Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa Intramural do NIH, ICN e CCR. Todos os autores receberam Intramural bolsa de pesquisa de NIH, ICN e CCR.

1. preparar reagentes <ol><li>1X PBS <ol><li>diluir 100 mL x 10 PBS com 900 mL dH 2 O e ajustar o pH para 7,4 usando um medidor de pH. Armazenar em temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Solução de lise (LS) <ol><li>preparar 2,5 M NaCl, EDTA dissódico de 100 mM, 10 mM Tris base e 200mm NaOH em 900 mL dH 2 O; comumente leva cerca de 20 min para permitir a mistura dissolver totalmente. Ajuste o pH a 10 usando um medidor de pH. Adicionar sarcosinate de Laurilsulfato de sódio 1% e 1% Triton X-100 e ajustar o volume final de 1.000 mL. Legal a 4 ° C, durante pelo menos 30 min antes do uso.</li>
	</ol></li> <li>Solução de eletroforese alcalina (AES), pH &#62; 13 <ol><li>preparar dissódico NaOH e 1 mM 200 mM EDTA em 800 mL dH 2 O. ajustar o pH e certifique-se que é pH &#62; 13. Ajuste o volume final de 1.000 mL. Fazer fresco antes do utilizar e refrigerar a 4 ° C, durante pelo menos 30 min antes do uso.</li>
	</ol></li> <li>Sollution electroforese neutro (NES) <ol><li>preparar 1.000 mL de tampão de eletroforese neutro misturando 100 mM Tris base e 300mm de acetato de sódio para 1.000 mL dH 2 O. ajustar o pH a 9.0 com ácido acético glacial. Legal a 4 ° C, durante pelo menos 30 min antes do uso.</li>
	</ol></li> <li>Solução de precipitação de DNA (DPS) <ol><li>preparação de ações de acetato de amónio de 7,5 M 10 mL. Para 50 mL de solução de precipitação de DNA, mistura de acetato de amónio 6,7 mL 7,5 M com 43,3 mL de etanol 95%. Armazenar em temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Solução de coloração <ol><li>Adicionar 1 µ l 10.000 x mancha verde fluorescente de ácidos nucleicos (por exemplo, SYBR Green) em tampão de 30 mL de Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl, EDTA dissódico de 1 mM, pH 7,4) e loja em 4 ° C. proteger da luz.</li>
	</ol></li> <li>1% baixa fusão agarose <ol><li>derreter 1% baixa fusão ponto agarose (1 g em 100 mL dH 2 O) no microondas. Agite a agarose cada 15-20 s para certificar-se que a agarose é completamente derretido. Coloque o agarose em banho de água a 37 ° C pelo menos 20 min antes do uso.</li>
	</ol></li> <li>Pontas de pipetas pre-quente <ol><li>cortar as extremidades estreitas de pontas de pipetas P200 por 3 mm e quente a 37 ° C antes de pipetagem agarose.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparar os Slides cometa <ol><li>, deslize o revestimento <ol><li>Melt agarose a 1% (1 g em 100 mL dH 2 O) no microondas durante 2-3 minutos ou até que a agarose é completamente derretido. Mergulhar as vidro corrediças do microscópio para a agarose e limpar um lado da lâmina utilizando um cotão.</li>
		<li>Colocar os slides sobre uma superfície plana para secar ao ar livre ou aqueça a 50 ° C para secagem mais rápida; um filme de agarose transparente deve ser formado após a secagem. Coloque as lâminas revestidas em 37 ° C antes do uso.</li>
	</ol></li> <li>Preparação de suspensões celulares único <ol><li>cultura e tratar as células de glioma <ol><li>cultura as células U251 MG em meio DMEM-Ham F-12 suplementado com 10% FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 10 de µ g/mL em 37 & # 176; C com 5% de CO 2.</li>
			<li>Digerir as células usando a tripsina 1 mL por 3 min e neutralizar a tripsina usando meio DMEM-Ham F-12 com FBS. Coletar em tubo de 15 mL, giram a 300 x g, durante 4 min, Aspire o meio e suspender as células em 2 x 10 5 células/mL de 1X PBS. 
			Nota: A amostra de célula deve ser preparada imediatamente antes de iniciar o ensaio e todas as amostras devem ser manuseadas em um ambiente escuro ou esmaecido para evitar danos no DNA da luz.</li>
			<li>Combinar a suspensão de células com agarose a 1% derretido baixo ponto de fusão (a 37 ° C) na proporção de 01:10 (v/v), misture suavemente pipetando para cima e para baixo e imediatamente distribuir 30 µ l de uma lâmina. Use o lado da ponta da pipeta para espalhar a mistura para garantir a formação de uma camada fina de agarose/célula.</li>
			<li>Coloque a corrediça plana a 4 ° C, no escuro por 10 min., aumentando o tempo de coagulação para 30 min melhora a aderência das amostras em ambientes de alta umidade.</li>
			<li>Imergir o slide em 4 ° C LS no escuro por 1h durante a noite.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3. Única célula eletroforese <ol><li>prosseguir com alcalino (passo 3.2) ou cometa neutro (passo 3.3) do ensaio</li> <li>para ensaio cometa alcalina <ol><li>gentilmente remover slides de LS, escorra o excesso reserva e delicadamente mergulhe na AES por 1h no 4 ° C para permitir o desenrolar de DNA. Manter os slides no escuro.</li>
		<li>Adicionar pre-refrigerados AES na bandeja de slide de electroforese, não deve exceder 0,5 cm acima os slides (isso depende do tamanho das unidades de eletroforese), coloque os slides dentro e cubra com uma tampa. Definir a tensão de alimentação para 1 V/cm (o comprimento entre os eletrodos) e executada por 30 min em 4 ° C.</li>
		<li>Solução de electroforese em excesso de dreno de slide. Mergulhe delicadamente slides duas vezes na dH 2 O por 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Delicadamente mergulhe slides em etanol a 70% por 5 min à temperatura ambiente. Avance para o passo 4.</li>
	</ol></li> <li>Para ensaio cometa neutro <ol><li>Remover suavemente os slides de LS, escorra o excesso tampão e delicadamente mergulhe no NES por 30 min em 4 ° ° C. conservar o slide no escuro.</li>
		Tampão de eletroforese neutro previamente refrigerados <li>Add na bandeja de slide de electroforese, não deve exceder 0,5 cm acima slides (isso depende do tamanho das unidades de eletroforese), coloque os slides dentro e cubra com uma tampa. Definir a tensão de alimentação para 1 V/cm (o comprimento entre os eletrodos) e executada por 45 min em 4 ° C.</li>
		<li>Buffer excesso de drenagem das lâminas de. Mergulhe delicadamente slides em DPS por 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Delicadamente mergulhe os slides em etanol a 70% durante 30 min à temperatura ambiente. Avance para o passo 4.</li>
	</ol></li></ol> 4. Mancha de Slides cometa <ol><li>seco slides a 37 ° C por 10-15 min no escuro.</li>
	<li>Lugar 50-100 µ l verde fluorescente ácido nucleico manchando a solução em cada secas agarose e mancha durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Lavar os slides brevemente em dH 2 O e secar completamente a 37 ° C, no escuro. Proceder à análise e aquisição de imagens.</li>
</ol> 5. Aquisição e análise de imagens Nota: A visualização e a quantificação de quebras de DNA baseiam-se na microscopia de epifluorescência e o software do ensaio cometa (ver Tabela de materiais) 12 .
<ol><li>Coloque os slides sobre o microscópio com um suporte de slide. Certifique-se que o gel de agarose é voltado para a lente objetiva. Aleatoriamente, capturam imagens de slides cometa manchada usando um microscópio de fluorescência com uma lente objetiva de 10x. Evitar as bordas e as áreas ao redor de quaisquer bolhas de ar.</li>
	<li>, Certifique-se de cada cauda de cometa é distribuída horizontalmente. Cabeças de cometa devem se originam da esquerda e a cauda da direita.</li>
	<li>Salvar cada imagem em um formato binário de TIF com mancha brilhante de DNA e fundo escuro. Carregar imagens para o software usando o &#34; selecione arquivos para analisar &#34; botão, que está localizado no lado esquerdo da barra de ferramentas. Uma janela de exibição de imagem deve aparecer ( Figura 1).</li>
	<li>Desenhar um quadro de medição na tela e ajustar seu tamanho em conformidade com o cometa da célula. Clique o &#34; ajustar &#34; o botão para configurar o limite da cabeça, cometa, cauda de acordo com a imagem e, em seguida, clique o &#34; começar as medições &#34; botão ( Figura 1).</li>
	<li>, Selecione uma célula usando o frame e ativar a medição clicando com o mouse sobre o &#34; do ensaio cometa &#34; botão; uma intensidade imagem aparece no &#34; perfis &#34; janela com os parâmetros de medição selecionado. Os resultados podem ser salvos clicando o &#34; armazenar resultado &#34; botão ( Figura 1). 
	Nota: O software calcula os parâmetros, incluindo o comprimento da cauda de cometa, a porcentagem de DNA cauda, o momento de cauda (TM) e o momento de cauda verde-oliva (OTM). Os momentos de cauda são calculados por fórmulas como segue: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56450/56450eq1.jpg" /> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56450/56450eq2.jpg" /></li> <li>analisar pelo menos 50 células por tratamento.</li>
</ol>

<ol><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Tice, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gel%2Fcomet+assay%3A+guidelines+for+in+vitro+and+in+vivo+genetic+toxicology+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.</a> Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).</li>
<li>Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+in+lead+treated+human+lymphocytes+evaluated+by+micronucleus+and+comet+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays.</a> Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).</li>
<li>Azqueta, A., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+comet+assay%3A+a+comprehensive+guide+to+measuring+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair.</a> Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).</li>
<li>Goldstein, M., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+implications+for+tumor+responses+to+radiation+and+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy.</a> Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).</li>
<li>Gavande, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+targeted+therapy%3A+The+past+or+future+of+cancer+treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment?</a> Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).</li>
<li>Torgovnick, A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+mechanisms+in+cancer+development+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA repair mechanisms in cancer development and therapy.</a> Front Genet. 6, 157(2015).</li>
<li>Weston, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PARP+inhibitor+olaparib+induces+significant+killing+of+ATM-deficient+lymphoid+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo.</a> Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).</li>
<li>Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+Repair+in+Cancer%3A+Beyond+PARP+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors.</a> Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensitivity+of+IDH1-Mutated+Gliomas+Due+to+an+Impairment+in+PARP1-Mediated+DNA+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair.</a> Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).</li>
<li>Konca, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-platform+public+domain+PC+image-analysis+program+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay.</a> Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).</li>
<li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+the+high-throughput+processing+of+slides+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay.</a> Sci Rep. 4, 7200(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O ensaio cometa é uma ferramenta eficiente para medir intervalos de single e double-strand DNA a nível celular. O ensaio foi amplamente aplicado como um "padrão ouro" em estudos sobre a genotoxicidade e biomonitorização13, variando de ligações cruzadas base lesões, DNA, desenvolvimento de drogas e locais sensíveis do alcaloide. No presente estudo, mostramos dois protocolos distintos de passo a passo para ensaios de cometa alcalino e neutro, respectivamente. Combinando a electroforese úni...

O ensaio cometa foi primeiro desenvolvido por Ostling e Johanson, em 1984, demonstrando que a migração do DNA fragmentos dos núcleos sob uma condição neutra1. A técnica foi desenvolvida mais tarde por Singh et al, mostrando que uma condição alcalina aumentou substancialmente a especificidade e a reprodutibilidade do ensaio2. Desde então, o ensaio cometa neutro é usado principalmente para detectar quebras de DNA dupla-hélice, Considerando que o ensaio cometa alcalino é mais sensível para pequenas quantidades de dano do ADN, incluindo único e quebra de DNA de fita dupla, alcaloide-labile sites, DNA-DNA ou Cross-linking da ADN-proteína e quebras de single-strand DNA associadas com incompleta excisão reparar sites3,4. Ambos os ensaios permitem a visualização de DNA fragmentado e fornecem uma maneira simples de avaliar quantitativamente o dano do ADN. O ensaio cometa é considerado como um método sensível para os estudos toxicológicos in vitro e em vivo genéticos e é aplicável a áreas de investigação diferentes, tais como a seleção precoce de drogas-candidato, monitoramento ambiental, a biomonitorização humana, e fundamental Pesquisar no dano do ADN e reparar5.
O princípio do ensaio é que sob um campo elétrico, DNA fragmentado migra para fora do corpo do nucleoide (também conhecido como o "cabeça de cometa") e forma uma mancha de DNA no gel do agarose (também conhecido como a "cauda de cometa"). Com coloração de nucleótidos, a extensão dos danos do DNA pode ser quantificada pela análise "cometas", formados por electroforese esta única célula. Cálculo do momento de cauda mais pode ajudar a comparar o dano do ADN entre diferentes grupos experimentais. Em comparação com métodos tradicionais de detecção de danos do DNA, o ensaio cometa é direta, sensível, barata e relativamente simples.
Radioterapia e agentes quimioterápicos são estratégias comuns para o tratamento de câncer, gerando único filamento e quebras de DNA de fita dupla em cromossomos6. O avanço recente em inibidores de reparação do ADN permite um mais eficaz efeito genotóxico pela quimioterapia de combinação e, portanto, potencialmente reduz os efeitos secundários sistêmicos tais como anemia, infecção e medula óssea supressão7, 8. neste estudo, mostramos a investigação de um inibidor de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), olaparib (Ola)9. PARP é uma proteína nuclear abundante e é responsável pelo reparo de excisão de base de DNA, formando um polímero de poli (ADP-ribose)10. Temozolomide (TMZ) é um Agente alquilante disponível por via oral e tem sido amplamente utilizada para o tratamento do paciente de glioma. Usando o ensaio cometa para quantificar os danos do DNA, demonstramos que combina olaparib com temozolomide profundamente aumenta o dano de DNA em células de glioma, que sugere a terapia combinada de olaparib/temozolomide é uma estratégia eficaz para tratar de glioma, comparado com o temozolomide sozinho11.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS(Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; free)</td><td>TEKnova</td><td>P0196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>TEKnova</td><td>E0308</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Sodium lauryl sarcosinate</td><td>Sigma</td><td>L7414</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>32318</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>95% ethanol</td><td>WARNER-GRAHAM</td><td>#64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>GIBICO</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tissue slides</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>63422-11</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KIMberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td><td>DENVILLE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips</td><td>SHARP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Avanti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>PRECISION</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horizontal electrophoresis chamber</td><td>TREVIGEN</td><td>Cometassay ES II</td><td></td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Quincy Lab</td><td>Model 12-140E</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluating in vitro dna damage using comet assay

Dano do ADN é um fenômeno comum para cada célula durante sua vida útil e é definido como uma alteração da estrutura química do DNA genômico. Terapias de câncer, tais como o rádio e quimioterapia, apresentar a enorme quantidade de danos adicionais de DNA, levando à detenção do ciclo celular e apoptose para limitar a progressão do câncer. Avaliação quantitativa do dano do ADN durante a terapia de câncer experimental é um passo fundamental para justificar a eficácia de um agente genotóxico. Neste estudo, focamos em um ensaio de electroforese única célula, também conhecido como o ensaio cometa, que pode quantificar single e double-strand DNA quebras em vitro. O ensaio cometa é um método de quantificação de dano de DNA que é eficiente e fácil de executar, e tem exigências de tempo/orçamento baixas e alta reprodutibilidade. Aqui, destacamos o utilitário do ensaio cometa para estudos pré-clínicos, avaliando o efeito genotóxico de terapia de combinação olaparib/temozolomide U251 células de glioma.

O presente protocolo descreve um fluxo de trabalho passo a passo para a execução do ensaio cometa e análise de dados (Figura 1). Resultados de ensaios os cometa alcalino e neutro, mostrou que a cauda do cometa de células U251 tratados com doxorrubicina (1 µM, 20 h) era maior e tinha maior intensidade de DNA, sugerindo um acúmulo substancial de DNA fragmentado devido à quimioterapia (Figura 2).
<p class="jove_content" f...

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Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

O ensaio cometa é um método eficiente para detectar danos do DNA incluindo single e double-stranded DNA quebra. Descrevemos o cometa alcalino e neutro de ensaios para medir o dano de DNA em células cancerosas para avaliar o efeito terapêutico da quimioterapia.

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

evaluating-in-vitro-dna-damage-using-comet-assay

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

37.4K visualizações.  National Cancer Institute. O ensaio cometa é um método eficiente para detectar danos do DNA incluindo single e double-stranded DNA quebra. Descrevemos o cometa alcalino e neutro de ensaios para medir o dano de DNA em células cancerosas para avaliar o efeito terapêutico da quimioterapia.

Vídeo: Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Pesquisa do câncer

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human central nervous system (CNS). However, both the cytological origin and the evolutionary process of HBs (including neovascularization) remain controversial, and anti-angiogenesis for VHL-HBs, based on classic HB angiogenesis, have produced disappointing results in clinical trials. One major obstacle to the successful clinical translation of anti-vascular treatment is the lack of a thorough understanding of neovascularization in this vascular tumor. In this article, we present a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in HBs, as well as its role in HBs. With this procedure, researchers can accurately understand the complexity of HB neovascularization and identify the function of this common form of angiogenesis in HBs. These protocols can be used to evaluate the most promising anti-vascular therapy for tumors, which has high translational potential either for tumors treatment or for aiding in the optimization of the anti-angiogenic treatment for HBs in future translations. The results highlight the complexity of HB neovascularization and suggest that this common form angiogenesis is only a complementary mechanism in HB neovascularization.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

This paper presents a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in hemangioblastomas (HBs) and its role in HBs. The results highlight the complexity of HB-neovascularization and suggest that this common form of angiogenesis is only a complementary mechanism in the HB-neovascularization.

Um procedimento abrangente para avaliar o desempenho In Vitro da neovascularização de Hemangioblastoma putativo usando o Spheroid brotando do ensaio

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados ​​no DNA em células Microarrayed Humanos

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Bioengenharia

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other environmental stressors. Use of the comet assay in regulatory testing for genotoxic potential in rodents has been driven by adoption of an Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline in 2014. Comet assay slides are typically prepared from fresh tissue at the time of necropsy; however, freezing tissue samples can avoid logistical challenges associated with simultaneous preparation of slides from multiple organs per animal and from many animals per study. Freezing also enables shipping samples from the exposure facility to a different laboratory for analysis, and storage of frozen tissue facilitates deferring a decision to generate DNA damage data for a given organ. The alkaline comet assay is useful for detecting exposure-related DNA double- and single-strand breaks, alkali-labile lesions, and strand breaks associated with incomplete DNA excision repair. However, DNA damage can also result from mechanical shearing or improper sample processing procedures, confounding the results of the assay. Reproducibility in collection and processing of tissue samples during necropsies may be difficult to control due to fluctuating laboratory personnel with varying levels of experience in harvesting tissues for the comet assay. Enhancing consistency through refresher training or deployment of mobile units staffed with experienced laboratory personnel is costly and may not always be feasible. To optimize consistent generation of high quality samples for comet assay analysis, a method for homogenizing flash frozen cubes of tissue using a customized tissue mincing device was evaluated. Samples prepared for the comet assay by this method compared favorably in quality to fresh and frozen tissue samples prepared by mincing during necropsy. Moreover, low baseline DNA damage was measured in cells from frozen cubes of tissue following prolonged storage.

This protocol describes several procedures for preparing high quality frozen tissue samples at the time of necropsy for use in the comet assay to assess DNA damage: 1) minced tissue, 2) scraped epithelial cells from the gastrointestinal tract, and 3) cubed tissue samples, requiring homogenization using a tissue mincing device.

Uso de tecido congelado no ensaio do cometa para avaliação de danos no DNA

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...

Genética

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Ensaio danos no DNA em neurônios do hipocampo Usando o Ensaio Cometa

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Neurociência

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Ensaio Cometa como uma medida indireta do Systemic Estresse Oxidativo

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Biologia

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In Vivo Alkaline Ensaio Cometa e Enzyme-modificado Alkaline Comet Ensaio para medição Breaks DNA Strand e dano oxidativo ao DNA em Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell function, and therefore DNA damage may play a critical role in the development of, conceivably, all major human diseases, e.g., cancer, neurodegenerative and cardiovascular disease, and aging. Single-cell gel electrophoresis (i.e., the comet assay) is one of the most common and sensitive methods to study the formation and repair of a wide range of types of DNA damage (e.g., single- and double-strand breaks, alkali-labile sites, DNA-DNA crosslinks, and, in combination with certain repair enzymes, oxidized purines, and pyrimidines), in both in vitro and in vivo systems. However, the low sample throughput of the conventional assay and laborious sample workup are limiting factors to its widest possible application. With the "scoring" of comets increasingly automated, the limitation is now the ability to process significant numbers of comet slides. Here, a high-throughput (HTP) variant of the comet assay (HTP comet assay) has been developed, which significantly increases the number of samples analyzed, decreases assay run time, the number of individual slide manipulations, reagent requirements, and risk of physical damage to the gels. Furthermore, the footprint of the electrophoresis tank is significantly decreased due to the vertical orientation of the slides and integral cooling. Also reported here is a novel approach to chilling comet assay slides, which conveniently and efficiently facilitates the solidification of the comet gels. Here, the application of these devices to representative comet assay methods has been described. These simple innovations greatly support the use of the comet assay and its application to areas of study such as exposure biology, ecotoxicology, biomonitoring, toxicity screening/testing, together with understanding pathogenesis.

The comet assay is a popular means of detecting DNA damage. This study describes an approach to running slides in representative variants of the comet assay. This approach significantly increased the number of samples while decreasing assay run-time, the number of slide manipulations, and the risk of damage to gels.

Uma abordagem de ensaio de cometa de alto rendimento para avaliar danos ao DNA celular

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell ...

Alkaline Single Cell Gel Electrophoresis: A Sensitive Technique for Quantitative Estimation of DNA Damage in Individual Cancer Cells Following Chemotherapy

Source: Lu, Y., et al. <a href="https://www.jove.com/v/56450">Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate an alkaline single-cell electrophoresis assay to quantify both single- and double-strand DNA breaks in doxorubicin-treated cells. Alkaline conditions disrupt the hydrogen bonds between DNA base pairs, resulting in the complete unwinding and separation of DNA strands. This allows differential migration of undamaged and damaged DNA fragments in agarose gel upon electrophoresis, revealing a comet-shaped structure of slowly migrating undamaged DNA forming the circular comet head, and rapidly migrating damaged DNA fragments forming the elongated comet tail.

Eletroforese alcalina em gel de célula única: uma técnica sensível para estimativa quantitativa de danos ao DNA em células cancerígenas individuais após quimioterapia

Source: Lu, Y., et al. Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate an alkaline single-cell ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Técnicas Biológicas

Técnicas de Eletroforese

Comet Assay for DNA Damage Detection in Cells

Source: Ji, Y., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63559">A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage.</a> J. Vis. Exp. (2022).
The video demonstrates the comet assay for detecting DNA damage following exposure to harmful agents. Under alkaline conditions, the DNA unwinds and denatures, and upon electrophoresis, the undamaged and damaged DNA migrate differently in the agarose gel, forming a comet-shaped structure. The slowly migrating undamaged DNA forms the circular comet head, while the rapidly migrating damaged DNA fragments form the elongated comet tail.

Ensaio cometa para detecção de danos ao DNA em células

Source: Ji, Y., et al. A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage. J. Vis. Exp. (2022).
The video demonstrates the comet ...

Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

Resumo

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Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

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Uso de tecido congelado no ensaio do cometa para avaliação de danos no DNA

Ensaio danos no DNA em neurônios do hipocampo Usando o Ensaio Cometa

Ensaio Cometa como uma medida indireta do Systemic Estresse Oxidativo

In Vivo Alkaline Ensaio Cometa e Enzyme-modificado Alkaline Comet Ensaio para medição Breaks DNA Strand e dano oxidativo ao DNA em Rat Liver

Uma abordagem de ensaio de cometa de alto rendimento para avaliar danos ao DNA celular

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