Gostaríamos de agradecer aos membros do grupo de oncologia ginecológica para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho é em parte suportado pelo financiamento do National Health and Medical Research Council, o Conselho Australiano de Pesquisas, eo Cancer Institute NSW (PST). MK é um receptor da Universidade de Newcastle Postgraduate Research Fellowship.

cuidados com os animais e os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as orientações do Comitê de Cuidados e Ética Animal da Universidade de Newcastle e confirmou à Lei New South Wales animal Research, Nova Gales do Sul Regulamento Research Animal, eo código da Austrália para o cuidado e utilização de animais para fins científicos. Todos os procedimentos realizados em ratos foram aprovados pelo Comitê Cuidados e Ética Animal da Universidade de Newcastle. 1. Tempo Acasalamento <ol><li> Par 6 - 8 semanas de idade do sexo masculino e do sexo feminino ratos um pouco antes do final do ciclo de luz do dia. </li><li> Verificar as fêmeas para a presença de tampões vaginais de manhã cedo (em ou antes de 08:00), todos os dias. Dia do plugue é considerado como 0,5 dpc. </li><li> Transferir a fêmea com plug vaginal em uma nova gaiola (sem masculino) e rotular a data da tomada. </li></ol> 2. Isolamento de rato embrionárias Gonadais Ridges <ol><li> Isolar embryon ratoic cristas gonadais de 15,5 dpc fêmeas grávidas como descrito em 9, com algumas modificações como descrito em baixo. </li><li> Realizar dissecção antes do meio-dia como o tempo de fêmeas grávidas são consideradas para entrar no dia seguinte da gravidez pela tarde. </li><li> Sacrifício 15,5 DPC fêmeas grávidas que usam deslocamento cervical (ou de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da institucional). </li><li> Mantenha o mouse sobre as suas costas em um papel absorvente absorvente e pulverizar o lado ventral do abdômen com etanol 70%. </li><li> Levante a pele abdominal inferior (lado ventral) com uma pinça e fazer uma incisão lateral usando uma tesoura cirúrgica, que se estende desde a abertura urogenital até o fim para caixa torácica. Puxar a pele para a cabeça do animal para expor o abdômen. </li><li> Corte os músculos abdominais com uma tesoura cirúrgica para expor a cavidade peritoneal. Pegue o útero grávido com uma pinça pouco acima do colo do útero e fazer um corte. Agora, levante o útero, segurando em to da bexiga urinária e cortar o ligamento largo do útero seguido por cortes nas junções uterotubal destacar útero do anexo peritoneal. </li><li> Transferir o útero para um tubo de 50 mL contendo HBSS gelada (Solução Salina Equilibrada de Hank). Lavar o útero grávido suavemente com HBSS arrefecido em gelo para remover o excesso de sangue. </li><li> Manter o útero de uma placa de Petri contendo HBSS arrefecido com gelo e manter em gelo. Corte a parede uterina e tirar os embriões. Manter os embriões numa placa de Petri fresca com HBSS em gelo. </li><li> Pegue um papel de seda estéril limpo e colocá-lo em uma nova placa de Petri. Spray de etanol a 70% sobre o papel de tecido. Mantenha embrião sobre este papel de tecido na face lateral e cortá-la de abdômen inferior utilizando uma lâmina estéril na direção mostrada pela linha pontilhada na Figura 1. </li><li> Corrigir o embrião em uma base de esponja esterilizada fixando a coluna vertebral. </li><li> Colocá-lo sob o microscópio estereoscópico de dissecação e cuidadosamente cortada ao longo da linha média ventral. Remover o fígado e intestinos. O sistema do mouse urogenital (rim, ureter, testículos, WD e canal deferente) deverão ser agora visíveis. </li><li> Recorte o testículo e WD, mantendo-os num prato fresco Petri com HBSS, em gelo. Para tirar o WD e testículos, cortar os canais deferentes perto de seu apego à uretra e cortar a ligação da porção inferior do WD de gubernaculum. </li><li> Reúnem-se os testículos e WDs a partir dos embriões do mesmo grupo (pode variar de acordo com o plano experimental). </li></ol> 3. Cultura de Embryonic gonadal Ridges (Figura 2) <ol><li> Preparar o meio para a cultura das cristas gonadais embrionárias, completando DMEM / F12 com 10% de FBS (Soro Fetal Bovino), 1% de penicilina / estreptomicina e 1% de L-glutamina. Aquece-se a meios para 37 ° C num banho de água. </li><li> Adicionar 300 uL de meios de comunicação por poço de uma placa de cultura celular de 24 poços. </li><li> Pegue um prato Petri fresco e colocar uma pequena gota de HBSS estéril nele. Coloque uma membrana de policarbonato trilha etch (0,881; m) nesta gota de HBSS com a sua superfície brilhante virada para o HBSS. </li><li> Utilizando uma pinça limpa colocar dois WDs e gônadas na membrana (em sua superfície áspera, voltada para cima) e remova a quantidade máxima de HBSS usando lenços estéreis / papel absorvente. Não toque o tecido com papel absorvente; caso contrário, irá danificar o tecido. </li><li> Certifique-se de que nem os WDs nem as gónadas estão tocando um ao outro. Caso contrário, eles vão ficar juntos durante a incubação subsequente. </li><li> Transferir a membrana com os tecidos do poço de uma placa de 24 poços contendo meio de cultura de 300 mL e a cultura los na interface ar-meio. meio de cultura muito em membranas resulta em um crescimento cística do WDS. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C incubadora, na presença de 5% de CO 2. </li><li> Alterar o meio de cultura todos os dias. Para alterar a forma, com a pipeta, retire a forma do poço primeiro e, em seguida, adicionam-se 300 uL do meio fresco pré-aquecido. Nota:Para estudar o efeito de diferentes vias de sinalização na morfogénese WD, activadores e / ou inibidores químicos às concentrações requeridas podem ser adicionados ao meio de cultura. </li><li> Cultura tecidos para 3 d. Dentro de 3 d, WDs desenroladas recolhidos a partir de um embrião dpc 15,5 transformar em tubos altamente complicadas (Figura 3B). A adição do inibidor de Wnt, IWR1, resulta em inibição da WD bobinamento (Figura 3C). </li><li> Para a colheita destes tecidos tomar uma placa de Petri com PBS gelado. Transferir a membrana com gônadas culta e WD na placa de Petri. A membrana irá flutuar no PBS. Pressione a membrana para afundá-lo em PBS e tirar a gônada e WD. </li><li> Fixar os tecidos com 4% de paraformaldeído (PFA) O / N a 4 ° C ou durante 1 h à TA. Se necessário, tomar as imagens de campo claro de WDS antes da fixação. </li></ol> 4. Imunofluorescência Monte Whole <ol><li> Lava-se a tecidos fixados 3x com PBS-T (PBS + 1%Triton X-100) com agitação lenta, de 10 minutos cada, à temperatura ambiente. </li><li> Desidratar os tecidos numa série graduada de etanol (25%, 50%, 75% e 100%), 10 min cada, a 4 ° C, com balanço lento (~ 30 rpm). Neste passo, os tecidos podem ser armazenadas a 4 ° C em 75% de etanol. <ol><li> Para alterar o etanol, manter os tecidos não perturbadas por 2 min e deixe os tecidos se acalmar. Tome-se como muito sobrenadante quanto possível e, em seguida, adicione a maior concentração próxima de etanol. Para evitar qualquer dano aos tecidos, a ponteira não deve tocar os tecidos em qualquer fase. </li></ol></li><li> Após desidratação, a re-hidratar os tecidos numa série graduada de etanol (100%, 75%, 50% e 25%), 10 min cada, a 4 ° C, com agitação lenta. </li><li> Lavar os tecidos com PBS-T (PBS + 0,1% de Triton X-100), 4x, 20 minutos cada, à RT, com agitação suave (~ 30 rpm). </li><li> Bloquear os tecidos durante 1 h à temperatura ambiente com tampão de bloqueio (PBS + BSA a 1% + 0,2% de leite seco sem gordura em pó + 0,3% de Triton X-100). </li><li> afteR bloqueio, transferir os tecidos a solução de anticorpo primário (diluído em tampão de bloqueio) e incubar O / N a 4 ° C com agitação suave (~ 30 rpm). As diluições dos anticorpos primários utilizados são descritos na Tabela Materiais. </li><li> No dia seguinte, lavar tecidos com PBS-MT (PBS + 2% de leite magro em pó seco + 0,5% de Tween-20), 4x, 30 minutos cada, à RT, com agitação suave (~ 30 rpm). </li><li> Após este passo de lavagem, adicionar o anticorpo secundário, a uma diluição de 1: 250 (Este passo necessita de optimização para anticorpos individuais) em tampão de bloqueio e incubar durante 1 h, à RT, com agitação suave. </li><li> De agora em diante, manter os tecidos cobertos com folha de alumínio para evitar a exposição à luz como anticorpos secundários são rotuladas com fluoróforos sensíveis à luz. </li><li> Lavar os tecidos 3x com PBS-T (PBS + 0,1% de Tween-20), 30 min cada, com agitação suave. </li><li> Preparar lâminas para a montagem dos tecidos manchados. <ol><li> Para isso, cortar as lamelas de vidroem tiras finas usando uma caneta de diamante e ficar duas tiras de um sobre o outro na lâmina de vidro usando esmalte de unhas. Adicione dois limites e tecidos lugar entre estes dois limites. </li><li> Adicionar DAPI contendo meio de montagem e colocar uma lamela. Aplicar esmalte nos cantos da lâmina de cobertura para corrigi-lo ao slide. Nota: Os tecidos estão agora prontos para a imagem latente. Armazenar esses slides a -20 ° C. </li></ol></li></ol>

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	<li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian/epididymal+duct,+more+twists+and+turns.">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li><li>Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+normal+and+abnormal+development+of+the+Wolffian/epididymal+duct+by+using+transgenic+mice.">Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice.</a> Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).</li><li>Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt9b+plays+a+central+role+in+the+regulation+of+mesenchymal+to+epithelial+transitions+underlying+organogenesis+of+the+mammalian+urogenital+system.">Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system.</a> Dev Cell. 9, 283-292 (2005).</li><li>Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Wnt/&#946;catenin+signalling+is+essential+for+epididymal+coiling.">Epithelial Wnt/&#946;catenin signalling is essential for epididymal coiling.</a> Dev Biol. 412, 234-249 (2016).</li><li>Murashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+androgen+signaling+in+Wolffian+duct+stabilization+and+epididymal+cell+differentiation.">Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation.</a> Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development.">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).</li><li>Hirashima, T., Adachi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+the+Quantification+of+Whole-Tissue+Immunofluorescence+Images+Obtained+at+Single-Cell+Resolution+during+Murine+Tubular+Organ+Development.">Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development.</a> PLoS One. 10, 0135343 (2015).</li><li>Chan, W. Y., Blomberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Development:+Methods+and+Protocols.">Germline Development: Methods and Protocols.</a> Methods Mol Biol. 825, (2012).</li><li>Karner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tankyrase+Is+Necessary+for+Canonical+Wnt+Signaling+During+Kidney+Development.">Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development.</a> Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).</li><li>Traykova-Brauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+versatile+system+for+acute+and+chronic+modulation+of+renal+tubular+function+in+transgenic+mice.">An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice.</a> Nat Med. 14, 979-984 (2008).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

O sistema de cultura de órgãos tem muitas vantagens sobre o sistema de cultura celular tradicional. Este sistema retém as relações estruturais originais e as interacções entre diferentes tipos de células. Ele imita em sistemas in vivo e dá informações mais precisas do que os estudos de cultura de células, onde o fator de nicho está ausente. A utilização de sistemas de cultura de órgãos mesmo tem vantagens sobre o uso de todo o animal. Estes incluem o custo mais elevado de utilização ...

O sistema reprodutor masculino é composto principalmente de testículo, o local para o desenvolvimento de células germinativas e diferenciação, e um sistema ductal complexo que é necessário para a maturação, de transporte, de armazenamento e de esperma. Epidídimo é um órgão tubular que liga testículo com vasos deferentes e, principalmente, envolvidos no desenvolvimento pós-testicular e maturação das células germinativas 1. O epidídimo altamente enrolados do rato adulto desenvolve a partir de um tubo simples e direto precursor, duto de Wolff (WD) 1. A estrutura complexa e enrolada de epidídimo é essencial para o esperma para adquirir a capacidade de fertilizar células germinativas femininas 2. Como tal órgão essencial para a fertilidade masculina e desenvolve fica em forma não é bem compreendido. Várias vias de sinalização foram mostradas para ser envolvido no desenvolvimento de WD, tais como a via de sinalização Wnt 3,4 e o androgénio via da 5 sinalização. Nosso trabalho recente estabeleceu a exigência de balANCED Wnt sinalização para WD enrolamento durante o desenvolvimento pré-natal 4. No entanto, mais estudos são necessários para entender os mecanismos envolvidos no enrolamento pós-natal do epidídimo, diferenciação celular, e comunicação célula-célula dentro do epitélio do epidídimo e com células intersticiais. Modelos de ratos geneticamente modificados têm sido provado ser uma poderosa ferramenta para a identificação / validação dos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e doenças de diversos sistemas de órgãos 6. Apesar de sua ampla utilização, existem limitações significativas de modelos de ratos geneticamente modificados, incluindo o fenótipo imprevisíveis de ratos mutantes alvo com relação à função do gene presumido, e nenhum fenótipo em mutantes nulos em alguns modelos, a influência de fatores genéticos e ambientais, trabalho intensivo e demorado processo de desenvolvimento de modelos de ratinho. Portanto, a interpretação do significado dos resultados apenas dos geneticamente modimodelos ficados rato nem sempre é simples 6. Estas limitações podem ser superadas utilizando em sistema de cultura de órgãos in vitro que nos dá a flexibilidade de manipular múltiplas vias de sinalização em tempo real, em condições de cultura controladas. Sistema de cultura de órgãos é fundamental para a compreensão da fisiologia e patologia dos órgãos inteiros 7. Além disso, a imagiologia de órgãos inteiros coradas com anticorpos etiquetados fluoróforo nos permite visualizar os marcadores de interesse num contexto tridimensional, tal como existe in vivo, proporcionando assim uma melhor compreensão da forma do órgão, estrutura, função e 8. Aqui, descrevemos os métodos para isolamento de rato cumes gonadal embrionárias, a cultura in vitro e toda imagem imunofluorescência monte da WDS, que podem ser aplicados para responder a uma variedade de questões relativas à morfogênese de órgãos tubulares, tais como WDS. Neste protocolo,isolado de rato embrionário pregas genitais de 15,5 dias post coitum (DPC) vacas prenhes e cultivaram-durante 3 d seguido de imunocoloração para um marcador das células epiteliais (citoqueratina 8, CK8), um marcador de proliferação celular (fosfo-Histona 3, PH3) e activa βcatenin.

<table><tbody><tr><td>24-well plates</td><td>Corning, USA</td><td>3524</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30031.02</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td><td>Sigma, USA</td><td>D8437</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Interpath,&amp;nbsp; Australia</td><td>SH30034.02</td><td>10% FBS used in culture medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30034.01</td><td>1% concentration used</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco, USA</td><td>15070-063</td><td>1% concentration used</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch&amp;nbsp;</td><td>Whatman, USA</td><td>110409</td><td>Membrane (0.8 &amp;micro;m)</td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma, USA</td><td>10161-5mg</td><td>100 &amp;micro;M concentration used</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences, USA</td><td>15710</td><td>16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot&lt;br/&gt; be disposed of in the sink</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>214-20L PL</td><td>Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>2509-500ml</td><td>Very viscous, careful while dispensing</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, USA</td><td>T8787-50ml</td><td>Very viscous, careful while dispensing</td></tr><tr><td>Di-Sodium Hydrogen Phosphate</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>621-500mg</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sodium Di-hydrogen Phosphate</td><td>Ajax Finechem, USA</td><td>4745-500g</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>465-500g</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cytokeratin8/Troma I</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)</td><td>TROMA-I</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>active &amp;beta;catenin&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology,&amp;nbsp; USA</td><td>D13A1</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>phospho-Histone 3</td><td>Millipore, MA, USA</td><td>06-570</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa488 Goat anti-rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>111-545-047</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa594 Goat anti-Rat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>112-585-072</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>242-500ml</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>n-Propyl galate</td><td>Sigma, USA</td><td>2370</td><td>-</td></tr><tr><td>2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)</td><td>Sigma, USA</td><td>D9564-10mg</td><td>Use to stain nucleic acids (DNA)</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>2225-500ml</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Cover Slips (24 x 50 mm)</td><td>Lomb Scientific</td><td>CS24501GP</td><td>-</td></tr></tbody></table>

organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts

morfogénese tubária é um requisito fundamental para o desenvolvimento da maioria dos órgãos de mamíferos, incluindo o sistema reprodutivo masculino. O epidídimo, parte integrante do sistema reprodutor masculino, é responsável pela estocagem de esperma, maturação e transporte. O epidídimo adulto é um tubo altamente enrolada que se desenvolve a partir de um precursor embrionária simples e direto conhecido como duto de Wolff (WD). enrolamento adequada do epidídimo é essencial para a fertilidade masculina, como o esperma no testículo são incapazes de fertilizar um óvulo. No entanto, o mecanismo responsável pelo desenvolvimento e epididimal de enrolamento permanece pouco clara, parcialmente devido à falta de métodos de cultura de órgãos e de imagem inteiros. Neste estudo, descrevemos um sistema de cultura in vitro e todo o protocolo de imunofluorescência de montagem para visualizar melhor o processo de enrolamento de WD e desenvolvimento, o que pode também ser aplicada ao estudo de outros órgãos tubulares.

Durante o desenvolvimento, o WD sofre alterações significativas no qual um tubo simples e direto é transformado em um duto altamente complexo e enrolada. Utilizando os métodos descritos acima, o WDS sofrer uma transformação similar em condições de cultura. Aqui temos mostrado os resultados de WDs cultivadas durante 3 d (Figura 3). Para dissecar os mecanismos moleculares envolvidos na morfogénese WD, o meio de cultura pode ser suplementado com inibidores e activadores, dirigidos a diferentes via...

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Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Nós apresentamos um método para isolamento e cultura do duto de Wolff rato (WD). Também demonstramos um procedimento detalhado para toda a imunocoloração monte da cultura / WDs recentemente isolados com anticorpos marcados fluorescentes. Em conjunto, estas técnicas permitem o estudo do desenvolvimento WD, de enrolamento, e a diferenciação.

Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K visualizações.  University of Newcastle.  Nós apresentamos um método para isolamento e cultura do duto de Wolff rato (WD). Também demonstramos um procedimento detalhado para toda a imunocoloração monte da cultura / WDs recentemente isolados com anticorpos marcados fluorescentes. Em conjunto, estas técnicas permitem o estudo do desenvolvimento WD, de enrolamento, e a diferenciação. 

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Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Vertical Gota de toda fetais Órgãos para estudar processos de desenvolvimento durante Rato Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Biologia do Desenvolvimento

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

Identificação, caracterização histológica e dissecação dos lobos da próstata do rato para em Vitro Spheroid 3D modelos de cultura

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Pesquisa do câncer

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids represent useful models to study the mechanisms that control stem cell self-renewal and differentiation in mammals, including primary ciliogenesis and ciliary signaling. Primary ciliogenesis is the dynamic process of assembling the primary cilium, a key cell signaling center that controls stem cell self-renewal and/or differentiation in various tissues. Here we present a comprehensive protocol for the immunofluorescence staining of cell lineage and primary cilia markers, in whole-mount mouse mammary organoids, for light sheet microscopy. We describe the microscopy imaging method and an image processing technique for the quantitative analysis of primary cilium assembly and length in organoids. This protocol enables a precise analysis of primary cilia in complex three-dimensional structures at the single cell level. This method is applicable for immunofluorescence staining and imaging of primary cilia and ciliary signaling in mammary organoids derived from normal and genetically modified stem cells, from healthy and pathological tissues, to study the biology of the primary cilium in health and disease.

<meta charset="utf8"></head><body>Imagem tridimensional de organoides para estudar a ciliogênese primária durante a organogênese ex vivo

Stem cell-derived organoids facilitate the analysis of molecular and cellular processes that regulate stem cell self-renewal and differentiation during organogenesis in mammalian tissues. Here we present a protocol for the analysis of the biology of the primary cilium in mouse mammary organoids.

Imagem tridimensional de organoides para estudar a ciliogênese primária durante a organogênese ex vivo

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids ...

Genética

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed in order to create testicular organoids. Many of these methods rely upon extracellular matrix (ECM) to promote de novo tissue assembly, however, there are differences between methods in terms of biomimetic morphology and function of tissues. Moreover, there are few direct comparisons of published methods. Here, a direct comparison is made by studying differences in organoid generation protocols, with provided outcomes. Four archetypal generation methods: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free, and (4) 3D ECM culture are described. Three primary benchmarks were used to assess the testicular organoid generation. These are cellular self-assembly, inclusion of major cell types (Sertoli, Leydig, germ, and peritubular cells), and appropriately compartmentalized tissue architecture. Of the four environments tested, 2D ECM and 3D ECM-free cultures generated organoids with internal morphologies most similar to native testes, including the de novo compartmentalization of tubular versus interstitial cell types, the development of tubule-like-structures, and an established long-term endocrine function. All methods studied utilized unsorted, primary murine testicular cell suspensions and used commonly accessible culture resources. These testicular organoid generation techniques provide a highly accessible and reproducible toolkit for research initiatives into testicular organogenesis and physiology in vitro.

Here, four methods for generating testicular organoids from primary neonatal murine testicular cells are described i.e., extracellular matrix (ECM) and ECM-free 2D and 3D culture environments. These techniques have multiple research applications and are especially useful for studying testicular development and physiology in vitro.

Geração extra-baseada em matriz celular e extra-celular livre de organoides testiculares de murina

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. Differentiation of germ cells takes place in the cytoplasmic pockets of somatic Sertoli cells that host 4 to 5 generations of germ cells simultaneously and coordinate and synchronize their development. Therefore, the composition of germ cell types within a cross-section is constant, and these cell associations are also known as stages (I&#8211;XII) of the seminiferous epithelial cycle. Importantly, stages can also be identified from intact seminiferous tubules based on their differential light absorption/scatter characteristics revealed by transillumination, and the fact that the stages follow each other along the tubule in a numerical order. This article describes a transillumination-assisted microdissection method for the isolation of seminiferous tubule segments representing specific stages of mouse seminiferous epithelial cycle. The light absorption pattern of seminiferous tubules is first inspected under a dissection microscope, and then tubule segments representing specific stages are cut and used for downstream applications. Here we describe immunostaining protocols for stage-specific squash preparations and for intact tubule segments. This method allows a researcher to focus on biological events taking place at specific phases of spermatogenesis, thus providing a unique tool for developmental, toxicological, and cytological studies of spermatogenesis and underlying molecular mechanisms.

This protocol describes transillumination-assisted microdissection of segments of adult mouse seminiferous tubules representing specific stages of seminiferous epithelial cycle, and cell types therein, and subsequent immunostaining of squash preparations and intact tubule segments.

Dissecção assistida por transilluminação de etapas específicas do ciclo epitelial seminifero do rato para análises de imunostaining a jusante

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Neurociência

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Biologia

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos

Resumo

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Usando

Identificação, caracterização histológica e dissecação dos lobos da próstata do rato para em Vitro Spheroid 3D modelos de cultura

Imagem tridimensional de organoides para estudar a ciliogênese primária durante a organogênese ex vivo

Imagem tridimensional de organoides para estudar a ciliogênese primária durante a organogênese ex vivo

Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

Geração extra-baseada em matriz celular e extra-celular livre de organoides testiculares de murina

Dissecção assistida por transilluminação de etapas específicas do ciclo epitelial seminifero do rato para análises de imunostaining a jusante

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária