Gostaríamos de agradecer aos membros do grupo de oncologia ginecológica para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho é em parte suportado pelo financiamento do National Health and Medical Research Council, o Conselho Australiano de Pesquisas, eo Cancer Institute NSW (PST). MK é um receptor da Universidade de Newcastle Postgraduate Research Fellowship.

cuidados com os animais e os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as orientações do Comitê de Cuidados e Ética Animal da Universidade de Newcastle e confirmou à Lei New South Wales animal Research, Nova Gales do Sul Regulamento Research Animal, eo código da Austrália para o cuidado e utilização de animais para fins científicos. Todos os procedimentos realizados em ratos foram aprovados pelo Comitê Cuidados e Ética Animal da Universidade de Newcastle. 1. Tempo Acasalamento <ol><li> Par 6 - 8 semanas de idade do sexo masculino e do sexo feminino ratos um pouco antes do final do ciclo de luz do dia. </li><li> Verificar as fêmeas para a presença de tampões vaginais de manhã cedo (em ou antes de 08:00), todos os dias. Dia do plugue é considerado como 0,5 dpc. </li><li> Transferir a fêmea com plug vaginal em uma nova gaiola (sem masculino) e rotular a data da tomada. </li></ol> 2. Isolamento de rato embrionárias Gonadais Ridges <ol><li> Isolar embryon ratoic cristas gonadais de 15,5 dpc fêmeas grávidas como descrito em 9, com algumas modificações como descrito em baixo. </li><li> Realizar dissecção antes do meio-dia como o tempo de fêmeas grávidas são consideradas para entrar no dia seguinte da gravidez pela tarde. </li><li> Sacrifício 15,5 DPC fêmeas grávidas que usam deslocamento cervical (ou de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da institucional). </li><li> Mantenha o mouse sobre as suas costas em um papel absorvente absorvente e pulverizar o lado ventral do abdômen com etanol 70%. </li><li> Levante a pele abdominal inferior (lado ventral) com uma pinça e fazer uma incisão lateral usando uma tesoura cirúrgica, que se estende desde a abertura urogenital até o fim para caixa torácica. Puxar a pele para a cabeça do animal para expor o abdômen. </li><li> Corte os músculos abdominais com uma tesoura cirúrgica para expor a cavidade peritoneal. Pegue o útero grávido com uma pinça pouco acima do colo do útero e fazer um corte. Agora, levante o útero, segurando em to da bexiga urinária e cortar o ligamento largo do útero seguido por cortes nas junções uterotubal destacar útero do anexo peritoneal. </li><li> Transferir o útero para um tubo de 50 mL contendo HBSS gelada (Solução Salina Equilibrada de Hank). Lavar o útero grávido suavemente com HBSS arrefecido em gelo para remover o excesso de sangue. </li><li> Manter o útero de uma placa de Petri contendo HBSS arrefecido com gelo e manter em gelo. Corte a parede uterina e tirar os embriões. Manter os embriões numa placa de Petri fresca com HBSS em gelo. </li><li> Pegue um papel de seda estéril limpo e colocá-lo em uma nova placa de Petri. Spray de etanol a 70% sobre o papel de tecido. Mantenha embrião sobre este papel de tecido na face lateral e cortá-la de abdômen inferior utilizando uma lâmina estéril na direção mostrada pela linha pontilhada na Figura 1. </li><li> Corrigir o embrião em uma base de esponja esterilizada fixando a coluna vertebral. </li><li> Colocá-lo sob o microscópio estereoscópico de dissecação e cuidadosamente cortada ao longo da linha média ventral. Remover o fígado e intestinos. O sistema do mouse urogenital (rim, ureter, testículos, WD e canal deferente) deverão ser agora visíveis. </li><li> Recorte o testículo e WD, mantendo-os num prato fresco Petri com HBSS, em gelo. Para tirar o WD e testículos, cortar os canais deferentes perto de seu apego à uretra e cortar a ligação da porção inferior do WD de gubernaculum. </li><li> Reúnem-se os testículos e WDs a partir dos embriões do mesmo grupo (pode variar de acordo com o plano experimental). </li></ol> 3. Cultura de Embryonic gonadal Ridges (Figura 2) <ol><li> Preparar o meio para a cultura das cristas gonadais embrionárias, completando DMEM / F12 com 10% de FBS (Soro Fetal Bovino), 1% de penicilina / estreptomicina e 1% de L-glutamina. Aquece-se a meios para 37 ° C num banho de água. </li><li> Adicionar 300 uL de meios de comunicação por poço de uma placa de cultura celular de 24 poços. </li><li> Pegue um prato Petri fresco e colocar uma pequena gota de HBSS estéril nele. Coloque uma membrana de policarbonato trilha etch (0,881; m) nesta gota de HBSS com a sua superfície brilhante virada para o HBSS. </li><li> Utilizando uma pinça limpa colocar dois WDs e gônadas na membrana (em sua superfície áspera, voltada para cima) e remova a quantidade máxima de HBSS usando lenços estéreis / papel absorvente. Não toque o tecido com papel absorvente; caso contrário, irá danificar o tecido. </li><li> Certifique-se de que nem os WDs nem as gónadas estão tocando um ao outro. Caso contrário, eles vão ficar juntos durante a incubação subsequente. </li><li> Transferir a membrana com os tecidos do poço de uma placa de 24 poços contendo meio de cultura de 300 mL e a cultura los na interface ar-meio. meio de cultura muito em membranas resulta em um crescimento cística do WDS. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C incubadora, na presença de 5% de CO 2. </li><li> Alterar o meio de cultura todos os dias. Para alterar a forma, com a pipeta, retire a forma do poço primeiro e, em seguida, adicionam-se 300 uL do meio fresco pré-aquecido. Nota:Para estudar o efeito de diferentes vias de sinalização na morfogénese WD, activadores e / ou inibidores químicos às concentrações requeridas podem ser adicionados ao meio de cultura. </li><li> Cultura tecidos para 3 d. Dentro de 3 d, WDs desenroladas recolhidos a partir de um embrião dpc 15,5 transformar em tubos altamente complicadas (Figura 3B). A adição do inibidor de Wnt, IWR1, resulta em inibição da WD bobinamento (Figura 3C). </li><li> Para a colheita destes tecidos tomar uma placa de Petri com PBS gelado. Transferir a membrana com gônadas culta e WD na placa de Petri. A membrana irá flutuar no PBS. Pressione a membrana para afundá-lo em PBS e tirar a gônada e WD. </li><li> Fixar os tecidos com 4% de paraformaldeído (PFA) O / N a 4 ° C ou durante 1 h à TA. Se necessário, tomar as imagens de campo claro de WDS antes da fixação. </li></ol> 4. Imunofluorescência Monte Whole <ol><li> Lava-se a tecidos fixados 3x com PBS-T (PBS + 1%Triton X-100) com agitação lenta, de 10 minutos cada, à temperatura ambiente. </li><li> Desidratar os tecidos numa série graduada de etanol (25%, 50%, 75% e 100%), 10 min cada, a 4 ° C, com balanço lento (~ 30 rpm). Neste passo, os tecidos podem ser armazenadas a 4 ° C em 75% de etanol. <ol><li> Para alterar o etanol, manter os tecidos não perturbadas por 2 min e deixe os tecidos se acalmar. Tome-se como muito sobrenadante quanto possível e, em seguida, adicione a maior concentração próxima de etanol. Para evitar qualquer dano aos tecidos, a ponteira não deve tocar os tecidos em qualquer fase. </li></ol></li><li> Após desidratação, a re-hidratar os tecidos numa série graduada de etanol (100%, 75%, 50% e 25%), 10 min cada, a 4 ° C, com agitação lenta. </li><li> Lavar os tecidos com PBS-T (PBS + 0,1% de Triton X-100), 4x, 20 minutos cada, à RT, com agitação suave (~ 30 rpm). </li><li> Bloquear os tecidos durante 1 h à temperatura ambiente com tampão de bloqueio (PBS + BSA a 1% + 0,2% de leite seco sem gordura em pó + 0,3% de Triton X-100). </li><li> afteR bloqueio, transferir os tecidos a solução de anticorpo primário (diluído em tampão de bloqueio) e incubar O / N a 4 ° C com agitação suave (~ 30 rpm). As diluições dos anticorpos primários utilizados são descritos na Tabela Materiais. </li><li> No dia seguinte, lavar tecidos com PBS-MT (PBS + 2% de leite magro em pó seco + 0,5% de Tween-20), 4x, 30 minutos cada, à RT, com agitação suave (~ 30 rpm). </li><li> Após este passo de lavagem, adicionar o anticorpo secundário, a uma diluição de 1: 250 (Este passo necessita de optimização para anticorpos individuais) em tampão de bloqueio e incubar durante 1 h, à RT, com agitação suave. </li><li> De agora em diante, manter os tecidos cobertos com folha de alumínio para evitar a exposição à luz como anticorpos secundários são rotuladas com fluoróforos sensíveis à luz. </li><li> Lavar os tecidos 3x com PBS-T (PBS + 0,1% de Tween-20), 30 min cada, com agitação suave. </li><li> Preparar lâminas para a montagem dos tecidos manchados. <ol><li> Para isso, cortar as lamelas de vidroem tiras finas usando uma caneta de diamante e ficar duas tiras de um sobre o outro na lâmina de vidro usando esmalte de unhas. Adicione dois limites e tecidos lugar entre estes dois limites. </li><li> Adicionar DAPI contendo meio de montagem e colocar uma lamela. Aplicar esmalte nos cantos da lâmina de cobertura para corrigi-lo ao slide. Nota: Os tecidos estão agora prontos para a imagem latente. Armazenar esses slides a -20 ° C. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian/epididymal+duct,+more+twists+and+turns.">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li><li>Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+normal+and+abnormal+development+of+the+Wolffian/epididymal+duct+by+using+transgenic+mice.">Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice.</a> Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).</li><li>Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt9b+plays+a+central+role+in+the+regulation+of+mesenchymal+to+epithelial+transitions+underlying+organogenesis+of+the+mammalian+urogenital+system.">Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system.</a> Dev Cell. 9, 283-292 (2005).</li><li>Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Wnt/&#946;catenin+signalling+is+essential+for+epididymal+coiling.">Epithelial Wnt/&#946;catenin signalling is essential for epididymal coiling.</a> Dev Biol. 412, 234-249 (2016).</li><li>Murashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+androgen+signaling+in+Wolffian+duct+stabilization+and+epididymal+cell+differentiation.">Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation.</a> Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development.">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).</li><li>Hirashima, T., Adachi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+the+Quantification+of+Whole-Tissue+Immunofluorescence+Images+Obtained+at+Single-Cell+Resolution+during+Murine+Tubular+Organ+Development.">Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development.</a> PLoS One. 10, 0135343 (2015).</li><li>Chan, W. Y., Blomberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Development:+Methods+and+Protocols.">Germline Development: Methods and Protocols.</a> Methods Mol Biol. 825, (2012).</li><li>Karner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tankyrase+Is+Necessary+for+Canonical+Wnt+Signaling+During+Kidney+Development.">Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development.</a> Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).</li><li>Traykova-Brauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+versatile+system+for+acute+and+chronic+modulation+of+renal+tubular+function+in+transgenic+mice.">An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice.</a> Nat Med. 14, 979-984 (2008).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

O sistema de cultura de órgãos tem muitas vantagens sobre o sistema de cultura celular tradicional. Este sistema retém as relações estruturais originais e as interacções entre diferentes tipos de células. Ele imita em sistemas in vivo e dá informações mais precisas do que os estudos de cultura de células, onde o fator de nicho está ausente. A utilização de sistemas de cultura de órgãos mesmo tem vantagens sobre o uso de todo o animal. Estes incluem o custo mais elevado de utilização ...

O sistema reprodutor masculino é composto principalmente de testículo, o local para o desenvolvimento de células germinativas e diferenciação, e um sistema ductal complexo que é necessário para a maturação, de transporte, de armazenamento e de esperma. Epidídimo é um órgão tubular que liga testículo com vasos deferentes e, principalmente, envolvidos no desenvolvimento pós-testicular e maturação das células germinativas 1. O epidídimo altamente enrolados do rato adulto desenvolve a partir de um tubo simples e direto precursor, duto de Wolff (WD) 1. A estrutura complexa e enrolada de epidídimo é essencial para o esperma para adquirir a capacidade de fertilizar células germinativas femininas 2. Como tal órgão essencial para a fertilidade masculina e desenvolve fica em forma não é bem compreendido. Várias vias de sinalização foram mostradas para ser envolvido no desenvolvimento de WD, tais como a via de sinalização Wnt 3,4 e o androgénio via da 5 sinalização. Nosso trabalho recente estabeleceu a exigência de balANCED Wnt sinalização para WD enrolamento durante o desenvolvimento pré-natal 4. No entanto, mais estudos são necessários para entender os mecanismos envolvidos no enrolamento pós-natal do epidídimo, diferenciação celular, e comunicação célula-célula dentro do epitélio do epidídimo e com células intersticiais. Modelos de ratos geneticamente modificados têm sido provado ser uma poderosa ferramenta para a identificação / validação dos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e doenças de diversos sistemas de órgãos 6. Apesar de sua ampla utilização, existem limitações significativas de modelos de ratos geneticamente modificados, incluindo o fenótipo imprevisíveis de ratos mutantes alvo com relação à função do gene presumido, e nenhum fenótipo em mutantes nulos em alguns modelos, a influência de fatores genéticos e ambientais, trabalho intensivo e demorado processo de desenvolvimento de modelos de ratinho. Portanto, a interpretação do significado dos resultados apenas dos geneticamente modimodelos ficados rato nem sempre é simples 6. Estas limitações podem ser superadas utilizando em sistema de cultura de órgãos in vitro que nos dá a flexibilidade de manipular múltiplas vias de sinalização em tempo real, em condições de cultura controladas. Sistema de cultura de órgãos é fundamental para a compreensão da fisiologia e patologia dos órgãos inteiros 7. Além disso, a imagiologia de órgãos inteiros coradas com anticorpos etiquetados fluoróforo nos permite visualizar os marcadores de interesse num contexto tridimensional, tal como existe in vivo, proporcionando assim uma melhor compreensão da forma do órgão, estrutura, função e 8. Aqui, descrevemos os métodos para isolamento de rato cumes gonadal embrionárias, a cultura in vitro e toda imagem imunofluorescência monte da WDS, que podem ser aplicados para responder a uma variedade de questões relativas à morfogênese de órgãos tubulares, tais como WDS. Neste protocolo,isolado de rato embrionário pregas genitais de 15,5 dias post coitum (DPC) vacas prenhes e cultivaram-durante 3 d seguido de imunocoloração para um marcador das células epiteliais (citoqueratina 8, CK8), um marcador de proliferação celular (fosfo-Histona 3, PH3) e activa βcatenin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">24 well plates</td>
			<td style="width:195px;">Corning, USA</td>
			<td style="width:136px;">3524</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">SH30031.02</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">D8437</td>
			<td style="width:191px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:195px;">Interpath,&#160; Australia</td>
			<td style="width:136px;">SH30034.02</td>
			<td style="width:191px;">10% FBS used in culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">SH30034.01</td>
			<td style="width:191px;">1% concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:247px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:195px;">Gibco, USA</td>
			<td style="width:136px;">15070-063</td>
			<td style="width:191px;">1% concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Whatman, USA</td>
			<td style="width:136px;">110409</td>
			<td style="width:191px;">Membrane (0.8 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">IWR1</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">10161-5mg</td>
			<td style="width:191px;">100 &#181;M concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:247px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Sciences, USA</td>
			<td style="width:136px;">15710</td>
			<td style="width:191px;">16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot 
			be disposed of in the sink</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">214-20L PL</td>
			<td style="width:191px;">Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">2509-500ml</td>
			<td style="width:191px;">Very viscous, careful while dispensing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">T8787-50ml</td>
			<td style="width:191px;">Very viscous, careful while dispensing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Di-Sodium Hydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">621-500mg</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Sodium Di-hydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Ajax Finechem, USA</td>
			<td style="width:136px;">4745-500g</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fisher, USA</td>
			<td style="width:136px;">465-500g</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:247px;">Cytokeratin8/Troma I</td>
			<td style="width:195px;">Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)</td>
			<td style="width:136px;">TROMA-I</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">active &#946;catenin&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Cell Signalling Technology,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">D13A1</td>
			<td style="width:191px;">1:200 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:247px;">Phospho-Histone3</td>
			<td style="width:195px;">Millipore, MA, USA</td>
			<td style="width:136px;">06-570</td>
			<td style="width:191px;">1:200 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Alexa488 Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearchLabs,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">111-545-047</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:247px;">Alexa594 Goat anti-Rat IgG</td>
			<td style="width:195px;">Jackson ImmunoResearchLabs,&#160; USA</td>
			<td style="width:136px;">112-585-072</td>
			<td style="width:191px;">1:250 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:136px;">242-500ml</td>
			<td style="width:191px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">n-Propyl galate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">2370</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:136px;">D9564-10mg</td>
			<td style="width:191px;">Use to stain nucleic acids (DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:136px;">2225-500ml</td>
			<td style="width:191px;">Solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Cover Slips (24x50 mm)</td>
			<td style="width:195px;">Lomb Scientific</td>
			<td style="width:136px;">CS24501GP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts

morfogénese tubária é um requisito fundamental para o desenvolvimento da maioria dos órgãos de mamíferos, incluindo o sistema reprodutivo masculino. O epidídimo, parte integrante do sistema reprodutor masculino, é responsável pela estocagem de esperma, maturação e transporte. O epidídimo adulto é um tubo altamente enrolada que se desenvolve a partir de um precursor embrionária simples e direto conhecido como duto de Wolff (WD). enrolamento adequada do epidídimo é essencial para a fertilidade masculina, como o esperma no testículo são incapazes de fertilizar um óvulo. No entanto, o mecanismo responsável pelo desenvolvimento e epididimal de enrolamento permanece pouco clara, parcialmente devido à falta de métodos de cultura de órgãos e de imagem inteiros. Neste estudo, descrevemos um sistema de cultura in vitro e todo o protocolo de imunofluorescência de montagem para visualizar melhor o processo de enrolamento de WD e desenvolvimento, o que pode também ser aplicada ao estudo de outros órgãos tubulares.

Durante o desenvolvimento, o WD sofre alterações significativas no qual um tubo simples e direto é transformado em um duto altamente complexo e enrolada. Utilizando os métodos descritos acima, o WDS sofrer uma transformação similar em condições de cultura. Aqui temos mostrado os resultados de WDs cultivadas durante 3 d (Figura 3). Para dissecar os mecanismos moleculares envolvidos na morfogénese WD, o meio de cultura pode ser suplementado com inibidores e activadores, dirigidos a diferentes via...

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Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Nós apresentamos um método para isolamento e cultura do duto de Wolff rato (WD). Também demonstramos um procedimento detalhado para toda a imunocoloração monte da cultura / WDs recentemente isolados com anticorpos marcados fluorescentes. Em conjunto, estas técnicas permitem o estudo do desenvolvimento WD, de enrolamento, e a diferenciação.

Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

organ-culture-whole-mount-immunofluorescence-staining-mouse-wolffian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K visualizações.  University of Newcastle.  Nós apresentamos um método para isolamento e cultura do duto de Wolff rato (WD). Também demonstramos um procedimento detalhado para toda a imunocoloração monte da cultura / WDs recentemente isolados com anticorpos marcados fluorescentes. Em conjunto, estas técnicas permitem o estudo do desenvolvimento WD, de enrolamento, e a diferenciação. 

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Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

Método de Estudar Palatal Fusão usando estático Órgão Cultura

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Biologia do Desenvolvimento

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Análise do desenvolvimento de câmara cardíaca durante a embriogênese de rato usando toda montagem de epifluorescência

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have no effective therapeutic options. Tools to study EHBD are very limited. Our purpose was to develop an organ-specific, versatile, adult stem cell-derived, preclinical cholangiocyte model that can be easily generated from wild type and genetically engineered mice. Thus, we report on the novel technique of developing an EHBD organoid (EHBDO) culture system from adult mouse EHBDs. The model is cost-efficient, able to be readily analyzed, and has multiple downstream applications. Specifically, we describe the methodology of mouse EHBD isolation and single cell dissociation, organoid culture initiation, propagation, and long-term maintenance and storage. This manuscript also describes EHBDO processing for immunohistochemistry, fluorescent microscopy, and mRNA abundance quantitation by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol has significant advantages in addition to producing EHBD-specific organoids. The use of a conditioned medium from L-WRN cells significantly reduces the cost of this model. The use of mouse EHBDs provides almost unlimited tissue for culture generation, unlike human tissue. Generated mouse EHBDOs contain a pure population of epithelial cells with markers of endodermal progenitor and differentiated biliary cells. Cultured organoids maintain homogenous morphology through multiple passages and can be recovered after a long-term storage period in liquid nitrogen. The model allows for the study of biliary progenitor cell proliferation, can be manipulated pharmacologically, and may be generated from genetically engineered mice. Future studies are needed to optimize culture conditions in order to increase plating efficiency, evaluate functional cell maturity, and direct cell differentiation. Development of co-culture models and a more biologically neutral extracellular matrix are also desirable.

This protocol describes the production of a mouse extrahepatic bile duct 3-dimensional organoid system. These biliary organoids can be maintained in culture to study cholangiocyte biology. Biliary organoids express markers of both progenitor and biliary cells and are composed of polarized epithelial cells.

Geração de Organoids de vias biliares extra-hepáticas Mouse

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...