente combinado com as manipulações neurais de Drosophila. Nós informou recentemente que a estimulação termogênico dos neurónios dopaminérgicos inverte unidade de acasalamento no sexo masculino saciado voa 25. Utilizando ensaios de saciedade 2-D, descobrimos que a estimulação dopaminérgica (TH&gt; TRPA1, 28,5 ° C), no final do ensaio de saciedade aumentada tanto corte (Figura 7A, 7C, vermelho) e a cópula (Figura 7A, 7B, vermelho). Os efeitos de reversão não são observados com genótipos de controlo parental (Figura 7A - 7C, preto e cinza). Todos estes resultados são consistentes com o estudo recente25 e sugerem que o ensaio de saciedade 2-D, juntamente com os ensaios de corte auxiliares (e locomoção), pode ser utilizado para dissecar os componentes moleculares e neuronais da unidade de acoplamento. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55291/55291fig1.jpg" /> Figura 1. concepção e montagem de Arenas comportamentais. Uma arena 8-câmara (utilizadas para ensaios de saciedade 2-D) consiste em 6 camadas unidas por porcas e parafusos sextavados polegar (A). Uma arena 32-câmara (utilizado para os ensaios de corte) é fabricado de forma semelhante, mas sem a parede a comida (camada 4). As partes de arena são cortadas com um cortador a laser e as camadas são numerados como (B) para 8-câmara e (C) para 32 câmaras. As arenas de 8 câmaras montadas são mostrados em (D) (vista frontal) e (E) (vista lateral com camadas numeradas). As arenas de 32 câmaras montadas montados de um modo semelhante (f,<html> G), mas Camada 4 (parede de alimentos) é omitido (G) uma vez que nenhum alimento mosca é na arena para ensaios de corte. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55291/55291fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55291/55291fig2.jpg" /> Figura 2. Preparação de 2-D saciedade Os ensaios com os alimentos. Comida normal Drosophila é colocado em um frasco de micro-ondas com água (A). A comida é microondas até derreter (B). Uma ponta de pipeta embotada (C, seta) é usado para transferir alimentos de câmaras de uma arena comportamental parcialmente montada (D). A comida é re-solidificado a 4 ° C (E) antes da arena comportamental é completamente montada (F).pg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55291/55291fig3.jpg" /> Figura 3: Gerando Virgens fêmeas da w1118 (X) / hs-HID (Y) Stock. Garrafas de voar deve ser de calor chocado quando 50-80% das pupas são uneclosed como indicado pela sua opacidade (A). A imagem ampliada mostra exemplos de uneclosed (parte superior) e eclosed (parte inferior) pupas (A). Os frascos são carregados e submersa em 37 ° C banho de água quente durante 1 h com o nível de água um pouco acima da parte inferior das rolhas de garrafa para assegurar uniformidade de aquecimento (B). Veja a seta preta no (A) para a linha de água. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55291/55291fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt = &quot;Figura 4&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55291 / 55291fig4.jpg&quot; /&gt; Figura 4: Carregamento voa em uma Arena Comportamental. Aspirar cuidadosamente e mantenha 15 - 20 fêmeas na aspirador (A). A ponta da pipeta é utilizado para abrir a porta rotativa (B), e as moscas suavemente lançado para dentro da câmara (C). Use o aspirador para fechar a porta rotativa (D). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55291/55291fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55291/55291fig5.jpg" /> Figura 5: tocar e gravar a 2-D Saciedade de Ensaio. (A) uma câmara de vídeo padrão (a) é utilizado para registar o ensaio num incubador ajustado para a temperatura desejada. A incubadora contém um frasco de água (b) e um detector de humidade (C) para assegurar anível de umidade adequada (&gt; 30%). O ensaio de saciedade 2-D preparado é filmado sob a câmara de vídeo (B). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55291/55291fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55291/55291fig6.jpg" /> Figura 6: Saciação e Recuperação de Fy Acasalamento Drive. Num ensaio de saciedade 2-D, moscas macho mate frequentemente durante as primeiras 2 horas do teste (A, B), mas diminuir o seu namoro (C) e acasalamentos (B) como o ensaio avança. A diminuição progressiva no comportamento de corte é mantida quando os machos são transferidos para um ensaio de corte com fêmeas novas depois de completar um ensaio de saciedade 2-D de 0 h, 1 h, or ou 4,5 h (D, E). As setas vermelhas apontam para os machos exibem namoro e acasalamento comportamentos, enquanto laranja arlinhas apontar para não-acasalamento, as moscas não-namoro (A, D). O declínio no comportamento sexual não é um resultado da exaustão física, como machos mostram níveis equivalentes de actividade locomotora antes e depois do ensaio de saciedade 2-D (F). Os machos recuperar gradualmente seu acasalamento (G) e os níveis de corte (H) mais de 3 d do isolamento das fêmeas. Nesta figura, *** p &lt;0,001, ** p &lt;0,01, NS não significativo para o t-teste (C, F) e ANOVA de uma via com o pós-teste de Tukey (E, G, H). N = 15-16 para cada condição para todas as experiências. As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55291/55291fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/55291/55291fig7.jpg" /> Figura 7: termogênico Saciedade<html> Reversão em Male moscas. Como no ensaio de saciedade 2-D padrão, machos mostram uma diminuição nos acasalamentos durante o decurso da experiência, mas a estimulação termogênico de neurónios dopaminérgicos (TH&gt; TRPA1, vermelho), mas não em parental-controlo genótipos (preto e cinzento), repõe acasalamento unidade em homens saciados (a). Sem acasalamentos são marcados quando o eixo X é quebrado em (A). Esta inversão da unidade de acoplamento pode ser quantificada utilizando quer os números de acoplamento (B) ou corte (C). Números do eixo X em (B) e (C) referem-se ao tempo em (A). Cor de fundo laranja indica estimulação termogênico (A - C). Nesta figura, *** p &lt;0,001, não NS significativo para interações entre genótipo e da temperatura em two-way ANOVA com Bonferroni pós-teste (B, C). N = 8 para cada genótipo (B, C). As barras de erro representam SEM..jove.com / files / ftp_upload / 55291 / 55291fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Material suplementar 1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55291/Supplemental_Material_1.zip" target="_blank">Por favor, clique aqui para fazer o download deste arquivo.</a> Material suplementar 2. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55291/Supplemental_Material_2.zip" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.</a>

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Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Este artigo descreve um ensaio comportamental que utiliza a unidade de acasalamento dos machos em Drosophila melanogaste r para estudar motivação. Usando este método, os pesquisadores podem utilizar técnicas neurogenéticos mosca avançada para descobrir os mecanismos genéticos, moleculares e celulares que fundamentam essa motivação.

Medir e alterando Acasalamento Drive em Male<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, ...

measuring-and-altering-mating-drive-in-male-drosophila-melanogaster

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

11.0K visualizações.  Boston Children’s Hospital.  Este artigo descreve um ensaio comportamental que utiliza a unidade de acasalamento dos machos em Drosophila melanogaste r para estudar motivação. Usando este método, os pesquisadores podem utilizar técnicas neurogenéticos mosca avançada para descobrir os mecanismos genéticos, moleculares e celulares que fundamentam essa motivação. 

Vídeo: Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Neurociência

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenética estimulação do comportamento de fuga em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinação da atividade locomotora espontânea em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Ensaio simples para Quantificação de Prevenção Social<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy and cheap methods to distinguish between individuals in a trial. A standard technique for this is CO2 anaesthesia and then labelling or wing clipping each fly. However, this is invasive and has been shown to affect behavior. Other techniques have used coloration to identify flies. This article presents a simple and non-invasive method for labelling Drosophila that allows them to be individually identified within experiments, using food coloring. This method is used in trials where two males compete to mate with a female. Dyeing allowed quick and easy identification. There was, however, some difference in the strength of the coloration across the three species tested. Data is presented showing the dye has a lower impact on mating behavior than CO2 in Drosophila melanogaster. The impact of CO2 anaesthesia is shown to depend on the species of Drosophila, with D. pseudoobscura and D. subobscura showing no impact, whereas D. melanogaster males had reduced mating success. The dye method presented is applicable to a wide range of experimental designs.

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Tingimento Insetos para Comportamentais Ensaios: o comportamento de acasalamento dos anestesiado<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

Condições que afetam Espaço Social em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Clones em um ensaio comportamental para Mechanosensation de MarcM baseada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Forrageamento Protocolo Caminho de comprimento para<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larvas

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...