Este trabalho foi apoiado por subsídios da Academia da Finlândia [315948, 314387 a N.K.]; Fundação Sigrid Jusélius [para N.K., J.T.]; Fundação Emil Aaltonen [para J.-A.M., T.L.]; Programa de Doutorado em Medicina Molecular de Turku [S.C.-M., O.O.].

A manutenção de ratos de laboratório e todos os experimentos animais foi feita de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes para o cuidado e uso de animais de laboratório na Universidade de Turku.
1. Preparação de túbulos seminiferos para microdisseção
<ol><li>Sacrifique um camundongo adulto (≥8 semanas de idade, teste 80-120 mgs dependendo da cepa e idade) via asfixia de CO2 seguida de deslocamento cervical. NOTA: O rato deve ser sexualmente maduro, e de preferência com pelo menos 8 semanas de idade. O padrão de transilluminação de camundongos juvenis difere do adulto porque a onda do epitélio seminifero ainda não foi totalmente estabelecida, e o tempo da primeira onda de espermatogênese é distinto21,22. A falta de espermatozoides alongados em camundongos machos de 4 semanas de idade impede seu uso para microdisseção assistida por transilluminação. Todas as cepas de camundongos que têm espermatogênese normal podem ser usadas.</li>
	<li>Pulverize o abdômen ventral com 70% de etanol. Abra a cavidade abdominopela usando uma tesoura estéril, fazendo uma abertura em forma de V.</li>
	<li>Puxando a almofada de gordura epidídil com fórceps estéreis, localize os testículos, disseque-os usando uma tesoura e coloque-os em uma placa de Petri estéril de 100 mm contendo PBS. NOTA: Para manter a esterilidade, certifique-se de que todos os labware e ferramentas cirúrgicas estejam estéreis.</li>
	<li>Usando tesouras finas decapsulam os testículos cortando uma fenda na tunica albuginea, a folha fibrosa grossa encapsulando o testículo. Em seguida, rasgar a tunica aberta usando um par de fórceps. Force os túbulos para fora pressionando com fórceps e descarte a tunica. NOTA: Ao descartar a tunica, pode ser benéfico para algumas aplicações a jusante que arteria testicularis seja removida juntamente com a tunica. Evite danificar os túbulos seminiferos.</li>
	<li>Mova os túbulos seminiferos para uma nova placa de Petri e despeje PBS estéril suficiente para cobrir o fundo da placa de Petri. Em seguida, puxe suavemente os túbulos, mas evite danificar os túbulos. NOTA: Muito estresse mecânico afetará o padrão de transilluminação e afetará a viabilidade do tecido e sua arquitetura celular. Os túbulos também podem ser processados para imunostainings de montagem inteira a partir deste ponto sem encenação (3B). Às vezes é suficiente definir o estágio retrospectivamente, incluindo anticorpos contra proteínas expressas na diferenciação de espermatogógonas, como SALL4, c-KIT e DNMT3A18,23. A densidade da espermatogonia é um indicador de estágio relativamente confiável(Figura 2).</li>
</ol>2. Microdisseção assistida por transilluminação
<ol><li>Coloque a placa de Petri sob um microscópio de dissecção firmemente, gravando-a no palco. NOTA: É importante gravar bem a placa de Petri para evitar seu movimento que poderia causar a mistura dos segmentos de túbulos seminiferos coletados.</li>
	<li>Para revelar o padrão de absorção de luz dos túbulos seminiferos em foco, certifique-se de que a amostra esteja iluminada de baixo e a luz passe pela amostra,ou seja, é transilluminada. NOTA: A quantidade de luz absorvida/dispersa é relativa ao nível de condensação de cromatina em espermatóides alongados e seu agrupamento dentro do túbulo seminifero: quanto mais condensado, mais luz é absorvida, ou seja,mais escura parece mais escura.</li>
	<li>Conheça o padrão de absorção de luz de diferentes estágios, conforme descrito na Figura 2, Figura 5A e Figura S1, movendo cuidadosamente feixes de túbulos usando fórceps finos. NOTA: Os estágios sempre seguem-se em uma ordem lógica, formando a onda de epitélio seminifero. No entanto, é importante saber que a direção da onda espermatogênica ocasionalmente se inverte e depois volta novamente (também conhecida como modulações4,9 ), àsvezescomplicando o procedimento. Além disso, o comprimento de cada etapa, em termos de quantos mm de túbulo, varia consideravelmente.</li>
	<li>Levante cuidadosamente o túbulo de interesse usando fórceps com ponta fisada e, em seguida, corte um segmento de comprimento apropriado usando uma tesoura de microdisseção (ver Vídeo Suplementar 1). Um gancho na ponta dos fórceps facilita o levantamento e a segurando um túbulo e ajuda a evitar espremê-lo. NOTA: O comprimento dos segmentos a serem cortados depende de aplicações a jusante. Para a coleta de pedaços de túbulos agrupados de um estágio específico para análise de proteína ou RNA12,13 (II-V, VII-VIII e IX-XI, Figura 5B) o comprimento é tipicamente de 2-5 mm. Quando a extração padrão de fenol-clorofórmio é usada, cerca de 200 ng de RNA podem ser derivados de 1 mm de túbulo. Para a coloração total dos segmentos de túbulos encenados, o comprimento dos segmentos deve ser de >5 mm. Para preparações de abóbora, o comprimento dos segmentos não deve exceder de 1 a 2 mm porque as células no meio do segmento podem não sair se for muito longo. Use uma balança mm sob a placa de Petri para uma medição precisa do comprimento do túbulo.</li>
</ol>3. Imunostaining de diferentes preparações
<ol><li>Preparação de abóbora: verificação de etapa e imunostaining NOTA: As peças de túbulos específicas do estágio podem ser esmagadas em um slide de microscópio com um vidro de cobertura para realizar análise morfológica de células vivas por microscopia de contraste de fase e imunostaining subsequente. Recomenda-se que um iniciante use esta abordagem para verificar as etapas ao se familiarizar com o método de microdissecção assistido pela transilluminação.<ol>
<li>Colete o segmento em um volume de 10 μL usando uma pipeta e mova-o para um slide de microscópio.</li>
		<li>Esmague o túbulo colocando um copo de cobertura (20 mm x 20 mm) cuidadosamente no túbulo. Como resultado, as células fluirão para fora do túbulo e formarão uma monocamada de célula viva. Coloque um papel filtro na borda do vidro de cobertura para facilitar a disseminação das células. Evite esmagar as células demais para mantê-las vivas.</li>
		<li>Monitore célula se espalhando sob um microscópio. Use um microscópio de contraste de fase em 40x objetivo para verificar o reconhecimento de estágio examinando os tipos de células presentes (Figura 2, Figura S2).</li>
		<li>Uma vez que as células tenham se espalhado para formar uma monocamada redonda de ambas as extremidades do túbulo, mergulhe o slide em um recipiente contendo nitrogênio líquido enquanto segura-o com fórceps. Mantenha-o submerso por 10 s. Alternativamente, coloque o slide em uma placa de gelo seca para congelar.</li>
		<li>Remova o vidro da tampa, desligando-o usando um bisturi.</li>
		<li>Sem demora, proceda com a fixação e coloque rapidamente o deslizamento em um recipiente com 90% de etanol por 2-5 min. NOTA: Certifique-se de que a preparação da abóbora não descongele antes de colocá-la em 90% de etanol. Outros fixativos também podem ser usados, como acetona, por 10 minutos.</li>
		<li>A seco ao ar e armazena à temperatura ambiente (RT) (até alguns dias) ou a -80 °C (longo prazo).</li>
		<li>Para imunostaining, pós-fixar as amostras em 4% de paraformaldeído (PFA) por 10 min na RT.</li>
		<li>Enxágüe em PBS e permeabilize com Triton X-100 de 0,1% em PBS por 5 min.</li>
		<li>Enxágüe em PBS e desenhe um anel de graxa em torno de cada amostra de abóbora.</li>
		<li>Adicione 50-100 μL de 10% BSA (albumina de soro bovino) em 0,1% Tween em PBS (PBST) dentro do anel de graxa e bloco amostras por 30 minutos na RT.</li>
		<li>Remova a solução BSA e incuba com um anticorpo primário diluído em 10% de BSA em PBST por 1 h no RT.</li>
		<li>Lave 3x por 5 min com PBST.</li>
		<li>Incubar com um anticorpo secundário diluído em 10% de BSA em PBST. NOTA: Para manchar os acroosos, as amostras podem ser incubadas com anticorpo de aglutina de amendoim rotulado por Rhodamina (PNA, 1:1000) em 10% BSA em PBST por 1 h na RT(Figura S3) em vez de anticorpos primários e secundários específicos.</li>
		<li>Lave 3x por 5 min cada com PBST, enxágue com PBS e monte com um montador contendo DAPI.</li>
	</ol></li>
	<li>Imunostaining integral de túbulos seminiferos NOTA: O protocolo abaixo descreve a coloração de montagem total para os segmentos de túbulos encenados (a partir da etapa 2.4). Se um pesquisador quiser realizar coloração de montagem integral sem encenação (a partir da etapa 1.5), preste atenção às notas em 3.2.1 e 3.2.7.<ol>
<li>Usando uma pipeta, transfira os segmentos de túbulos (da etapa 2.4) em PBS gelado para um tubo cônico de 15 mL e permita-lhes sedimentar no gelo. NOTA: Se usar túbulos não encenados a partir de 1,5., separe os túbulos em uma placa de Petri, pipetting para cima e para trás em uma placa inclinada várias vezes. Use uma pipeta de 1 mL com uma ponta de corte. Esta etapa visa abrir a estrutura do tecido. No entanto, evite muita tubulação, pois pode danificar os túbulos. A sedimentação dos túbulos levará algumas dezenas de segundos. Pequenos fragmentos de túbulos, células intersticiais e detritos celulares permanecem no supernante.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o supernatante (SN) por pipetação ou com um aspirador. Adicione 10 mL de PBS gelado e misture por inversão.</li>
		<li>Deixe sedimentar e, em seguida, remova o SN como antes.</li>
		<li>Adicione 5 mL de 4% PFA e fixe por 5h em uma mesa rotativa (20-30 rpm) a +4 °C. NOTA: O tempo de fixação depende das proteínas de interesse e de sua localização subcelular. Para proteínas nucleares e citoplasmáticas, uma fixação de 2 h é tipicamente suficiente, no entanto, marcadores de membrana, como GFRα1 (receptor da família GDNF alfa 1; Figura 6A,B), beneficiar de uma fixação mais longa, até 6 h.</li>
		<li>Deixe sedimentar, remova o SN (PFA) como antes e enxágue brevemente adicionando 10 mL de PBS e invertendo o tubo.</li>
		<li>Deixe sedimentar, remova o SN como antes e repita a etapa de lavagem do PBS três vezes por pelo menos 10 minutos cada em uma mesa rotativa a +4 °C e continue com a coloração ou armazene a +4 °C. NOTA: Se as condições de trabalho forem estéreis e limpas, as amostras podem ser armazenadas e usadas por pelo menos algumas semanas. Alternativamente, adicione azida de sódio a uma concentração final de 0,02% (c/v) de uma solução de estoque de 2% para ajudar a preservar os túbulos antes de armazenar a +4 °C.</li>
		<li>Usando uma pipeta de 1 mL, mova 10-20 segmentos de túbulos fixos para um tubo de fundo redondo de 2 mL. Deixe sedimentar e remova o SN. NOTA: Se trabalhar com túbulos longos que não foram encenados, despeje os túbulos em uma placa de Petri e usando tesouras de microdisseção e segmentos de corte de fórceps de cerca de 5 a 20 mm. Segmentos muito longos se emaranharão durante o procedimento de coloração, enquanto segmentos muito curtos são facilmente perdidos.</li>
		<li>Adicione 1 mL de 2% BSA + 10% FBS (soro bovino fetal) em 0,3% Triton X-100 em PBS (PBSX). Bloqueie por pelo menos 1h em uma mesa rotativa (20-30 rpm) no RT.</li>
		<li>Enxágüe com 1 mL de PBSX, remova o SN por pipetação e adicione 250 μL de anticorpo primário diluído em 1% de BSA em PBSX (1:100-1:2000 diluição). Incubar por 2 h no RT ou durante a noite a +4 °C em uma mesa rotativa (20-30 rpm).</li>
		<li>Remova a solução de anticorpos por pipetação e enxágue os túbulos com 1 mL de PBSX como acima. Lave três vezes por 1h em PBSX em uma mesa rotativa (20-30 rpm) no RT. NOTA: Após esta primeira lavagem, a amostra pode ser deixada durante a noite a +4 °C, se necessário.</li>
		<li>Remova o SN e adicione 250 μL de anticorpo secundário diluído em 1% de BSA em PBSX (tipicamente diluição de 1:500 de um anticorpo rotulado fluorescente). Cubra em papel alumínio e incuba em uma mesa rotativa (20-30 rpm) no RT por 1h.</li>
		<li>Repita 3.2.10.</li>
		<li>Por fim, remova o SN e despeje os túbulos em um slide de microscópio. Separe suavemente e organize os túbulos em tiras lineares usando pontas de carregamento de gel. Escorra o excesso de tampão e adicione o meio de montagem e uma mancha de cobertura. NOTA: Evite secar os túbulos enquanto os organiza. A contra-coloração dos núcleos com DAPI não é necessária na maioria dos casos. Sele a borda da tampa com esmalte para evitar a secagem e a deterioração da amostra. Os slides podem ser armazenados por 1-2 semanas a +4 °C antes da imagem.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology:+Seminiferous+Cycle.">Testis Physiology: Seminiferous Cycle.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Oakberg, E. 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Os autores não têm nada a revelar.

O método de microdissecção assistido pela transilluminação que descrevemos acima permite uma abordagem orientada para o estágio para o estudo da espermatogênese. A espermatogênese é um processo altamente sincronizado, e todas as etapas-chave durante a diferenciação espermatogênica são reguladas e executadas de forma dependente de etapas, como comprometimento de diferenciação (nas etapas VII-VIII), início da meiose (VII-VIII), divisões meioticas (XII), início de alongamento esperscopado (VIII) e espermicidade (VIII)1,26,27. A análise orientada ao palco fornece uma ferramenta poderosa para estudar esses eventos particulares que se restringem a etapas específicas da espermatogênese e, portanto, encontradas apenas em estágios definidos do ciclo epitelial seminiferous. Dominar o método requer alguma prática e o uso de um microscópio de dissecção de boa qualidade e condições de iluminação adequadas são fundamentais para o sucesso. Implementar este método como parte do kit de ferramentas cotidiana tem a capacidade de melhorar muito o impacto e a relevância biológica da pesquisa sobre funções reprodutivas masculinas, permitindo uma dissecção mais precisa de eventos moleculares durante a espermatogênese.
Todas as cepas de camundongos WT que estudamos exibem um padrão de transilaminação semelhante e exibem associações celulares conservadas em estágios do ciclo epitelial seminiferous. Na condição de que a diferenciação espersiogênica das células germinativas não seja grosseiramente diferente dos camundongos WT, o mesmo também se aplica a todos os modelos de camundongos eliminados que estudamos. Além disso, pode ser aplicado a outras espécies que exibem arranjo segmentar longitudinal de etapas do ciclo epitelial seminifero7. No entanto, espécies com estágios não segmentais (como o humano) não podem ser utilizadas. Dado o papel essencial da condensação da cromatina na alongamento dos espermatóides na definição do padrão de transilluminação, é evidente que qualquer má regulação desse processo inevitavelmente implicará na implementação deste método. Em camundongos juvenis e adultos jovens (5-6 semanas) o padrão de transilluminação ainda não foi totalmente estabelecido e, portanto, apenas camundongos com mais de 8 semanas devem ser usados. Também é importante ter em mente que apertar e puxar os túbulos inevitavelmente implicará no padrão de transilluminação porque distorce a arquitetura celular dentro do epitélio seminiferous.
Os segmentos isolados de túbulos seminiferos também podem ser cultivados permitindo a observação ex vivo e a manipulação de processos acoplados à espermatogênese, incluindo a meiose. Para garantir a viabilidade do tecido e para evitar a degradação do RNA e da proteína, as amostras devem ser coletadas e processadas no máximo 2 horas após o sacrifício do camundongo. Para a cultura ex vivo de túbulos seminiferos, o tempo do sacrifício ao início da cultura não deve exceder 1 hora. A integridade dos fragmentos de túbulos pode normalmente ser mantida até 72 horas in vitro se colhida corretamente.
O estágio do ciclo epitelial seminifero pode ser verificado e ainda mais precisamente definido utilizando microcopia de contraste de fase das preparações de abóbora16. A microscopia é realizada em células vivas, o que fornece uma dimensão adicional na análise e permite a observação de organela ou movimentos celulares em estágios específicos de espermatogênese28,29,30. A microscopia de contraste de fase fornece um estágio exato para a imunossuagem subsequente, que permite uma análise muito detalhada da expressão proteica e da dinâmica de localização durante a espermatogênese, incluindo alterações específicas do estágio.
Enquanto as células são liberadas do contexto epitelial em preparações de abóbora, imunossuagens de montagem total de segmentos de túbulos permitem o estudo de células espermatogênicas em seu ambiente fisiológico. Portanto, os preparativos de montagem inteira podem fornecer uma melhor visualização da arquitetura do túbulo seminiferante e seus contatos intercelulares do que imunostaining em seções transversais. É importante ressaltar que a encenação assistida pela transilação dos segmentos de túbulos antes da imunossuagem torna a abordagem ainda mais poderosa, incluindo informações sobre o estágio específico de um determinado segmento. A coloração de montagem total é uma ferramenta particularmente útil para o estudo de células na periferia de túbulos seminiferos, como células myoid peritubulares, macrófagos peritubulares e espermatogonia, mas também pode abrir novas percepções sobre pesquisas sobre células germinativas médias e pós-meióticas.

A diferenciação das células germinativas masculinas da espermatogonia diploide para a espermatozoide haploide madura, ou seja,a espermatogênese, é um processo complexo que ocorre no epitélio dos túbulos seminiferos nos testículos de um indivíduo sexualmente maduro1. Descendentes mitóticos da espermatogonia A1 primeiro dividem-se cinco vezes para expandir a população comprometida com a diferenciação, em seguida, entram em meiose como espermatocitotas que, em última análise, dão origem a espermatoides haploides. A diferenciação de espermatozoides redondos em espermatozoides, ou seja,espermagênese, envolve mudanças complexas na morfologia celular, incluindo compactação nuclear e construção de estruturas específicas de esperma, como o acrossomo e o flagelo. No camundongo, todo o processo de espermatogênese leva 35 dias para completar2,3.
Em qualquer local, o epitélio seminifero hospeda até cinco coortes de células germinativas diferenciadoras, além das células germinais/progenitoras e as células somáticas sertoli1. As células germinativas diferenciadoras formam camadas concêntricas da composição da qual é previsível, e as células haploides em um dado passo de desenvolvimento sempre associam-se a certos tipos de espermatotocrócitos e espermatogonia4,5. Portanto, qualquer seção transversal de um túbulo hospeda coortes de células germinativas de uma composição constante. Essas associações celulares específicas são definidas como os estágios do epitélio seminifero. Os estágios em si não apresentam estados estagnados como pontos de verificação, mas desenvolvem-se continuamente à medida que a diferenciação das coortes de células germinativas progride em sincronia1,2,6. Em camundongos, existem 12 estágios (I-XII)2 que são dispostos de forma segmental ao longo do eixo longitudinal do túbulo seminifero, e seguem-se em uma ordem lógica formando assim a onda de epitélio seminifero, ou onda espermatogênica7,8,9 (Figura 1). A conclusão da espermatogênese leva quatro ciclos, e camadas hierárquicas ou coortes de células germinativas diferenciadas dentro de qualquer seção transversal de túbulo seminiferou são temporalmente um ciclo seminiferous separados um do outro. O comprimento do ciclo é dependente de espécies e no camundongo cada ciclo leva 8,6 dias10.
Os estágios podem ser identificados com base na composição celular e organização do epitélio seminifero nas seções de testítio histológico5 (Figura 1 e Figura 2). No entanto, a análise histológica é trabalhosa, demorada e requer fixação e coloração, e não pode, portanto, ser aplicada ao tecido vivo. É importante ressaltar que o estadiamento também pode ser realizado em tecido vivo sob um microscópio de dissecção, aproveitando padrões distintos de absorção/dispersão de luz exibidos por diferentes estágios do ciclo(Figura 2). A capacidade de cada estágio de absorver e dispersar a luz é relativa ao nível de condensação de cromatina de espermatâmicos pós-meioticos tardios que qualquer estágio hospeda e a embalagem dessas células em feixes7,11. A diferenciação de espermatozoides, ou seja,a espermagogênese, é ainda dividida em 16 etapas de desenvolvimento, incluindo 8 passos de espermatização redonda (passo 1-8) e 8 passos de alongamento da espermicidade (passos 9-16) de diferenciação(Figura 1). Os espermatozoides alongados do passo 9-11 (estágio IX-XI) exibem apenas um baixo nível de condensação de cromatina, resultando em baixa quantidade de luz sendo absorvida. A condensação da cromatina começa na etapa 11 de espermatozoides (estágio XI), e os espermatóides alongados do passo 15-16 (estágio IV-VIII) contêm cromatina totalmente condensada e, portanto, exibem absorção máxima de luz(Figura 3). A cromatina precisa ser condensada para ser bem embalada na cabeça do esperma. Fatores adicionais que contribuem para o padrão de absorção de luz são a localização de espermatozoides alongados dentro do epitélio (basal vs. apical) e agrupamento de espermatóides alongados (pronunciados nos estágios II-V)11 (Figura 3). Os feixes são vistos como pontos no meio dos túbulos e como listras nas bordas sob um microscópio de dissecção e quanto mais condensado a cromatina, mais escura a mancha/listra11.
Este artigo descreve o uso do método de microdisseção assistido pela transilação para o isolamento de segmentos de túbulos seminiferos representando estágios específicos do ciclo epitelial seminifero. Uma vez isolados, os segmentos de túbulos encenados podem estar sujeitos a diversas análises a jusante, incluindo análises bioquímicas de RNA e proteínas12,13,14,15,citometria de fluxo16,cultura do túbulo ex vivo 17 e imunostaining18. Aqui também fornecemos protocolos detalhados a jusante para preparar monocamadas esmagadas de segmentos de túbulos encenados para análise morfológica de células vivas e imunostainings subsequentes, bem como imunostainings de montagem inteira de segmentos de túbulos. O fluxo de trabalho em poucas palavras descrita na Figura 4.
O método de microdisseção assistido pela transilluminação permite identificação e isolamento precisos de células germinativas em etapas específicas de diferenciação graças à composição celular sincronizada dos estágios. É importante ressaltar que também permite o estudo de eventos dependentes de estágio durante a espermatogênese no tecido vivo. Dada a falta de modelos in vitro escaláveis para espermatogênese, este método também tem uma vantagem única de permitir estudos de desenvolvimento e toxicológicos direcionados a curto prazo em segmentos de túbulos específicos do palco ex vivo12,17. Embora descrevamos o método aqui para o camundongo, o mesmo procedimento pode ser aplicado a qualquer espécie de mamífero com arranjo longitudinal e segmental de estágios epiteliais seminiferosos, como o rato4,7,15,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glass 20x20 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon conical tube 15-ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grease pen (ImmEdge)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide Superfrost Plus</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100-mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11503387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses

A espermatogênese é um processo de diferenciação único que, em última análise, dá origem a um dos tipos celulares mais distintos do corpo, o espermatozoide. A diferenciação das células germinativas ocorre nos bolsões citoplasmáticos de células somáticas de Sertoli que hospedam de 4 a 5 gerações de células germinativas simultaneamente e coordenam e sincronizam seu desenvolvimento. Portanto, a composição dos tipos de células germinativas dentro de uma seção transversal é constante, e essas associações celulares também são conhecidas como estágios (I-XII) do ciclo epitelial seminiferous. É importante ressaltar que os estágios também podem ser identificados a partir de túbulos seminiferos intactos com base em suas características diferenciais de absorção/dispersão de luz reveladas pela transilação, e o fato de que os estágios se seguem ao longo do túbulo em uma ordem numérica. Este artigo descreve um método de microdissecção assistido pela transilação para o isolamento de segmentos de túbulos seminiferos representando estágios específicos do ciclo epitelial seminifero do rato. O padrão de absorção de luz de túbulos seminiferos é primeiro inspecionado sob um microscópio de dissecção, e, em seguida, segmentos de túbulos representando estágios específicos são cortados e usados para aplicações a jusante. Aqui descrevemos protocolos de imunossuagem para preparações de abóbora específicas para o estágio e para segmentos de túbulos intactos. Este método permite que um pesquisador se concentre em eventos biológicos que ocorrem em fases específicas da espermatogênese, fornecendo assim uma ferramenta única para estudos de desenvolvimento, toxicológicos e citológicos de espermatogênese e mecanismos moleculares subjacentes.

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Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Este protocolo descreve a microdisseção assistida pela transilação de segmentos de túbulos seminiferos adultos representando estágios específicos do ciclo epitelial seminiferante, e tipos de células, e posterior imunossuagem de preparações de abóbora e segmentos de tubulações intactas.

Dissecção assistida por transilluminação de etapas específicas do ciclo epitelial seminifero do rato para análises de imunostaining a jusante

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

transillumination-assisted-dissection-specific-stages-mouse

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6.8K visualizações.  University of Turku, Turku, Finland. Este protocolo descreve a microdisseção assistida pela transilação de segmentos de túbulos seminiferos adultos representando estágios específicos do ciclo epitelial seminiferante, e tipos de células, e posterior imunossuagem de preparações de abóbora e segmentos de tubulações intactas.

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Passo-específico Seleção de mouse Espermátides por citometria de fluxo

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Isolamento de rato Endometrial epiteliais e estromais para células<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

Gravação de grampos-grampo de células inteiras de células epiteliais primárias isoladas do epidídimo

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissecção e cultura do rim embrionário do rato

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate embryonic origins and functions &#8212; the neurohypophysis and the adenohypophysis. The developing mouse pituitary gland is tiny and delicate with an elongated oval shape. A coronal section is preferred to display both the adenohypophysis and neurohypophysis in a single slice of the mouse pituitary.
The goal of this protocol is to achieve proper pituitary coronal sections with well-preserved tissue architectures from developing mice. In this protocol, we describe in detail how to dissect and process pituitary glands properly from developing mice. First, mice are fixed by transcardial perfusion of formaldehyde prior to dissection. Then three different dissecting techniques are applied to obtain intact pituitary glands depending on the age of mice. For fetal mice aged embryonic days (E) 17.5 - 18.5 and neonates up to 4 days, the entire sella regions including the sphenoid bone, gland, and trigeminal nerves are dissected. For pups aged postnatal days (P) 5 - 14, the pituitary glands connected with trigeminal nerves are dissected as a whole. For mice over 3 weeks old, the pituitary glands are carefully dissected free from the surrounding tissues. We also display how to embed the pituitary glands in a proper orientation by using the surrounding tissues as landmarks to obtain satisfying coronal sections. These methods are useful in analyzing histological and developmental features of pituitary glands in developing mice.

We present a protocol to dissect pituitary glands and prepare pituitary coronal sections from developing mice.

Dissecação e preparação Coronal fatia de desenvolver Mouse hipófise

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Uma técnica de Squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de Mouse

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Análises de célula única Transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

Preparo tecidual e imunocoloração de tecidos craniofaciais do camundongo e osso não-descalcificado

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

Isolação e mancha de keratinocytes da pele do rato para a análise específica do ciclo de pilha da expressão celular da proteína pela citometria maciça

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

Dissecção, cultura e análise de células da crista neural craniana primária do mouse para o estudo de delaminação e migração de células de crista neural

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...