Os autores agradecem os membros Cirillo laboratório pelas valiosas discussões e assistência ao longo deste estudo. Agradecemos ao Dr. Joshua Hill e do laboratório do Dr. James Samuel para a assistência durante as filmagens com o do presente protocolo. Este trabalho foi financiado por bolsa 48523 da Fundação Bill &amp; Melinda Gates Foundation e AI47866 concessão do National Institutes of Health.

1. Infecção pulmonar por entubação endotraqueal <ol><li> Pesar ratos e, opcionalmente, as marcas podem ser feitas nas orelhas para fácil identificação. </li><li> Anestesiar os ratos com cetamina (100 mg por g de peso do mouse) e xilazina (10 mg por g de peso do rato) por inoculação intraperitoneal. </li><li> Camundongos lugar em gaiolas até totalmente anestesiado. Aperte as pontas dos seus pés para verificar pedal reflexo. Ratos deve exibir reduzida ou nenhuma reação reflexa. </li><li> Posicione o mouse sobre o suporte intubação deitado de costas. </li><li> Fix um elástico para ficar intubação e depois colocá-lo sob os incisivos superiores do mouse. Use fita adesiva para fixar as pernas e os braços no suporte intubação. </li><li> Suavemente move tougue da boca com a pinça. </li><li> Inserir espéculo com octoscope dentro da boca e orofaringe até olhar para a abertura da laringe é visível. </li><li> Fio guia coberto com antecedência cathether em traquéia até cateter hub está no incisivos. Remova o fio guia. Coloque o ar para dentro cathether para observar a expansão torácica e confirmar a intubação correta. </li><li> Injetar 50 mL de bactérias (nas imagens mostradas usamos bacilo Calmette Guerin (BCG) que expressa clique besouro vermelho luciferase (CBRLuc), construído no nosso laboratório, mas qualquer estirpe bacteriana luminescentes podem ser usados) solução através cathether usando uma seringa de 1 mL. </li><li> Lugar do mouse em uma gaiola e observá-lo durante a recuperação da anestesia. </li></ol> 2. Anestesiados animais e preparação para o Imaging Bioluminescência Os ratos são anestesiados com isoflurano usando a XGI-8 Gas Sistema Aneshesia. <ol><li> Antes de operar o XGI-8 sistema de anestesia, pesar cada canister filtro de carvão e escrever o peso ea data nele. Se o peso é 50 gramas mais do peso inicial, substituí-lo por uma lata nova. </li><li> Verifique o nível de isoflurano no vaporizador e preenchê-lo se necessário. </li><li> Ligue a bomba de evacuação em frente da XGI-8 sistema de anestesia e definir a 8 lpm (litros por minuite). </li><li> Ligue o fornecimento de oxigênio a partir do cilindro de alta pressão e defini-la a 55 psig. </li><li> Ligar o oxigênio de alternância (verde) na parte da frente do sistema de anestesia XGI-8. </li><li> Ligar o fluxo de gás para a câmara de imagem para definir o nível de fluxo de gás. Ajustado para 0,25 lpm e depois desligar o fluxo de gás. </li><li> Ligar o fluxo de gás para a câmara de indução da anestesia para definir o nível de fluxo de gás. Ajustado para 1,5 lpm e desligue o fluxo de gás. </li><li> Ligue o isoflurano com o vaporizador e definido para 2-2,5 por cento. O nível de isoflurano pode ser ajustada dependendo do número de animais a ser utilizado e peso. </li><li> Coloque os ratos dentro da câmara de indução e feche a tampa. Ligar o fluxo de gás para a câmara de indução. Camundongos lugar na câmara de 5-10 minuites até que sejam anestesiar completamente. </li><li> Aplicar pomada óptica para os olhos para proteger os olhos do mouse durante o exame e colocar os ratos na câmara de imagem em um dos cones do nariz no colector de anestesia. Use defletor de luz entre os ratos para evitar o reflexo da luz sobre assuntos adjacentes animais. </li><li> Injetar luciferina (150 mg / grama de peso corporal) por inoculação intraperitoneal. </li></ol> 3. Imagem bioluminescência <ol><li> Inicie o software de imagem Living. </li><li> Se o sistema não é inicializado, inicializar o sistema de imagem IVIS. </li><li> Definir os parâmetros para geração de imagens, clicando em configuração seqüência em IVIS painel de controle de aquisição. Selecione luminescência e fotografar no modo de imagem. Se a opção de realizar DLIT reconstrução 3D é desejada, selecione fotográfico, luminescentes e estruturais imagens de luz como parte da seqüência de imagens. Definir o tempo de exposição de 0,5 seg a 10 minutos. Definir Binning e F / stop em função da luminosidade esperada da amostra. Conjunto de excitação do filtro para bloquear e emissão de filtro para abrir, a menos que pretende adquirir comprimentos de onda específicos apenas da luz. No caso de DLIT 3D constituição, definir filtros de emissão múltiplos comprimentos de onda diferentes para permitir a localização exata da fonte. Set FOV de A a D, dependendo do número de ratos ou região de origem animal a ser trabalhada. Selecione A e B para um mouse, C por 2-3 camundongos e ratos D por 4-5. </li><li> Clique em adicionar no Assistente de Imagem no Painel de Controle Aquisição de adicionar a configuração da seqüência. </li><li> Comece seqüência de imagens, clicando em adquirir. No caso de DLIT construção 3D, imagens luminescentes serão adquiridos para filtros de emissão múltiplos comprimentos de onda diferentes. Fotográficos e imagens de luz estruturada também será adquirido. </li><li> Durante a aquisição da imagem e editar painéis níveis imagem será visível. Preencha informações tão pormenorizadas quanto possível para cada experimento na edição de imagem para garantir fácil rastreamento de imagens em momentos posteriores e salvar suas imagens. </li><li> ReRemove os ratos a partir de imagens IVIS câmara e devolvê-los às suas gaiolas. Observar a recuperação de umanestesia para garantir ratos não foram significativamente afetadas pelo procedimento. Os animais devem ser monitorados constantemente, até que se recuperar totalmente da anestesia (geralmente 1-2 min). </li></ol> 4. Ex vivo de Imagem e Análise de CFU para a quantificação de bactérias nos Pulmões <ol><li> Injetar camundongos com luciferina intraperitoneal da mesma maneira como para geração de imagens, pouco antes da eutanásia. </li><li> Eutanásia os ratos por injeção intraperitoneal de 100 mg / kg 5 min após a injeção pentobarbitol luciferina. </li><li> Explante os pulmões de camundongos e coloque em pratos de Petri estéreis usando uma pinça e tesouras estéreis. </li><li> Coloque placa de Petri contendo órgão explantado em imagens de câmara e adquirir imagens bioluminescência da mesma maneira como para mouse todo. </li><li> Depois de imagem, remoção de órgãos explantado de petri prato com a pinça estéril e homogeneizar em 1 mL de PBS. </li><li> Fazer diluições e tecido placa na mídia apropriada seletivo. Tecido homogeneizado pode ser armazenado entre -80 ° C para a re-regulamentação, caso seja necessário. Alternativamente, o tecido homogeneizado pode ser utilizado para extração de DNA ou RNA para quantificar o número de bactérias por qPCR. </li></ol> 5. Análise de imagem Luminescência <ol><li> Start &quot;Software Imaging Living&quot; e procurar os arquivos de imagem. </li><li> Use &quot;Tool Palette&quot; para ajustar as imagens. Clique na imagem Ajuste para modificar a correção / filtragem configurações e min / max para as escalas de cores individuais. </li><li> Use ferramentas de ROI na lista suspenso para a quantificação da intensidade da luz. Selecione a forma ROI, número e tamanho. Arraste quadro ROI para região de interesse na imagem. Assegurar que todas as ROI são do mesmo tamanho e forma. Clique ROI de medição e salvar, copiar e / ou exportação de dados quantitativos. </li><li> No caso de DLIT reconstruções 3D, carregar uma seqüência de imagens, incluindo a imagem de luz estruturada. Clique topografia de superfície na Ferramenta de Platte. Na lista suspensa, clique em Reconstruir guia para gerar a topografia da superfície. Uma confusão de superfície irá aparecer na janela. </li><li> Selecione DLIT reconstrução 3D na ferramenta de Platte. Na lista de pulldown, clique na guia Propriedades para definir as propriedades dos tecidos e espectro da fonte. Muscular é recomendado na maioria das circunstâncias. Na lista pendente, clique na guia Analisar para selecionar o comprimento de onda para análise. Clique na guia Parâmetros e confirmar os valores padrão ou ajustar os parâmetros DLIT se necessário. Clique Reconstruir guia para começar a análise em 3D. </li><li> Quando a reconstrução 3D é concluída, a visualização em 3D irá exibir os resultados da reconstrução 3D. Clique na guia para ver os resultados de análise de dados para a densidade de fótons, voxels e parâmetros do algoritmo DLIT. </li><li> Salvar e / ou exportar os resultados das análises de reconstrução 3D em figuras e arquivos de dados. </li></ol> 6. Resultados representativos: As imagens bioluminescência de camundongos infectados com bactérias bioluminescentes, juntamente com um controle do mouse não infectados são mostrados na Figura 1. O pulmonares camundongos infectados com bactérias bioluminescentes produzir sinal significativo dos pulmões (Figura 1). Intensidade da luminescência é quantificado como fluxo total dentro de um ROI (região de interesse) (Figura 2). Os dados quantitativos para a intensidade da luz é normalizado para as unidades formadoras de colônia (UFC) de bactérias obtidas de pulmões para confirmar que o sinal é produzido a partir de bactérias bioluminescentes e pode ser comparado ao controle negativo. A localização ea intensidade do sinal pode ser posteriormente analisado por DLIT reconstrução 3D da fonte de luminescência com base na tomografia da superfície do mouse 11. Essas análises permitem a quantificação e localização do sinal bioluminescente produzido. Os resultados da reconstrução 3D de uma fonte luminescente em camundongos infectados demonstra que a luz é produzida a partir de pulmões do mouse (Figura 3). As imagens ex vivo dos pulmões do rato resultando confirmar que a luminescência é emitido a partir dos pulmões, ao invés de algum outro tecido ou órgão estreitamente justapostas (Figura 2C). <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Imagens da luminescência pulmonar camundongos infectados com bactérias bioluminescentes marcados com CBRluc. Rato controle não infectado é do lado esquerdo e dois camundongos infectados estão na direita. Camundongos foram infectados com bactérias expressando CBRluc (n = 2) por via intratraqueal. 10 minutos após a injeção de luciferina, imagens de luminescência foram adquiridas por 10 minutos a 4 posições: dorsal, lateral, ventral esquerdo e lado direito. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A intensidade da luz quantitativa de camundongos infectados com bactérias expressando CBRluc. (A, B) imagens Luminescência de ROI análise e quantificação do fluxo total de luz de ROI em posições dorsal e ventral, respectivamente. Camundongos não infectados estão na esquerda e dois camundongos infectados estão na direita. Luminescência imagens foram adquiridas a partir de pulmões of camundongos não infectados e infectados com CBRlux (n = 2). A intensidade da luz em torno dos pulmões foi quantificada por análise de ROI. C) imagens ex vivo de pulmões de não infectados (em cima) e infectadas (em baixo dois conjuntos de pulmões) camundongos. Luciferina foi injetado 5 miniuts antes da eutanásia e as imagens foram então adquiridos. Os valores quantificados são normalizados para CFU. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. A reconstrução 3D da fonte de bioluminescência (s) de um rato pulmonar infectado. O rato foi infectado com bactérias expressando CBRluc por injeção intratraqueal. A seqüência de imagens foi adquirido usando filtros diferentes comprimentos de onda de emissão de série de 540 nm e 700 nm. Uma seqüência de imagens foi utilizada para a reconstituição em 3D para fonte de luminescência em indivíduos animais que continha uma imag estruturado. A) A tomografia para mouse é mostrado em diferentes posições: frente, trás, esquerda e direita. Fontes de luz são mostrados como voxels (caixas vermelhas dentro de mouse 3D) que estão localizados dentro do pulmão, conforme determinado pela reconstrução. B) Photon mapa densiy de dados medidos e simulados. Comparando as curvas de densidade medidos e simulados fóton fornecer as informações de qualidade de reconstrução. Boa qualidade no resultado reconstruções semelhante medidos e simulados densidades de fótons.

<ol>
	<li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence.">Bioluminescence.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).</li><li>Contag, C. H., Bachmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+gene+expression.">Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.</a> Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li><li>Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+coding+click+beetle+luciferases+can+elicit+bioluminescence+of+different+colors.">Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors.</a> Science. 244, 700-702 (1989).</li><li>Wet, J. R. d. e., Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+firefly+luciferase+cDNA+and+the+expression+of+active+luciferase+in+Escherichia+coli.">Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).</li><li>Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistries+and+colors+of+bioluminescent+reactions:+a+review.">Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review.</a> Gene. 173, 5-11 (1996).</li><li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emission+spectra+of+bioluminescent+reporters+and+interaction+with+mammalian+tissue+determine+the+sensitivity+of+detection+in+vivo.">Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo.</a> J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).</li><li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li><li>Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li><li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging.">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).</li><li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging.">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).</li></ol>

Os estudos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Institutional Animal Care e do Comitê Uso de Texas A &amp; M University.

Apesar de seguir estes protocolos normalmente irá resultar em imagens de alta qualidade, é importante considerar algumas questões-chave a fim de obter dados precisos e consistentes a partir de estudos de imagem. Luminescência imagens devem ser adquiridas que têm contagens de 600 a 60000 para garantir que o sinal está acima do fundo ea câmera não está saturado. Se o sinal obtido é inferior a 600 as condições de exposição deve ser ajustado para aumentar a contagem. Se o sinal obtido é mais de 60.000 a câme...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VETONE</td>
<td>501027 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Butler animal health supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>158307</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GMT</td>
<td>LUCK-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal plus solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VOR tech pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cathether (22G x 1&#x201D;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TERUMO</td>
<td>OX2225CA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guide wire </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hallowell EMC</td>
<td>210A3491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octocope with speculum </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hallowell EMC</td>
<td>000A3748</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xenogen IVIS system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XGI-8-gas Anesthsia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Living Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transparent nose cones</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Light baffle divider </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using luciferase to image bacterial infections in mice

Imagem é uma técnica valiosa que pode ser usado para monitorar processos biológicos. Em particular, a presença de células cancerosas, células-tronco, tipos específicos de célula imunológica, patógenos virais, parasitas e bactérias podem ser acompanhadas em tempo real dentro de animais vivos 1-2. Aplicação de imagem de bioluminescência para o estudo de patógenos tem vantagens em relação às estratégias convencionais para análise de infecções em modelos animais 3-4. Infecções podem ser visualizados dentro de animais individuais ao longo do tempo, sem a necessidade de eutanásia para determinar a localização ea quantidade do patógeno. Imageamento óptico permite o exame abrangente de todos os tecidos e órgãos, ao invés de amostragem de locais previamente conhecido por ser infectados. Além disso, a precisão da inoculação em tecidos específicos pode ser diretamente determinada antes do transporte de animais para a frente que foram inoculados sem sucesso durante todo o experimento. Variabilidade entre os animais podem ser controlados pela falta de imagens permite que cada animal a ser seguido individualmente. Imagem tem o potencial para reduzir significativamente o número de animais necessários por causa da capacidade de obter dados de numerosos pontos de tempo sem a necessidade de tecidos de amostra para determinar carga de patógenos 3-4. Este protocolo descreve métodos para visualizar infecções em animais vivos usando imagens de bioluminescência de linhagens recombinantes de bactérias expressando luciferase. O besouro clique (CBRLuc) e luciferases firefly (FFluc) utilizam como substrato luciferina 5-6. A luz produzida por ambos os CBRluc FFluc e tem um comprimento de onda de 500 nm larga a 700 nm, tornando estes luciferases repórteres excelente para a imagem óptica em modelos animais de vida 7-9. Isso ocorre principalmente porque comprimentos de onda da luz é superior a 600 nm são necessárias para evitar a absorção pela hemoglobina e, assim, viajar através de tecidos de mamíferos, de forma eficiente. Luciferase é geneticamente introduzido na bactéria para produzir sinal de luz 10. Os ratos são pulmonar inoculada com bactérias bioluminescentes intratraqueal para permitir o monitoramento de infecções em tempo real. Após a injeção luciferina, as imagens são adquiridas usando o Sistema de Imagem IVIS. Durante a gravação, os ratos são anestesiados com isoflurano usando uma XGI-8 Gas Sistema Anethesia. As imagens podem ser analisados ​​para localizar e quantificar a fonte do sinal, que representa o local da infecção bacteriana (s) e número, respectivamente. Depois de imagem, a determinação de UFC é realizada em tecido homogeneizado para confirmar a presença de bactérias. Várias doses de bactérias são usadas para correlacionar número de bactérias com luminescência. Imagem pode ser aplicada ao estudo da patogenia e avaliação da eficácia dos compostos antibacterianos e vacinas.

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Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Métodos de imagem de bioluminescência de infecções bacterianas em animais vivos são descritos. Patógenos são modificados para expressar luciferase permitindo que imagens de corpo inteiro óptico de infecções em animais vivos. Modelos animais podem ser infectados com patógenos luciferase expressar eo curso resultante de doença visualizadas em tempo real pela imagem de bioluminescência.

Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

using-luciferase-to-image-bacterial-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.3K visualizações.  Texas A&M Health Science Center. Métodos de imagem de bioluminescência de infecções bacterianas em animais vivos são descritos. Patógenos são modificados para expressar luciferase permitindo que imagens de corpo inteiro óptico de infecções em animais vivos. Modelos animais podem ser infectados com patógenos luciferase expressar eo curso resultante de doença visualizadas em tempo real pela imagem de bioluminescência.

Vídeo: Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Avaliar a resposta estomática ao vivo células bacterianas usando imagens Folha Inteira

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Imunologia e Infecção

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D Multimodalidade de imagens de<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecções em Ratos

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Humanizado mouse modelo para estudar Infecções Bacterianas Segmentação microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Avaliação da invasão bacteriana de células cardíacas na cultura e colonização cardíaca em camundongos infectados usando listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culturas placentária e Decidual órgão humano para estudar Infecções na interface materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

Usando o protozoário Paramecium caudatum como um veículo para infecções de origem alimentar em larvas de Zebrafish

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Um do elevado-throughput Shigella-ensaio bactericida específico

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...