Agradecemos a Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), KFO 247, por financiar nosso estudo.

Os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com a Lei alemã de bem-estar animal (última revisão em 2014) e regulamentos europeus (2010/63 / UE). As experiências foram aprovadas pela autoridade local de bem-estar animal (LaGeSo, Berlim), e em conformidade com o departamento local e diretrizes internacionais. NOTA: No método apresentado, dois modelos de eletrodos são usados ​​para registrar a partir da via ganglionar cortico-basal hiperdirecional que conecta o córtex motor primário (M1) com o núcleo subtalâmico (STN) e a substância nigra pars reticulada (SNr). Para as gravações de eletrocorticograma peridural (ECoG) dos eletrodos Ag / AgCl personalizados de baixa impedância M1, são usados. As gravações da STN e SNr são realizadas com eletrodos de tungstênio de alta impedância comercialmente disponíveis. 1. Construção de eletrodos epidurais Epidural Ag / AgCl <ol><li> Pegue um aprox. Faixa de 5 cm de comprimento de fio de prata puro de 99,99% com um diameteR de 200 μm e remova qualquer revestimento, se necessário. </li><li> Segure a ponta do fio com a ponta para baixo em uma chama de um isqueiro ou vela até a ponta começar a derreter. Aguarde até que a ponta seja em forma de bola e tenha um diâmetro de aproximadamente 1 mm. Corte o eletrodo pré-formado até um comprimento total de 15 mm desde o início da ponta em forma de bola até a extremidade do fio. </li><li> Solde um conector de precisão para a extremidade do fio, que se adapta ao sistema de gravação eletrofisiológico usado. Cubra o ponto de soldagem da extremidade do fio ao conector com verniz de prata condutor. Isso ajuda a condutividade e resulta em uma melhor qualidade de sinal. </li><li> Após o verniz condutor ter secado, cubra o ponto de soldagem com um tubo termoretrante de 3 mm a 1 mm. Use cuidadosamente o martelo de um relojoeiro para aplainar a ponta em forma de bola para metade da espessura. </li><li> Coloque as luvas de exame e tome um pano de limpeza sem fiapos com 100% de etanol para remover qualquer sujeira e graxa. </li><li> Coloque os eletrodos emUm tubo de centrifugação de 15 mL ou um tubo de cultura de células e preenchê-lo com cloro de cloro doméstico (CUIDADO: contendo 2,8 g de hipoclorídio de sódio por 100 g de solvente) até a ponta em forma de bola estar totalmente coberta. CUIDADO: O cloro é corajoso; Siga sempre as instruções de segurança do fabricante. </li><li> Retire os eletrodos após 23 minutos e elimine-os generosamente com água destilada. A aplicação bem sucedida de uma camada de cloreto de prata aparece como uma mudança de cor marrom homogênea. </li><li> Seca no ar. Depois de completamente seco, leve os eletrodos com uma pinça fina. Com um pincel fino, aplique isolamento elétrico líquido. Comece no fio diretamente atrás da ponta do eletrodo e cubra tudo até o tubo de encolhimento de calor. Deixe o isolamento secar durante pelo menos 2 h. </li><li> Para controle de qualidade, realize uma verificação da condutividade elétrica com um multímetro. Se disponível, execute testes de impedância a 1 kHz usando um medidor de impedância apropriado, enquanto o eletrodo e testeA sonda é colocada em uma solução contendo H2O contendo 0,9% sem tocar entre si. Os valores de impedância a 1 kHz devem ser de aproximadamente 8 kΩ. </li></ol> 2. Afixando os eletrodos a um suporte estereotáxico NOTA: Para gravar MUA e LFPs ao mesmo tempo, use eletrodos de microondas de tungstênio com uma impedância de 1,5 MΩ. Se o foco das gravações estiverem em gravações de alta qualidade de unidades únicas, escolha eletrodos de microwire com uma impedância maior (&gt; 5 MΩ). Se o objetivo do estudo for direcionado exclusivamente para LFPs, os eletrodos com impedâncias mais baixas podem ser aceitáveis. Para pequenas estruturas, para as quais os ajustes estereotáxicos dorsoventrais são freqüentemente necessários, use pares de eletrodos com uma separação adequada da ponta dorsoventral (neste caso, 250 μm). Além disso, isso proporciona a vantagem de um eletrodo de referência mais local, se necessário. As coordenadas estereotáxicas são sempre medidas a partir do eletrodo mais baixo e umaÉ calculado em referência ao bregma. <ol><li> Pegue um suporte de eletrodo estereotáxico padrão com um bloco de acrílico e aperte e coloque-o com segurança sobre uma superfície plana no campo de visão de um microscópio cirúrgico. </li><li> Coloque suavemente o primeiro par de eletrodos no bloco acrílico do suporte com pedaços de fita adesiva (3 mm x 8 mm) usando uma pinça fina. Os eletrodos devem protrusar o bloco de acrílico aprox. 12 mm. </li><li> Coloque cuidadosamente o segundo eletrodo bipolar ao lado do primeiro eletrodo. Para segmentar as estruturas da via hiperdiretada, a distância deve ser de 2 mm ( Figura 1 ). Para a maioria dos suportes de eletrodos estereotáxicos padrão, este é o recesso adjacente. Use um medidor de calibre para verificar. Diferentes redes podem ser abordadas da mesma maneira. Para isso, o bloco de acrílico pode ser girado até certo ponto. </li><li> Ajuste o segundo par de eletrodos deslizando-o cuidadosamente para uma posição, na qual a ponta mais ventral é de aproximadamente 200Μm recesso comparado ao primeiro eletrodo ( Figura 1 ). Faça isso sob visão microscópica. Para isso, use uma cânula de 30 G (diâmetro externo de 300 μm) para melhor estimar a distância. </li><li> Pressione a fita adesiva e, em seguida, segure com a braçadeira de metal do suporte. </li></ol> 3. Cirurgia <ol><li> Para gravações eletrofisiológicas, use uretano (CUIDADO) para anestesia. Cuidado: O uretano é tóxico e carcinogênico, portanto, siga sempre os regulamentos de segurança e a folha de dados fornecida pelo fabricante da substância. </li><li> Prepare uma solução de 200 mg / mL de uretano em solução salina médica de NaCl a 0,9%. </li><li> Administrar um total de 1,3 g / kg de uretano corporal por via intraperitoneal (IP). Dependendo da cepa do rato, pode ser razoável dividir a dose em duas doses com um intervalo de 15 min entre as injeções, a fim de aumentar a segurança da anestesia. </li><li> Verifique a profundidade da anestesia usando pReflexo de retirada de edal e outros reflexos adequados. Se a anestesia não for suficientemente profunda para realizar uma cirurgia, injete 0,15 g / kg de peso corporal de uretano IP e espere mais 15 min. </li><li> Aplique uma pomada ocular para evitar a desidratação da córnea. </li><li> Monitorar constantemente a freqüência respiratória e o reflexo de retirada do pedal durante a anestesia. Use uma almofada de aquecimento de pequenos animais com controle de temperatura para garantir que uma temperatura corporal fisiológica seja mantida durante toda a cirurgia. Antes do início das gravações eletrofisiológicas, mude para uma alternativa não elétrica ( por exemplo , almofada de cabeça de acetato de sódio). </li><li> Raspar o pêlo ao lado do lado dorsal da cabeça para conseguir um campo cirúrgico limpo. Desinfecte em torno do local da incisão com desinfetante cirúrgico apropriado. Corrigir o animal no quadro estereotáxico. </li><li> Execute uma incisão de 2 cm de comprimento no couro cabeludo na direção sagital com um bisturi. Use um bisturi para raspar ligeiramente a aponeurose do crânio e desinfecte o crânio. Use coTton buds embebido em 3% de H 2 O 2 para remover qualquer tecido restante. </li><li> Use um electrocauter ou termocauter para controlar o sangramento, se necessário. Pare as sangramentos do osso do crânio e hipoderma, se o sangramento não parar espontaneamente após 1-2 minutos e dificulta a visão no crânio. </li><li> Ajuste a barra do incisivo até que a cabeça esteja posicionada na posição plana do crânio, o que significa que o bregma e lambda como pontos de referência estereotáxicos estão no mesmo plano. Isso é mais importante para obter alta precisão cirúrgica. Use uma ferramenta padrão de alinhamento de ratos estereotáxicos, calibre a ponta designada para o bregma sob visão microscópica e ajuste a barra do incisivo até que os pontos designados para a bregma e lambda na ferramenta toquem o crânio ao mesmo tempo. NOTA: Uma visão de um lado com luz focada do outro pode ajudar a determinar esta condição. Alternativamente, tome um suporte estereotáxico com uma cânula fina e mande as coordenadas dorsoventral da Bregma aNd lambda sob visão microscópica. Ajuste a barra do incisivo até que as coordenadas dorsoventrais de Bregma e lambda sejam as mesmas. </li><li> Use um suporte estereotáxico com cânula, calibre para o bregma e depois calcule a posição de todos os furos no crânio. Usando o suporte estereotáxico, marque as posições dos furos a serem perfurados, coçando com cuidado o crânio ou usando um marcador de cor cirúrgica. As coordenadas para isso dependem dos alvos, as coordenadas com referência ao bregma são dadas para a via hiperdiretada na Tabela 1 , incluindo as coordenadas sugeridas para eletrodos de referência cerebelares. </li><li> Usando uma microdrill cuidadosamente perfurar todos os buracos. Para a STN e SNr, perfure um furo comum (aproximadamente 2 mm x 3 mm de tamanho). Todos os outros furos devem ter um diâmetro de cerca de 1 mm. </li><li> Pegue duas cânulas finas (pelo menos 27 G) e dobre suas pontas para formar uma forma de ganchos, usando uma superfície dura ou uma pinça. Use estes para remover qualquer debriS dos furos, e cuidadosamente cortar e remover a dura-máter no buraco comum STN / SNr. </li><li> Desligue os furos com solução salina fisiológica. Aplique uma gota de solução salina fisiológica a cada 15 minutos até os orifícios de perfuração para evitar que o cérebro ea duraçao se desabafam. </li><li> Pegue uma microdrill e um micro-parafuso de aço inoxidável correspondente ( por exemplo, um parafuso M 1,2 mm x 2 mm), perfure um furo e rosqueie um micro-parafuso entre os furos dos eletrodos epidural de referência acima do cerebelo, faça o mesmo para o Eletrodos epidurais M1. </li><li> Deslize os eletrodos peridurais Ag / AgCl auto-construídos nos furos para os eletrodos de referência e os eletrodos M1. Guie a ponta do eletrodo com pinças finas e deslize-o diretamente abaixo do osso do crânio no furo. </li><li> Corrigir todos os eletrodos epidural com acrílico dental de dois componentes. Certifique-se de não cobrir o ponto de bregma nem afetar o buraco STN / SNr comum. </li><li> Insira o suporte preparado com o eletrodo de microondas de tungstênioEstá no quadro estereotáxico. </li><li> Calibre o eletrodo mais ventral, que se destina a direcionar a STN, para o bregma. Ajuste para a posição calculada acima do buraco comum STN / SNr e abaixe os eletrodos até o cérebro sob visão microscópica. Certifique-se de que os eletrodos de microondas de tungstênio entrem no interior do cérebro sem problemas. </li></ol> 4. Mapeamento eletrofisiológico e gravações NOTA: Para esta etapa, é necessária uma gaiola Faraday e um sistema de gravação eletrofisiológica multicanal com software de gravação capaz de filtrar on-line e classificar por linha. De preferência, use um sistema que funcione com um pré-amplificador posicionado perto da cabeça dos animais para manter o ruído elétrico e os artefatos no mínimo absoluto. Além dos eletrodos de microondas de tungstênio, pelo menos um eletrodo epidural e um eletrodo de referência são necessários para realizar gravações da via hiperdiretária. Recomenda-se inserir epidural e referenciarE eletrodos em par, sem que eles se toquem, isso ajuda em caso de mau funcionamento e permite diferentes tipos de referência na análise de dados. <ol><li> Coloque uma gaiola móvel Faraday acima do quadro estereotáxico. Se apenas uma gaiola estacionária de Faraday estiver disponível, mova cuidadosamente o quadro estereotáxico para a gaiola de Faraday, assegurando que os eletrodos do cérebro profundo não estejam abaixados no cérebro até o quadro estereotáxico estar em sua posição final. </li><li> Conecte os eletrodos ao headstage da instalação eletrofisiológica. Verifique se os eletrodos de referência estão conectados a canais de referência apropriados. </li><li> Configure o software de gravação: filtro Bandpass (0,05-8,000 Hz) e amplifique (ganho 1,500-2,000x) o sinal de dados brutos. Use um filtro LFP e espiga on-line com as configurações apropriadas (filtro passa-banda 0,05-250 Hz para LFPs, filtro passa-banda 300-8,000 Hz para MUA). Para todos os filtros, use um filtro tipo butterworth. </li><li> Configure um limite de pico, se aplicável, para onlinE spike classing. A maioria dos softwares de gravação permite a configuração de um limite de espiga, que é um valor de amplitude acima do qual um sinal é marcado como um pico pelo software. Este limiar pode ser determinado matematicamente como um fator ou desvio padrão da amplitude média do sinal de espiga filtrada, ou pode preferencialmente ser determinado por inspeção visual de segmentos de dados &lt;500 ms e configurado como uma linha acima do ruído de sinal em um gráfico interface de usuário. NOTA: A intenção na configuração de um limite de espiga é contar picos e unidades de ordenação para fornecer informações sobre quantos neurônios estão atualmente gravados e como seus picos são moldados. </li><li> Abaixe lentamente os eletrodos de microondas de tungstênio a 1 mm de dorsal do alvo, que é STN para hiperdireito. Aguarde até que o sinal se estabilize, se necessário. </li><li> Para o mapeamento eletrofisiológico, avance os eletrodos ventralmente em passos de 100 μm. Em cada passo, avalie o padrão de disparo, disparandoComia e forma de espigas. Compare aqueles com os exemplos típicos dados na Figura 2 . Comumente, os núcleos densos mostram espetadas rápidas e contínuas em várias etapas dorsoventrais, enquanto que as estruturas ricas em fibras mostram baixas taxas de disparo e atividade de espiga menos homogênea nas subseqüentes etapas ventrais. </li><li> Para o percurso hiperdireito, verifique se o eletrodo mais ventral está dentro da STN. NOTA: O STN é atingido quando um aumento considerável no MUA é detectado ventral da Zona incerta. Ventral para a STN, o pico termina quase completamente porque o eletrodo atingiu a cápsula interna. Quando o eletrodo mais ventral está em STN, a configuração dos microeletrodos de tungstênio garante que o posterior e segundo eletrodo esteja em SNr. O ajuste fino de Dorsoventral em pequenos incrementos pode ser necessário para gravar MUA típico em STN e SNr ao mesmo tempo. Observe que a freqüência de MUA depende do número de neurônios realmente registrados e no nível de cérebroativação. </li><li> Uma vez que os eletrodos estão nas estruturas desejadas, configure filtragem on-line e classificação por espiga (veja a Figura 4 ) e, em seguida, comece a gravação dos dados. Exemplos típicos para os diferentes estados de sincronização cortical que podem ser identificados nas gravações LFP são mostrados na Figura 3 . </li></ol> 5. Fim da experiência <ol><li> Quando as gravações são feitas, levante lentamente os eletrodos do cérebro e, instantaneamente, elimine-os com solução salina fisiológica. Os eletrodos podem ser reutilizados após uma lavagem completa e inspeção visual. Eléctrodos de dobra de descarga. </li><li> Eutanizar os animais por uma injeção IP de uma sobredosagem de uretano (2,5 g / kg de peso corporal). NOTA: O uretano só deve ser usado para procedimentos finais. </li><li> Se for necessária verificação histológica da posição do eletrodo ou outros procedimentos de coloração histológica, remova o cérebro do crânio e processe oTecido adequadamente. NOTA: Dependendo dos métodos de coloração pretendidos, a perfusão transcardial pode ser necessária. Para a verificação pós-mortem da posição do eletrodo, uma coloração padrão de Nissl é suficiente na maioria dos casos para visualizar a trajetória do eletrodo, por exemplo, nas seções coronais do cérebro. Outras abordagens para facilitar a verificação do alvo histológico incluem o uso de lesões induzidas eletricamente no tecido cerebral aplicando corrente elétrica através dos eletrodos de gravação ou a aplicação de corante biocompatível antes da inserção do eletrodo 16 , 17 . </li></ol>

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A., Meli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+urethane+anesthesia+for+physiopharmacological+investigations+in+various+systems.+Part+1:+General+considerations.">Suitability of urethane anesthesia for physiopharmacological investigations in various systems. Part 1: General considerations.</a> Experientia. 42 (2), 109-114 (1986).</li><li>Goldberg, J. A., Kats, S. S., Jaeger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globus+pallidus+discharge+is+coincident+with+striatal+activity+during+global+slow+wave+activity+in+the+rat.">Globus pallidus discharge is coincident with striatal activity during global slow wave activity in the rat.</a> J Neurosci. 23 (31), 10058-10063 (2003).</li><li>Karain, B., Xu, D., Bellone, J. A., Hartman, R. E., Shi, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+globus+pallidus+neurons:+functional+classification+and+effects+of+dopamine+depletion.">Rat globus pallidus neurons: functional classification and effects of dopamine depletion.</a> Synapse. 69 (1), 41-51 (2015).</li><li>Paasonen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+seven+different+anesthesia+protocols+for+nicotine+pharmacologic+magnetic+resonance+imaging+in+rat.">Comparison of seven different anesthesia protocols for nicotine pharmacologic magnetic resonance imaging in rat.</a> Eur Neuropsychopharmacol. 26 (3), 518-531 (2016).</li><li>Mahmud, M., Vassanelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+Analysis+of+Multichannel+Extracellular+Neuronal+Signals:+State-of-the-Art+and+Challenges.">Processing and Analysis of Multichannel Extracellular Neuronal Signals: State-of-the-Art and Challenges.</a> Front Neurosci. 10, 248 (2016).</li><li>Hadar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+neural+oscillations+and+elevated+dopamine+levels+in+the+reward+pathway+during+alcohol+relapse.">Altered neural oscillations and elevated dopamine levels in the reward pathway during alcohol relapse.</a> Behav Brain Res. 316, 131-135 (2017).</li><li>Voget, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+local+field+potential+activity+and+serotonergic+neurotransmission+are+further+characteristics+of+the+Flinders+sensitive+line+rat+model+of+depression.">Altered local field potential activity and serotonergic neurotransmission are further characteristics of the Flinders sensitive line rat model of depression.</a> Behav Brain Res. 291, 299-305 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

No presente estudo, o método é demonstrado como gravar sinais eletrofisiológicos extracelulares simultaneamente a partir de múltiplos locais de uma determinada rede utilizando o exemplo da via de ganglios cortico-basal hiperdirectos que conecta o M1 com STN e SNr em roedores. Um passo crítico na gravação de pequenas estruturas subcorticais, como a STN, é a inserção guiada com precisão dos eletrodos de gravação no alvo. No método apresentado, cuidar de duas etapas cruciais asseg...

A evidência cumulativa recente sobre diferentes distúrbios neuropsiquiátricos, como a doença de Parkinson (PD) e esquizofrenia, sugere fortemente que sua fisiopatologia é baseada em uma disfunção crítica de circuitos neuronais estendidos que geralmente envolvem estruturas corticais e subcorticais 1 , 2 , 3 . De acordo com esta teoria, as manifestações clínicas das doenças surgem como conseqüência de uma capacidade de processamento da informação prejudicada de uma rede de células em vez de células únicas ou elementos neuronais específicos 1 , 2 , 3 . A fim de melhorar a compreensão deste complexo grupo de doenças neuropsiquiátricas e encontrar novas opções de tratamento, é obrigatório caracterizar a dinâmica neuronal dessas redes desordenadas em pacientes humanos e modelos animais em grande detalhe. Um excelO método para estudar redes em larga escala em indivíduos vivos é o registro multidisciplinar de potenciais extracelulares 4 . Usando esse método, é possível avaliar simultaneamente potenciais de campo locais (LFPs), que representam principalmente a soma temporal de correntes pós-sinápticas excitatórias e inibitórias e atividade multi-unidade (MUA), que é gerada por potenciais pré-sinápticos 5 . A gravação de potenciais extracelulares tem várias vantagens em relação aos métodos alternativos para estudar redes, por exemplo , imagens de ressonância magnética funcional e imagens de cálcio, porque proporciona uma maior resolução temporal e espacial e não depende de organismos geneticamente modificados 5 . No entanto, o uso de gravações extracelulares in vivo é limitado, pois é uma técnica invasiva que não pode ser universalmente aplicada. Rec. Eletrofisiológica in vivoAs ordens podem ser realizadas tanto em animais acordados quanto em animais anestesiados 6 . Ambos os métodos são acompanhados por prós e contras específicos. Estudos em animais acordados permitem a gravação de sinais cerebrais durante o desempenho de tarefas comportamentais definidas, mas são propensos a movimentos relacionados e outros artefatos 7 , 8 . As gravações em animais anestesiados, por outro lado, oferecem a oportunidade de avaliar LFPs e MUA com um mínimo de artefatos em estados de sincronização cortical altamente definidos, mas os resultados também diferem em certa medida para o que pode ser encontrado em indivíduos acordados 9 , 10 , 11 . Nos últimos anos, foi demonstrado que a amostragem de LFPs é especialmente útil para delinear mudanças patológicas da atividade da rede. Um exemplo proeminente disso é a pesquisa sobre a fisiopatologia da PD em paciente humanoS e modelos animais da doença, onde poderia ser demonstrado que as oscilações beta aprimoradas no circuito dos gânglios cortico basal estão ligadas a sintomas motores parkinsonianos 12,13. Como conseqüência dessa linha de pesquisa, atualmente é investigado se as oscilações beta poderiam ser usadas como um biomarcador de feedback online para estimulação cerebral profunda em circuito fechado 14 , 15 . No presente estudo, fornece-se uma descrição detalhada das gravações eletrofisiológicas multi-site agudas de LFPs e MUA em ratos anestesiados com uretano. Está demonstrado como uma rede completa, como a via ganglionar cortico-basal hiperdirecional, pode ser caracterizada eletrofisiologicamente usando eletrodos padrão e personalizados e como esses eletrodos podem ser construídos. É especialmente enfatizado como uma segmentação precisa dos núcleos dos gânglios basais pode ser alcançada por coMbining cirurgia estereotáxica, juntamente com o registro on-line de MUAs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl custom epidural electrodes</td>
			<td>Goodfellow GmbH 
			D-61213 Bad Nauheim, Germany 
			info@goodfellow.com</td>
			<td>Product-ID AG005127 for 99.99% silver wire</td>
			<td>Ag/AgCl electrodes will allow for better signal quality, but may only be used in acute experiments. Possible replacement: Stainless steel electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic holder with acrylic block</td>
			<td>David Kopf Instruments, 
			7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA</td>
			<td>Product ID Model 1770 Standard Electrode Holder</td>
			<td>Make sure the acrylic block has recesses which suit the electrode setup for the desired target. Acrylic blocks can easily be modified with a file to obtain the desired configuration. Possible replacement: Self-constructed electrode holders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten microwire electrodes 1.5 M&#937; impedance</td>
			<td>Microprobes.com 
			18247-D Flower Hill Way&#160; Gaithersburg, Maryland, 20879 USA</td>
			<td>Product-ID WE3ST31.5A5-250um</td>
			<td>The 1.5 M&#937; is necessary to record MUA and LFP at the same time. Possible replacement: Microelectrodes of different materials can be used. The electrodes have to be straight, robust and as thin as possible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat alignment tool</td>
			<td>David Kopf Instruments, 
			7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA</td>
			<td>Product ID Model 944 Rat Alignment Tool</td>
			<td>Allows the exact orientation of the brain to match stereotaxic atlases. Possible replacement: Stereotaxic holder with a cannula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-component dental acrylic</td>
			<td>Associated Dental Products Ltd. 
			Kemdent Works, Purton, Swindon 
			Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom</td>
			<td>Simplex Rapid Powder Clear 225g, Product code: ACR803; Simplex Rapid Liquid 150ml, Product code: ACR920</td>
			<td>Depending in the electrodes used, superglue might be an easy alternative, if the electrodes are small and lightweight. Possible replacement: Superglue (Cyanacrylate-based)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>Self-construction</td>
			<td></td>
			<td>A proper Faraday cage will be the best protection from electromagnetic artifacts, but everything which can be formed into a box shape or applied to a frame and is made of conductive material may help. Possible replacement: Aluminum foil or copper mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiological setup with recording software and online spike-sorting capabilities</td>
			<td>OmniPlex&#174; Neural Data Acquisition System 
			Plexon Inc 
			6500 Greenville Avenue, Suite 700 
			Dallas, Texas 75206 
			USA</td>
			<td></td>
			<td>Offline sorting software is a potential alternative, multiple scripts and softwares can be found for free in the open source community.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute in vivo electrophysiological recordings of local field potentials and multi-unit activity from the hyperdirect pathway in anesthetized rats

A evidência convergente mostra que muitas doenças neuropsiquiátricas devem ser entendidas como distúrbios das redes neuronais em grande escala. Para entender melhor a base fisiopatológica destas doenças, é necessário caracterizar com precisão de que maneira o processamento da informação é perturbado entre as diferentes partes neuronais do circuito. Usando gravações eletrofisiológicas extracelulares in vivo , é possível delinear com precisão a atividade neuronal dentro de uma rede neuronal. A aplicação deste método tem várias vantagens em relação a técnicas alternativas, por exemplo , ressonância magnética funcional e imagem de cálcio, pois permite uma resolução temporal e espacial única e não depende de organismos geneticamente modificados. No entanto, o uso de gravações extracelulares in vivo é limitado, pois é uma técnica invasiva que não pode ser universalmente aplicada. Neste artigo, um método simples e fácil de usar é apresentado wCom o qual é possível gravar simultaneamente potenciais extracelulares, como potenciais de campo locais e atividade multiunidade em vários sites de uma rede. É detalhado como uma segmentação precisa dos núcleos subcorticais pode ser alcançada usando uma combinação de cirurgia estereotáxica e análise on-line de gravações de várias unidades. Assim, é demonstrado, como uma rede completa, como o loop hiperligado de gânglios cortico basal, pode ser estudada em animais anestesiados in vivo .

Com os eletrodos de gravação aqui utilizados, é possível amostrar LFPs do córtex motor primário, o núcleo subtalâmico e a substância nigra pars reticulata e MUA da STN e SNr. Inicialmente, LFPs e atividade de várias unidades são gravadas em conjunto em um sinal de banda larga. Posteriormente, LFPs e MUAs são separados por filtros de passagem de banda (0,05-250 Hz para LFPs e 300-4,000 Hz para MUA). Para a segmenta?...

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Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Agudo<em&gt; In Vivo</em&gt; Gravações eletrofisiológicas de Potenciais de campo locais e atividade de múltiplas unidades a partir do caminho hiperdiretivo em ratos anestesiados

Neste estudo, a metodologia é apresentada sobre como realizar gravações eletrofisiológicas in vivo multi-site a partir da via hiperdiretiva sob anestesia com uretano.

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

acute-vivo-electrophysiological-recordings-local-field-potentials

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

15.5K visualizações.  Charité University Medicine Berlin.  Neste estudo, a metodologia é apresentada sobre como realizar gravações eletrofisiológicas in vivo multi-site a partir da via hiperdiretiva sob anestesia com uretano. 

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Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

As gravações eletrofisiológicas da via fibra Gigante da D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Neurociência

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

All organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is especially important in insects, which use their olfactory systems to respond to, and discriminate amongst, complex odor stimuli. These odors elicit behaviors that mediate processes such as reproduction and habitat selection1-3. Additionally, chemical sensing by insects mediates behaviors that are highly significant for agriculture and human health, including pollination4-6, herbivory of food crops7, and transmission of disease8,9. Identification of olfactory signals and their role in insect behavior is thus important for understanding both ecological processes and human food resources and well-being.
	To date, the identification of volatiles that drive insect behavior has been difficult and often tedious. Current techniques include gas chromatography-coupled electroantennogram recording (GC-EAG), and gas chromatography-coupled single sensillum recordings (GC-SSR)10-12. These techniques proved to be vital in the identification of bioactive compounds. We have developed a method that uses gas chromatography coupled to multi-channel electrophysiological recordings (termed 'GCMR') from neurons in the antennal lobe (AL; the insect's primary olfactory center)13,14. This state-of-the-art technique allows us to probe how odor information is represented in the insect brain. Moreover, because neural responses to odors at this level of olfactory processing are highly sensitive owing to the degree of convergence of the antenna's receptor neurons into AL neurons, AL recordings will allow the detection of active constituents of natural odors efficiently and with high sensitivity. Here we describe GCMR and give an example of its use.
	Several general steps are involved in the detection of bioactive volatiles and insect response. Volatiles first need to be collected from sources of interest (in this example we use flowers from the genus Mimulus (Phyrmaceae)) and characterized as needed using standard GC-MS techniques14-16. Insects are prepared for study using minimal dissection, after which a recording electrode is inserted into the antennal lobe and multi-channel neural recording begins. Post-processing of the neural data then reveals which particular odorants cause significant neural responses by the insect nervous system.
	Although the example we present here is specific to pollination studies, GCMR can be expanded to a wide range of study organisms and volatile sources. For instance, this method can be used in the identification of odorants attracting or repelling vector insects and crop pests. Moreover, GCMR can also be used to identify attractants for beneficial insects, such as pollinators. The technique may be expanded to non-insect subjects as well.

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Olfactory cues mediate many different behaviors in insects, and are often complex mixtures comprised of tens to hundreds of volatile compounds. Using gas chromatography with multi-channel recording in the insect antennal lobe, we describe a method for the identification of bioactive compounds.

Identificação de voláteis olfativas utilizando cromatografia gasosa-Multi-unidade Gravações (GCMR) no lobo antenal Inseto

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuitos olfatórias

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the electrical responses of the retina to light stimulation, while the VEP measures the corresponding functional integrity of the visual pathways from the retina to the primary visual cortex following the same light event. The ERG waveform can be broken down into components that reflect responses from different retinal neuronal and glial cell classes. The early components of the VEP waveform represent the integrity of the optic nerve and higher cortical centers. These recordings can be conducted in isolation or together, depending on the application. The methodology described in this paper allows simultaneous assessment of retinal and cortical visual evoked electrophysiology from both eyes and both hemispheres. This is a useful way to more comprehensively assess retinal function and the upstream effects that changes in retinal function can have on visual evoked cortical function.

This protocol describes simultaneous measurement of electroretinogram and visual evoked potentials in anesthetized rats.

Gravação simultânea de Eletrorretinografia e potenciais evocados visuais em ratos anestesiados

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls body functions and internal organ rhythms when animals are exposed to emotional challenges and changes in their living environments. In general experiments, signals from different organs, such as the brain and the heart, are recorded by independent recording systems that require multiple recording devices and different procedures for processing the data files. This study describes a new method that can simultaneously monitor electrical biosignals, including tens of local field potentials in multiple brain regions, electrocardiograms that represent the cardiac rhythm, electromyograms that represent awake/sleep-related muscle contraction, and breathing signals, in a freely moving rat. The recording configuration of this method is based on a conventional micro-drive array for cortical local field potential recordings in which tens of electrodes are accommodated, and the signals obtained from these electrodes are integrated into a single electrical board mounted on the animal's head. Here, this recording system was improved so that signals from the peripheral organs are also transferred to an electrical interface board. In a single surgery, electrodes are first separately implanted into the appropriate body parts and the target brain areas. The open ends of all of these electrodes are then soldered to individual channels of the electrical board above the animal's head so that all of the signals can be integrated into the single electrical board. Connecting this board to a recording device allows for the collection of all of the signals into a single device, which reduces experimental costs and simplifies data processing, because all data can be handled in the same data file. This technique will aid the understanding of the neurophysiological correlates of the associations between central and peripheral organs.

This study introduces a method for the simultaneous recording of local field potentials in the brain, electrocardiograms, electromyograms, and breathing signals of a freely moving rat. This technique, which reduces experimental costs and simplifies data analysis, will contribute to the understanding of the interactions between the brain and peripheral organs.

Gravações simultâneas de potenciais de campo corticais Local, eletrocardiograma, eletromiograma e respirar o ritmo de um rato andando livremente

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

Quantifying Acute Changes in Renal Sympathetic Nerve Activity in Response to Central Nervous System Manipulations in Anesthetized Rats

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are limited resources directing scientists in the techniques for measuring and analyzing these variables. This protocol describes the methods for measuring RSNA and mean arterial pressure in anesthetized rats. The protocol also includes the approaches for accessing the brain during RSNA recordings for central nervous system (CNS) manipulations. The RSNA recording technique is compatible with pharmacologic, optogenetic, or electrical stimulation of the CNS. The approach is useful when an investigator will measure short-term (min to h) autonomic responses in non-survival experiments to correlate anatomically with CNS nuclei. The approach is not intended to be used to obtain chronic (survival) recordings of RSNA in rats. Discharges in RSNA, averaged rectified RSNA, and mean arterial pressure can be quantified and analyzed further using parametric statistical tests. Methods for obtaining venous access, recording mean arterial pressure telemetrically, and brain fixation for future histological analysis are also described in the article.

Methods for measuring sympathetic and cardiovascular responses to central nervous system (CNS) manipulations are important for advancing neuroscience. This protocol was developed to assist scientists with measuring and quantifying acute changes in renal sympathetic nerve activity (RSNA) in anesthetized rats (non-survival).

Quantificar alterações agudas na atividade do nervo simpático Renal em resposta a manipulações do sistema nervoso Central em ratos anestesiados

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). Therefore, detection of the presence of A&#946; in AD brain tissue is a valuable tool for developing new treatments to prevent the progression of AD. Several classical amyloid binding dyes, fluorochrome, imaging probes, and A&#946;-specific antibodies have been used to detect A&#946; histochemically in AD brain tissue. Use of these compounds for A&#946; detection is costly and time consuming. However, because of its intense fluorescent activity, high-affinity, and specificity for A&#946;, as well as structural similarities with traditional amyloid binding dyes, curcumin (Cur) is a promising candidate for labeling and imaging of A&#946; plaques in postmortem brain tissue. It is a natural polyphenol from the herb Curcuma longa. In the present study, Cur was used to histochemically label A&#946; plaques from both a genetic mouse model of 5x familial Alzheimer&#39;s disease (5xFAD) and from human AD tissue within a minute. The labeling capability of Cur was compared to conventional amyloid binding dyes, such as thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR), and Fluoro-jade C (FJC), as well as A&#946;-specific antibodies (6E10 and A11). We observed that Cur is the most inexpensive and quickest way to label and image A&#946; plaques when compared to these conventional dyes and is comparable to A&#946;-specific antibodies. In addition, Cur binds with most A&#946; species, such as oligomers and fibrils. Therefore, Cur could be used as the most cost-effective, simple, and quick fluorochrome detection agent for A&#946; plaques.

Curcumin is an ideal fluorophore for labeling and imaging of amyloid beta protein plaques in brain tissue due to its preferential binding to amyloid beta protein as well as its structural similarities with other traditional amyloid binding dyes. It can be used to label and image amyloid beta protein plaques more efficiently and inexpensively than traditional methods.

Rotulagem e imagem de placas amilóides no tecido cerebral usando a curcumina polifenóis naturais

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

Establishment of Acute Pontine Infarction in Rats by Electrical Stimulation

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided here is a protocol for successfully establishing a rat model of acute pontine infarction. Rats weighing about 250 g are used, and a probe with an insulated sheath is injected into the pons using a stereotaxic apparatus. A lesion is produced by the electrical stimulation with a single pulse. The Longa score, Berderson score, and beam balance test are used to assess neurological deficits. Additionally, the adhesive-removal somatosensory test is used to determine sensorimotor function, and the limb placement test is used to evaluate proprioception. MRI scans are then used to assess the infarction in vivo, and TTC staining is used to confirm the infarction in vitro. Here, a successful infarction is identified that is located in the anterolateral basis of the rostral pons. In conclusion, a new method is described to establish an acute pontine infarction rat model.

Presented here is a protocol for establishing acute pontine infarction in a rat model via electrical stimulation with a single pulse.

Estabelecimento de Infarto Agudo de Pontina em Ratos por Estimulação Elétrica

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided ...

Agudo

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As gravações eletrofisiológicas da via fibra Gigante da D. melanogaster