Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na biologia molecular e esferas genéticas de Hymenoptera, como sistemas de determinação sexual. A principal vantagem dessa técnica é que podemos facilmente induzir linhas de endogamia sobre a formiga Vollenhovia Emery, que são essenciais para o mapeamento genético e o estado molecular. Assim, esta missão pode fornecer informações sobre o sistema de determinação sexual de uma formiga específica e também pode ser aplicada a outras formigas e outras espécies de Hymenoptera, como vespas.
Para começar o protocolo, colete colônias V.Emeryi durante o início do verão. Transfira os espécimes de formigas dos ramos coletados para um ninho de gesso artificial com uma tampa de vidro, usando um aspirador. Mantenha as colônias no ninho artificial a 25 graus C, sob um ciclo claro-escuro de 16 a 8 horas.
Forneça água da torneira com uma garrafa de lavagem para manter o gesso úmido dia sim, dia não, ao mesmo tempo. Em seguida, adicione cerca de 100 microgramas de pó de críquete seco embrulhados em papel alumínio e uma ponta cheia de água de açúcar mascavo para a colônia, usando uma ponta de 20 microliter a cada dois dias até que novas formigas reprodutivas surjam. É importante coletar micro colônias dos campos e fornecer-lhes comida suficiente para ganhar novas rainhas e machos.
Primeiro, impedir que os indivíduos se movam colocando colônias em uma sala com um ambiente controlado definido em quatro graus Celsius por 15 minutos. Remova as pernas médias de 30 formigas operárias usando fórceps sob um estereoscópio para distinguir a geração F-zero dos trabalhadores produzidos em cruzes de endogamia subsequentes. Em seguida, transfira as formigas para um novo ninho de gesso menor para cruzes de endogamia.
Em seguida, adicione três a quatro larvas ou pub em um ninho de gesso contendo trabalhadores. Transfira uma rainha de asas longas e um macho para um ninho de gesso previamente preparado para cruzes de endogamia. Para esta etapa, é importante manter colônia de travessia experimental no mesmo estado que a de uma colônia normal.
É difícil induzir a endogamia apenas colocando machos e fêmeas juntos. Mantenha as colônias a 25 graus Celsius sob uma luz de 16 a oito horas, ciclo escuro com comida e água fornecidas até que a rainha perca suas asas e coloque ovos. Verifique a colônia experimental todos os dias sob um microscópio estéreo.
Após a configuração das cruzes de endogamia entre a prole F-1, os ovos podem ser observados sob um estereoscópio. Depois que a rainha F-1 começar a colocar ovos, remova os machos F-um e larvas ou pube do ninho para evitar que a geração F-um e a geração F-dois se misturem. Mantenha as colônias sob as mesmas condições até que os F-dois prole emerjam.
Remova uma perna de uma rainha F-zero usando fórceps. Transfira a perna para um micro tubo de 1,5 mililitro contendo 100 microliters de um agente de refrigeração. Sob um estereoscópio disseque um abdômen feminino em um prato de vidro cheio com 300 microlitros de água ultra pura usando fórceps.
Desmempilar a espermatozástica contendo o esperma de machos acasalados. Retire o tecido da espermatica e isole o esperma do tecido da fêmea usando alfinetes de insetos. Usando uma micro torta, transfira o esperma para um micro tubo de 1,5 mililitro contendo 100 microliters de um agente de frio.
Incubar as amostras da rainha F-zero e esperma a 95 graus Celsius por 20 minutos. Flash centro fundir o micro tubo e armazenar as amostras a quatro graus Celsius. Depois de confirmar a produção de ovos pela rainha F-1, extraia o DNA da rainha usando as asas do galpão ou uma perna média e genótipo.
Em seguida, extrair o DNA de um f-um macho por genotipagem de uma perna. Para avaliar a fertilidade das formigas machos das cruzes de endogamia, disseque órgãos reprodutivos internos em uma antena de vidro com 400 microliters de solução PBS usando fórceps. Em seguida, remova o PBS e substitua-o por 4% de paraformalído usando uma micro torta.
Fixar o tecido incubando as amostras em PFA por quarenta minutos em temperatura ambiente. Após a fixação, lave os tecidos cinco vezes com 400 microliters de PBS usando uma micro torta. Diluir a solução DAPI para um miligrama por mililitro em PBS.
Remova o PBS e adicione aproximadamente 300 microliters da solução de coloração DAPI diluída ao tecido. Incubar o tecido por 15 minutos em condições escuras a temperatura ambiente. Após a incubação, lave o tecido cinco vezes com 400 microliters de PBS e transfira o tecido para o centro de uma lâmina de vidro usando fórceps.
Em seguida, monte o tecido no meio de montagem contendo tetrametilarhodamina TRITC. Por fim, observe as amostras com um microscópio de varredura a laser confocal usando as lentes objetivas de 20 ou 60 3x. Imagens microscópicas de testículos de Haploid macho v Emeryi mostram tecido fibroso saudável ou espermatozoides que estão ausentes em Diploid macho v Emeryi, que não mostrou tecido fibroso saudável.
Os órgãos reprodutivos masculinos de Diploid macho v Emeryi não produziram esperma e seus testículos não se desenvolveram, sugerindo que os machos produzidos em cruzes endogamias são estéreis. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu o caminho para explorarmos a miatony sexual em uma constante em Vollenhovia Emeryi para as espécies de formigas de tempo rápido.
