Transmigração linfócito é uma característica importante de qualquer resposta imune. Portanto, esse protocolo é significativo porque permite que um pesquisador avalie a mobilidade de linfócitos em um sistema in vitro bem definido. A principal vantagem desta técnica é que várias quimiocinas podem ser avaliadas para determinar sua eficácia de induzir a migração em células recentemente definidas, como o grupo duas células linfoides inatas, ou ILC2.
Uma segunda vantagem é que inibidores ou terapias biológicas destinadas a bloquear caminhos específicos de quimioterapia podem ser testados por este método antes de fazer experimentos mais caros com animais. Comece excisando pulmões e baços de camundongos machos e fêmeas tratados com ovários eutanizados usando dois a três animais por grupo. Coloque tecidos excisados em tubos separados de dissociação de acordo com o tipo de tecido e o sexo animal.
Coloque o tecido pulmonar em 500 microliters de mídia de dissociação pulmonar em um tubo de dissociação, coloque o tubo no dissociador de tecido automatizado e dissocia-o usando o protocolo pulmonar. Repita estes passos por um total de duas vezes. Para dissociar o tecido do baço, coloque-o em 500 microliters de mídia RPMI completa no dissociador e, em seguida, use o protocolo do baço.
Trabalhando em um armário de segurança biológica usando técnica estéril a partir de agora, filtrar cada tecido dissociado através de um coador de células de 40 micrômetros, e coletar em tubos cônicos de 50 mililitros. Enxágüe os tubos de dissociação contendo homogeneizadores pulmonares com cinco mililitros de mídia adicional de dissociação pulmonar, tubos contendo homogêneos de baço com cinco mililitros de RPMI completos, e filtre seu conteúdo através dos filtros utilizados para seus tecidos correspondentes. Para dissociar ainda mais o tecido pulmonar, incubar homogeneiza pulmonares por 15 a 30 minutos em uma incubadora Celsius de 37 graus com 5% de dióxido de carbono.
Em seguida, adicione cinco mililitros de RPMI completos tanto para o pulmão quanto para o baço homogeneiza, e centrífuga. Depois de descartar o supernasce, combine as pelotas contendo esplenócitos e células pulmonares do grupo de animais do mesmo sexo em um único tubo cônico de 50 mililitros. Adicione 10 mililitros de RPMI completos a cada tubo e resuspend.
Determine a contagem total de células usando um contador automático de células. Ajuste as suspensões celulares masculinas e femininas para 100 milhões de células por mililitro no buffer de separação, e depois adicione a um tubo de poliestireno de cinco mililitros. Após isolar o grupo duas células linfoides inatas de 2/3 das células totais descritas no manuscrito, use as células restantes para o procedimento de isolamento celular T CD4 positivo.
Para iniciar o isolamento da célula T CD4 positivo, adicione soro de rato à suspensão de enriquecimento de células CD4 T. Em seguida, adicione coquetel de isolamento à amostra celular e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente. O vórtice tem esferas rápidas por 30 segundos e adiciona à amostra celular para obter uma diluição de 75 microliters por mililitro.
Misture delicadamente e incubar por 2 minutos e meio em temperatura ambiente. Cubra as amostras com aproximadamente dois mililitros de tampão de separação até três mililitros, coloque os tubos de cinco mililitros no ímã de separação fácil de oito câmaras e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, incline o ímã para a frente, e pipeta cada suspensão celular em um tubo limpo de cinco mililitros.
Adicione 1,5 mililitros de RPMI sem soro a cada tubo e centrífuga. Despeje o supernasce, e resuspengue a pelota de célula T CD4 positivo em 10 milhões de células por mililitro em RPMI sem soro. Para iniciar esta parte do protocolo, determine o número de pastilhas Transwell necessárias para o experimento para células T ILC2 e CD4 positivos, conforme descrito no manuscrito.
Mova suavemente as pastilhas Transwell de três mícrons das fileiras médias de uma placa de 24 poços para as linhas superior e inferior da mesma placa de 24 poços com uma ponta de pipeta e mãos enluvadas. Adicione 500 microliters de mídia migratória com CCL17 a 1/3 dos poços na linha do meio da placa de 24 poços. Adicione 500 microliters de mídia migratória com CCL22 a outros 1/3 dos poços.
E, finalmente, adicione 500 microliters de RPMI sem soro contendo não quimiocinas nos últimos 1/3 dos poços. Rotule a tampa na placa claramente com o nome da mídia de transmigração apropriada colocada nos poços inferiores. Em seguida, coloque as inserções transwell de volta nos poços contendo os vários tratamentos.
Adicione suavemente 100 microliters de células CD4 T ou ILC2 ao poço superior de cada inserção, certificando-se de não misturar ou pipeta a suspensão celular para cima e para baixo nos Transwells. Rotule a tampa na placa claramente com o tipo de célula colocada em cada poço, e escreva a data e a hora do dia em que as células foram adicionadas. Repita este processo a partir da remoção das pastilhas Transwell da placa até que todas as células tenham sido colocadas em pastilhas Transwell com mídia.
Uma vez que as células de interesse são isoladas, os passos mais importantes são manter o controle das quimiocinas e tipos de células que são colocadas em poços particulares, adicionar suavemente células às câmaras superiores e, por último, evitar contato desnecessário com a placa de transmigração durante a incubação de 48 horas. Coloque suavemente a placa em uma incubadora Celsius de 37 graus com 5% de dióxido de carbono e incubar por 48 horas, certificando-se de minimizar o contato com a placa durante o período de incubação. Depois de remover suavemente a placa da incubadora, remova todas as pastilhas Transwell das linhas do meio para os poços vazios logo acima ou abaixo.
Colete as células dos poços superior e inferior das pastilhas Transwell em tubos rotulados com parte superior ou inferior com CCL17, CCL22 ou mídia, com o tipo de célula, e com o número de replicação. Enxágüe os poços inferiores com 500 microliters de 1x PBS, colete-o nos tubos correspondentes e faça o mesmo pelos poços superiores. Centrifugar os tubos a 378 vezes g à temperatura ambiente por cinco minutos.
Use uma pipeta para remover suavemente todo o supernascer e, em seguida, resuspend células T e pelotas ILC2 com 50 microliters de 1x PBS. Depois de remover 10 microliters da suspensão celular, adicione 90 microliters de 0,4% azul trypan. Conte as células no contador automático de células.
E para cada amostra, recorde percentual de viabilidade e contagem de células por mililitro, e determina o número total de células por tratamento na câmara superior e inferior. Quando a expressão CCR4 foi avaliada em ambas as células T CD4-positivas e ILC2 por citometria de fluxo, não houve diferenças entre hospedeiros masculinos e femininos. No entanto, a expressão de CCR4 em uma base por célula no ILC2 foi maior em comparação com as células T CD4 positivas.
Quando a câmara inferior do aparelho Transwell estava cheia de mídia de cultura celular não tratada, mídia contendo CCL22, ou mídia contendo CCL17, menos de 14% das células migraram em condições de controle de mídia. Em resposta ao CCL22, ambos os tipos de células, independentemente de serem de hospedeiros masculinos ou femininos, responderam à CCL22. Além disso, o CCL22 induziu maior migração do que o CCL17 no ILC2 masculino.
Por outro lado, o CCL17 induziu uma migração significativa das células CD4 T femininas e ILC2 em comparação apenas com a mídia. O tratamento CCL17 não foi diferente da mídia para células T cd4-positivas masculinas ou ILC2 masculinas. Em condições subótimas, quando a placa com células CD4 permaneceu em temperatura ambiente durante as primeiras 24 horas e depois mudou-se para a incubadora, não houve migração para CCL22 e CCL17.
Além disso, a viabilidade das células foi notavelmente baixa para as células na câmara inferior, mostrando a importância de usar as temperaturas e condições corretas descritas neste protocolo para alcançar resultados ideais. Uma vez concluído o procedimento de transmigração, deve-se ver uma migração significativa para a quimiocina de interesse em comparação com os poços de controle de mídia. Se não for observada uma migração significativa, pode-se supor que o procedimento não funcionou corretamente ou que os linfócitos não respondem à quimioterapia em questão.
Esta técnica pode ser usada amplamente para entender a migração de linfócitos quando esses linfócitos foram submetidos a uma ampla gama de tratamentos in vivo.
