Este trabalho foi financiado pela Fundação Ciência Israel.

I. Projetar um sistema de expressão de levedura para Effectors Tipo III Calibrar um sistema de levedura apropriadas para a expressão do tipo III efetoras (s) de interesse é uma tarefa importante e pode exigir algumas tentativas e erros. Fatores de maior relevância que devem ser considerados e otimizados ao projetar um sistema desse tipo são: 1) o promotor de condução expressão do efetor (s), 2) o número de cópias do gene efetor, 3) a tag epítopo usado para verificar a expressão da proteína e 4) a cepa de levedura. 1 Promotora) Porque effectors tipo bacteriana III pode ser tóxico para células de levedura, um promotor induzível deve ser usado para controlar sua expressão. O promotor GAL1 é comumente utilizado para este fim e sua atividade é regulada pela fonte de carbono presente no meio de crescimento: é reprimido por glicose e induzida por galactose. No entanto, este promotor foi relatado como um pouco de fuga em condições repressão, resultando em toxicidade indesejada. Se um problema semelhante é encontrado, é aconselhável para minimizar o número de cópias do gene efetor como descrito abaixo, ou para usar promotores induzíveis alternativos, como o MET3 ou CUP1 promotores 1. Aqui nós descrevemos os procedimentos para expressar proteínas efetoras de um promotor induzível galactose. 2) Gene no número de cópias Um parâmetro adicional que afetam o nível de expressão da proteína é o número de cópias do gene efetoras presentes na célula. Níveis de expressão de alta são alcançadas quando o gene efetor é carregado por um. Dois micro-plasmídeo (40-60 cópias por célula) Expressão intermediária é obtida através de um centrômero contendo plasmídeo (03/01 cópias por célula), enquanto a baixa expressão é alcançado quando o gene efetor é integrado no genoma da levedura por recombinação homóloga. Através da combinação de um vetor contendo centrômero eo promotor GAL1 temos expressa com sucesso cerca de 50 efetores da planta patógenos Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria e Pseudomonas syringae pv. Tomate em níveis detectáveis ​​pela análise de immunoblot e com fuga desprezível em condições reprimindo (Salomon e Sessa , não publicado). 3) tag Epitope Se os anticorpos contra o efetor de interesse não estão disponíveis, uma tag epitopo é fundida com a proteína efetora para monitorar a sua expressão por immunoblot. Tags comumente utilizados são Myc, a hemaglutinina (HA) ou da bandeira, ao qual confiável anticorpos comerciais estão disponíveis. Sugerimos o uso de apenas uma cópia do tag para minimizar indesejados efeitos deletérios sobre a estrutura e atividade da proteína efetora. 4) cepa de levedura Um requisito fundamental para a cepa de levedura a ser utilizada para expressão é auxotrophy ao marcador selecionável do vetor de expressão. É importante notar que diferentes cepas de leveduras pode apresentar diferentes sensibilidades à expressão de certos efetores. Por exemplo, observamos que a BY4741 e W303 cepas têm sensibilidades diferentes a diversos Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria efetores (Salomon e Sessa, inédito). Portanto, é preferível para testar o efetor (s) de interesse em diferentes cepas de leveduras. II. Preparação de meios Yeast Para o crescimento de cepas de levedura que não contém qualquer vector, use YPD (10 g de extrato de levedura / L, 20 g / L de peptona e 2% [w / v] glucose) como meio de crescimento. Para meios sólidos, adicionar 2% [w / v] agar para a solução (se o meio sólido é muito macia, adicione 0,05% [v / v] a partir de uma solução estoque 5 N NaOH ao meio antes da autoclavagem). Recomendamos preparar o meio sem glicose em 90% do volume final e autoclavagem-lo. Pouco antes do uso, encher o volume a 100% com um filtro esterilizadas 20% de solução de glicose [w / v] (manter a solução de glicose a 20% a 4 ° C para evitar a contaminação). Para o crescimento de cepas de levedura contendo um vetor que fornece prototrophy a um marcador selecionável (leucina, histidina uracil, ou triptofano), uso médio de abandono sintética sem leucina, histidina uracil e triptofano (6,7 g / L base nitrogenada de levedura sem aminoácidos , 1,4 g de levedura / L sintéticos drop-out suplemento médio) e contendo 2% [w / v] glicose, ou 2% [w / v] galactose e 1% [w / v] rafinose. Para meios sólidos, adicionar 2% [w / v] agar para a solução. Recomendamos preparar o meio em 90% do volume final e autoclavagem-lo. Pouco antes do uso, encher o volume para 100%, com uma solução de glicose, esterilizada por filtração de 20%, ou uma galactose, esterilizada por filtração de 20% + solução de rafinose 10%, dependendo da fonte de carbono desejado (manter a glicose a 20% e os 20% galactose + soluções rafinose 10% a 4 ° C para evitar a contaminação). Dependendo do marcador selecionável do vec expressãotor, adicione os outros aminoácidos ou uracil antes de usar (10 ml / L de um 1 g/100 ml leucina estoque, 10 ml / L a partir de um estoque uracil 200 mg/100 ml, 2 ml / L de um 1 g/100 ml de caldo de histidina, ou 2 ml / L de um g/100 ml um estoque triptofano). Ao preparar ações leucina e uracila, esterilizá-las em autoclave e manter a temperatura ambiente. Ao preparar ações histidina e triptofano, esterilizá-los através da filtragem, embrulhe a garrafa com folha de alumínio para proteger da luz, e manter a 4 ° C. Nos procedimentos descritos a seguir, média de abandono sintético suplementado com leucina, histidina uracil e triptofano é designado como meio completo sintético. Solid-media placas podem ser armazenadas por até dois meses a 4 ° C. Antes do uso, secar as placas por 20 min em uma capa de fluxo laminar estéril à temperatura ambiente. III. Transformação de levedura <ol><li> Antes de iniciar o processo de transformação do fermento, preparar as três soluções seguintes: 50% [w / v] polietileno glicol (PEG) 3350 solução, uma solução 1 M pH = 8,0 LiAc, e uma solução de TE (100 mM Tris pH = 6,85 e 10 mM EDTA pH = 8,0). Filtro de esterilizar as soluções e manter a 4 ° C. </li><li> Usando uma haste longa de madeira ou um loop de inoculação estéril, escolher uma colônia de levedura (1-2 mm de diâmetro) de um prato fresco e inocular 3 ml de YPD em um tubo de polipropileno de 15 ml. Brevemente Vortex. Coloque o tubo de cultura em um rolo e incubar durante a 30 ° C com rotação constante. </li><li> De manhã, retire a cultura do rolo e centrifugar a 800 g por 5 min à temperatura ambiente. Após a centrifugação, remover completamente o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em um buffer de ressuspensão ml (10% [v / v] TE solução, 10% [v / v] 1 M solução LiAc) e misturar em vortex. </li><li> Para cada plasmídeo para ser transformada e uma transformação de controle adicionais, transferência de 100 ul da suspensão celular para um microtubo. </li><li> A cada tubo, adicionar 5 mL de um único filamento de DNA de esperma de salmão (10 mg / ml) e 250-500 ng de DNA plasmidial para ser transformado (exceto para o tubo de controle). </li><li> Adicione cuidadosamente a cada 650 mL de solução de tubo de transformação (10% [v / v] TE solução, 10% [v / v] 1 M solução LiAc, 80% [v / v] de 50% [w / v] solução de PEG ) e vortex. </li><li> Incubar a 30 ° C por 30 min em um rolo. </li><li> Remover os tubos do shaker, adicionar 70 mL de DMSO, e misturar por inversão dos tubos 10-15 vezes (não vortex para evitar a quebra das células). </li><li> Colocar os tubos em um banho de 42 ° C a água pré-aquecida e incubar por 15 min. </li><li> Remover os tubos do banho-maria e imediatamente colocá-los no gelo durante 2 min. </li><li> Uma vez que os tubos têm arrefecido, centrifugar para a 800 g por 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Pegue os tubos fora do microcentrífuga e remova cuidadosamente o sobrenadante viscoso com uma pipeta. </li><li> Ressuspender o pellet celular de cada tubo em 150 mL de água destilada estéril duplo (DDW), e espalhar a suspensão de células em um prato completo meio sintético contendo 2% de glicose como fonte de carbono e sem o aminoácido ou nucleotídeo para o qual fornece o plasmídeo prototrophy. </li><li> Deixar as placas abertas para 2 min e deixe secar em uma capela de fluxo laminar. Coloque as placas em um 30 ° C incubadora de 2-3 dias. </li><li> Colônias uma vez (1-2 mm de diâmetro) têm aparecido nas placas, escolher cerca de 10 colônias única de cada transformação e transferi-los para um prato fresco. Ao transferir as colônias, os patches 2 cm x 2 cm a permitir o crescimento de uma grande quantidade de células de levedura. Incubar as placas em estufa a 30 ° C por dois dias. </li><li> Quando as manchas de fermento ter crescido, retire as placas da incubadora e vedá-las com parafilme. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C. Transferência de colônias de um prato novo a cada 10-14 dias. </li></ol> IV. Preparando uma proteína de extrato de levedura para verificar Expressão Effector por Immunoblot <ol><li> Escolha uma colônia de levedura (1-2 mm de diâmetro) de uma placa nova para um tubo de polipropileno de 15 ml contendo 3 ml do meio sintético apropriado completo suplementado com 2% de glicose como fonte de carbono e sem o aminoácido ou nucleotídeo para o qual o plasmídeo de escolha fornece prototrophy. Coloque o tubo de cultura em um rolo e incubar durante a 30 ° C. </li><li> No dia seguinte, retire a cultura do rolo e centrifugar a 800 g por 5 min à temperatura ambiente. Remover os tubos da centrífuga e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o pellet celular em 3 ml de DDW estéril e misturar em vortex. </li><li> Centrifugar novamente, descartar células sobrenadante e ressuspender em 3 ml de DDW estéril. </li><li> Transferir 200 mL da suspensão de células para um tubo de 15 ml, contendo 3 ml de meio completo sintético suplementado com galactose e rafinose 2% 1% como fonte de carbono, e sem o aminoácido ou nucleotídeo para o qual o plasmídeo de escolha fornece prototrophy.Misturar em vortex, coloque em um rolo, e incubar durante a 30 ° C. </li><li> Na manhã seguinte, transferir 1 ml da cultura (ou mais para as culturas de baixa densidade) para um microtubo. Colher as células por centrifugação a 800 g por 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Daqui em diante, o trabalho em um exaustor para evitar respirar β-mercaptoetanol vapores tóxicos. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspender o pellet celular em 100 l de gelado solução de lise (4% [v / v] 5 N NaOH, 0,5% [v / v] β-mercaptoetanol). Misture vigorosamente em vortex e incubar no gelo por 30 min. </li><li> Durante a incubação, determinar o volume de HCl (6 N) necessário para titulação 100 l de tampão de lise de pH 9-10. Para este objectivo, colocar 10 microtubos em um rack e transferência de 100 l do tampão de lise em cada um deles. Adicionar vários volumes (1-10 L) de HCl (6 N) a cada tubo e misturar em vortex. Tomar uma amostra e verifique o pH da solução usando um filtro indicador de pH. </li><li> No final da incubação, adicionar o volume de HCl determinado na etapa anterior ao lisado e misturar em vortex (para melhor precisão, coloque a solução de HCl no lado do tubo sem inserir a ponta no lisado). </li><li> Adicionar 50 ul de tampão de amostra de 3x (30% [v / v] glicerol, 15% [v / v] β-mercaptoetanol, 37,5% [v / v] 500 mM Tris-HCl pH = 6,8, 0,15% [w / v ] sódio dodecil sulfato [SDS] e alguns grãos de azul de bromofenol) ao lisado e misturar em vortex (se a solução fica amarela, isso significa que o pH é muito baixo, e alguns microlitros de solução de lise deve ser adicionado até que a solução fica azul). </li><li> Ferva a solução lisado por 5 min em um bloco de aquecimento após a punção um furo na tampa do microtubo com uma agulha. </li><li> Remova o microtubo do bloco de aquecimento e deixar a solução esfriar por 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Vortex a solução lisado e depois girá-lo por 10 seg. Carga de 30 mL para um gel SDS-PAGE para análise immunoblot. </li></ol> V. Spotting Ensaio para detectar Effector induzida Fenótipos inibição do crescimento <ol><li> De uma placa de escolher uma nova colônia de levedura (1-2 mm de diâmetro) com o plasmídeo de expressão de interesse e inocular, em um tubo de polipropileno de 15 ml, 3 ml de meio completo sintético suplementado com 2% de glicose como fonte de carbono e sem o amino ácido ou de nucleotídeos ao qual a expressão plasmídeo fornece prototrophy. Repita o mesmo procedimento para uma cepa de levedura controle carregando um plasmídeo vazio. Coloque os tubos cultura em um rolo e incubar durante a 30 ° C com rotação constante. </li><li> No dia seguinte, retire as culturas do rolo e centrifugar a 800 g por 5 min à temperatura ambiente. Remover os tubos da centrífuga e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o pellet celular em 3 ml de DDW estéril e misturar em vortex. </li><li> Repita os passos de centrifugação e as células ressuspender em 3 ml de DDW estéril. </li><li> Para determinar a densidade óptica (DO), a transferência de 100 l de cada cultura para um microtubo contendo 900 mL e DDW vortex. Despeje o conteúdo dos tubos numa cuvete de plástico e medir a absorvância a um comprimento de onda de 600 nm (use como referência uma tina cheia com 1 ml de DDW). Calcular o OD 600 das culturas iniciais multiplicando o OD 600 das culturas na cuvete por um fator de diluição de 10. </li><li> Em seguida, com base na OD 600 das culturas iniciais, preparar suspensões de células (1 ml) com um OD 600 = 1,0 em microtubos estéreis. </li><li> Usando 3 microtubos estéreis preenchidos com 900 mL DDW estéril, prepare três de 10 diluições (OD 600 = 0,1, 0,01 e 0,001) de cada suspensão de células (OD 600 = 1,0), preparada no passo anterior. </li><li> Prepare duas placas contendo meio completo sintético sem o aminoácido ou nucleotídeo para o qual o plasmídeo de escolha fornece prototrophy. O meio de uma placa deve ser suplementada com 2% de glicose e que de outra placa com galactose e rafinose 2% 1%. Seca as placas em uma capa de fluxo laminar estéril, em temperatura ambiente por 20 min e coloque-os sobre uma grade. </li><li> Para cada cultura, 10 mL local a partir dos quatro diluições em uma fila em ambos os reprimir e induzindo mídia. </li><li> Depois de spotting, deixe as placas no capô aberto por vários minutos. Quando as manchas são seca, cobrir as placas e colocá-los em uma incubadora de 30 ° C por 2-3 dias. </li><li> Após a incubação, retire as placas e analisar o crescimento do fermento. Primeiro, confirme que a densidade de células são semelhantes na placa contendo meio de repressão. Então, comparar o crescimento da cultura expressando a proteína efetora de interesse com a cultura que leva um vetor vazio na placa contendo meio de indução. Nota: effectors pode ter como alvo processos celulares que não são limitante para o crescimento da levedura em condições de crescimento padrão de laboratório.Para permitir a identificação de fenótipos inibição do crescimento de efetores tais, a mídia induzindo podem ser complementados com compostos que alteram as funções celulares de leveduras, aumentando assim a sua sensibilidade aos efetores. Para uma lista de produtos químicos que podem, eventualmente, ser integrados neste procedimento, consulte a Parsons et al. (2004) 2. </li></ol> VI. Resultados representante A levedura representante spotting ensaio e detecção de fenótipos inibição de crescimento induzida por expressão de efetores tipo III são mostradas na figura. 1. Neste experimento, o tipo III effectors AvrPto, HopAA1-1 e AvrE1 do fitopatogênicos bactéria Gram-negativa Pseudomonas syringae pv tomate. (Pst) foram expressas a partir do centrómero pGML10 contendo plasmídeo na cepa de levedura BY4741, e testados quanto à capacidade para inibir o crescimento do fermento. Culturas de leveduras individuais expressando effectors Pst tipo III sob o controle do promotor induzível galactose GAL1 ou contendo um vetor vazio em série foram diluídos e semeados em reprimir (glicose) ou induzir (galactose) media (Fig. 1). Em reprimir médio, cepas de leveduras carregando plasmídeos para a expressão de AvrPto e HopAA1-1 apresentaram crescimento semelhante ao da estirpe do controlo contendo um vetor vazio. No entanto no mesmo meio, o fermento carregando AvrE1 exibido um crescimento um pouco menor, provavelmente relacionadas com algum grau de vazamento do promotor GAL1 e para o efeito citotóxico de alto AvrE1. Em condições de indução, expressão da efetoras AvrE1 causou um fenótipo inibição drástica o crescimento refletido pela falta de colônias em qualquer diluição. Como observado anteriormente por Munkvold et al. 3, expressão de HopAA1-1 também resultou em inibição severa do crescimento, enquanto AvrPto não mostraram qualquer efeito. <img src="/files/ftp_upload/1865/1865fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Inibição de crescimento causados ​​por leveduras expressão do pv syringae Pseudomonas tomate. (Pst) Tipo III effectors AvrE1 e HopAA1-1. Cepas de levedura (BY4741) contendo o plasmídeo pGML10, vazios ou carregando GAL1-driven cassetes para galactose induzível-expressão de AvrPto , HopAA1-1 ou AvrE1, foram cultivadas durante a noite em meio completo sintético suplementado com glicose (2%) como fonte de carbono, e sem leucina. Culturas foram lavadas, normalizada para OD 600 = 1.0 e de série de 10 diluições foram vistos em sintético completa falta de meios sólidos contendo leucina e glicose (2%) ou galactose (2%) e rafinose (1%). Fotografias foram tiradas depois de 2 e 3 dias de crescimento a 30 ° C para a levedura crescendo em glicose e galactose mídia, respectivamente.

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	<li>Siggers, K. A., Lesser, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae:+a+versatile+model+system+for+the+identification+and+characterization+of+bacterial+virulence+proteins.">The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins.</a> Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).</li><li>Parsons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways.">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li><li>Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+type+III+secretion+system+effector+repertoire+reveals+several+effectors+that+are+deleterious+when+expressed+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).</li><li>Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+tool+to+study+bacterial+effectors.">Yeast as a tool to study bacterial effectors.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).</li><li>Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomic+yeast+screen+to+identify+pathogenic+bacterial+proteins.">A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins.</a> PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).</li><li>Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+role+of+the+CopN+protein+in+Chlamydia+pneumoniae+intracellular+growth.">The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth.</a> Nature. 456, 112-115 (2008).</li></ol>

Nesta apresentação, ilustramos como usar o brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae como um sistema heterólogo para a expressão do tipo III bacteriana proteínas efetoras e como identificar efetoras induzida fenótipos inibição do crescimento. Importante, esses fenótipos podem ser utilizados em telas genéticos para identificar os supressores do impacto negativo sobre o crescimento de efetores levedura. Supressores pode representar tanto alvos diretos da efetoras estudadas ou proteínas que participa...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
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		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>212750</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Peptone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>211677</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>214010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>291940</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast synthetic drop-out medium supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Y2001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-galactose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G0750</td>
<td>&gt;99%; &lt;0.1% glucose</td>
</tr>
<tr>
<td>D-raffinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R0250</td>
<td>&gt;98%</td>
</tr>
<tr>
<td>L-leucine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uracil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>U0750</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-tryptophan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-histidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H6034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNA, single stranded, from salmon testes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D7656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5879</td>
<td>Desiccate</td>
</tr>
<tr>
<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H1758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4338</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lithium acetate (LiAc)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4958</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris (base)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J.T. Baker</td>
<td>4109-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5516</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromophenol blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B6131</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dodecyl sulfate sodium salt (SDS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>8.22050.1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430052</td>
<td>Sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>67.742</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inoculation loop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Z643009</td>
<td>Sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pH indicator strip, pH 6.5-10.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>1.09543.0001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

identification of growth inhibition phenotypes induced by expression of bacterial type iii effectors in yeast

Muitas bactérias Gram-negativas patogénicas usam um sistema de secreção do tipo III para translocar um conjunto de proteínas efetoras para o citosol das células do hospedeiro. Dentro da célula, effectors tipo III subverter processos de celular do hospedeiro para suprimir a resposta imunológica e promover o crescimento de patógenos. Efetores tipo numerosos III de plantas e animais patógenos bacterianos foram identificados até o momento, mas apenas alguns deles estão bem caracterizadas. Compreender as funções destes efetores tem sido prejudicada por uma combinação de redundância funcional no repertório efetoras de uma cepa bacteriana dadas, os efeitos sutis que podem exercer para aumentar a virulência, os papéis que são, possivelmente, específicos para estágios determinada infecção, e dificuldades no geneticamente manipulação de certos patógenos. Expressão de efetores tipo III na levedura de brotamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Pode permitir contornar estas limitações e ajuda para a caracterização funcional de proteínas efetoras. Porque effectors tipo III muitas vezes alvo de processos celulares que são conservados entre leveduras e outros eucariotos, sua expressão em levedura pode resultar em fenótipos inibição de crescimento que pode ser explorada para elucidar funções efetoras e metas. Vantagens adicionais ao uso de fermento para estudos funcionais de efetores bacteriana incluem sua docilidade genético, informações sobre as funções previstas da grande maioria de suas ORFs, e disponibilidade de várias ferramentas e recursos para experiências tanto do genoma e em pequena escala. Aqui vamos discutir os fatores críticos para a concepção de um sistema de levedura para a expressão de proteínas do tipo bacteriana III efetoras. Estes incluem um promotor apropriado para dirigir a expressão do gene efetor (s) de interesse, o número de cópias do gene efetor, o tag epítopo usado para verificar a expressão da proteína, ea cepa de levedura. Apresentamos os procedimentos de induzir a expressão de efetores em leveduras e verificar a sua expressão por immunoblotting. Além disso, descrevemos um ensaio de spotting em placas de agar para a identificação de fenótipos efetoras induzida por inibição do crescimento. O uso deste protocolo pode ser prorrogado para o estudo de fatores de patogenicidade entregue na célula hospedeira por qualquer patógeno e mecanismo de translocação.

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Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para a expressão de efetores tipo bacteriana III em levedura ea identificação de fenótipos efetoras induzida por inibição do crescimento. Esses fenótipos podem ser posteriormente explorada para elucidar funções efetoras e metas.

Identificação de fenótipos inibição do crescimento induzido pela expressão de Effectors Tipo III bacteriana em Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

identification-growth-inhibition-phenotypes-induced-expression

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K visualizações.  Tel Aviv University. Neste vídeo, descrevemos um procedimento para a expressão de efetores tipo bacteriana III em levedura ea identificação de fenótipos efetoras induzida por inibição do crescimento. Esses fenótipos podem ser posteriormente explorada para elucidar funções efetoras e metas.

Vídeo: Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Biologia

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Expressão de proteínas recombinantes em levedura metilotróficas Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

Entrega bacteriana de RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's disease, and Huntington's disease 1. Huntington's disease (HD) is caused by the abnormal expansion of a polyglutamine (polyQ) region within the protein huntingtin. The polyQ-expanded huntingtin protein attains an aberrant conformation (i.e. it misfolds) and causes cellular toxicity 2. At least eight further neurodegenerative diseases are caused by polyQ-expansions, including the Spinocerebellar Ataxias and Kennedy&#x2019;s disease 3.
The model organism yeast has facilitated significant insights into the cellular and molecular basis of polyQ-toxicity, including the impact of intra- and inter-molecular factors of polyQ-toxicity, and the identification of cellular pathways that are impaired in cells expressing polyQ-expansion proteins 3-8. Importantly, many aspects of polyQ-toxicity that were found in yeast were reproduced in other experimental systems and to some extent in samples from HD patients, thus demonstrating the significance of the yeast model for the discovery of basic mechanisms underpinning polyQ-toxicity. 
A direct and relatively simple way to determine polyQ-toxicity in yeast is to measure growth defects of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. This manuscript describes three complementary experimental approaches to determine polyQ-toxicity in yeast by measuring the growth of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. The first two experimental approaches monitor yeast growth on plates, the third approach monitors the growth of liquid yeast cultures using the BioscreenC instrument. 
Furthermore, this manuscript describes experimental difficulties that can occur when handling yeast polyQ models and outlines strategies that will help to avoid or minimize these difficulties. The protocols described here can be used to identify and to characterize genetic pathways and small molecules that modulate polyQ-toxicity. Moreover, the described assays may serve as templates for accurate analyses of the toxicity caused by other disease-associated misfolded proteins in yeast models.

This manuscript describes three complementary protocols for assessing the toxicity of polyglutamine (polyQ)-expansion proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. These protocols can easily be modified to monitor the toxicity of other misfolded proteins in yeast.

Ensaios de crescimento para avaliar a toxicidade poliglutamina em Levedura

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

A quantificação temporal da expressão MAPK induzida em células de levedura Solteiro

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

Quantificação de Orofacial nos fenótipos<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

Identificação de sinalização intracelular Eventos induzida em células viáveis ​​pela interação com as células vizinhas Submetidos a apoptose celular Morte

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Usando dispositivos microfluídicos medir Longevidade e Celular fenótipos em células individuais levedura de brotamento

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

Preciso, elevado-throughput análise do crescimento bacteriano

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&amp;#946; Signaling

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...