O ensaio cometa é amplamente utilizado para avaliar a genotoxicidade. Nosso protocolo oferece uma série de vantagens metodológicas sobre o ensaio padrão de cometas. Nossa tecnologia se concentra em manter as lâminas de cometa padrão verticalmente e ser processada em lotes de 25 em um rack feito para esse fim.
Isso inclui eletroforese, de modo que o tanque é menor, usa menos tampão e tem resfriamento integrado. Sendo mantidos em um rack, os géis delicados nas lâminas são mais protegidos e passam de solução em solução em 25 segundos. Usando nosso protocolo de cometa de sangue, os pesquisadores podem usar uma picada de alfinete de sangue para estudar danos ao DNA em humanos, outras espécies e uma ampla variedade de exposições ambientais potencialmente genotóxicas.
Qualquer um dos diferentes formatos para o ensaio de cometa que usam lâminas de microscópio como suporte sólido para os géis do cometa são passíveis de nossa abordagem. A parte crucial desta técnica é o carregamento de amostras após a mistura com agarose LMP. As amostras devem ser carregadas rapidamente sem fazer bolhas e cobertas com um deslizamento de tampa imediatamente antes de solidificar.
Para começar, prepare a agarose de 0,6% de baixo ponto de fusão em PBS e coloque-a em banho-maria a 37 graus Celsius. Rotule a extremidade fosca das lâminas pré-revestidas com informações de nome, data e tratamento usando um marcador permanente ou lápis. Coloque uma placa de refrigeração em um banco plano e insira dois pacotes de resfriamento congelados na gaveta deslizante abaixo da superfície metálica.
Em seguida, coloque as lâminas na placa de refrigeração para pré-esfriar por um a dois minutos. Centrifugar e remover o sobrenadante dos tubos de amostra e colocá-los imediatamente de volta no gelo. Ressuspeite o pellet celular com 200 microlitros de agarose de 0,6% de baixo ponto de fusão e misture por pipetagem.
Em seguida, adicione 80 microlitros de células contendo agarose em uma lâmina resfriada e coloque rapidamente uma folha de cobertura no gel. Deixe o gel assentar na placa de arrefecimento durante um a dois minutos. Enquanto isso, prepare 500 mililitros de solução de trabalho de tampão de lise e despeje-o no prato de lise.
Depois que os géis se ajustarem, remova os deslizamentos da tampa rapidamente, segurando suavemente o deslizamento entre o polegar e o indicador e deslizando o deslizamento da tampa para fora do gel. Em seguida, coloque os slides dentro de um suporte de slide com todas as marcas de pontos pretas nos slides voltados para a mesma direção. Coloque o suporte deslizante dentro do prato de lise.
Feche a tampa do prato de lise e coloque-o para incubação. Retire cuidadosamente o suporte deslizante do prato de lise sem perturbar os géis. Coloque suavemente o suporte deslizante em uma máquina de lavar pré-carregada com água gelada de destilação dupla.
Certifique-se de que os slides estão completamente submersos e deixe a configuração por 30 minutos. Coloque um pacote de resfriamento congelado sob o tanque de eletroforese para manter a temperatura ideal do tampão. Em seguida, adicione a solução de trabalho de eletroforese gelada ao tanque e transfira o transportador de lâmina para ele.
Oriente as lâminas de modo que os géis contendo células apontem para o cátodo. Incube as lâminas no tanque de eletroforese por 20 minutos para permitir que o DNA se desenrole. Em seguida, ligue a fonte de alimentação para realizar eletroforese por 20 minutos a 1,19 volts por centímetro.
Após a conclusão da eletroforese, desligue a fonte de alimentação e remova o suporte deslizante do tanque de eletroforese. Deixe o suporte da lâmina escorrer em papel de seda por 30 segundos. Em seguida, coloque o suporte deslizante em um prato contendo tampão de neutralização e deixe-o por 20 minutos.
Em seguida, coloque-o em um prato de lavar roupa contendo água gelada de destilação dupla e deixe-o por 20 minutos. Após a lavagem, retire o transportador de lâminas da água e deixe as lâminas secarem em uma incubadora a 37 graus Celsius por uma hora. Para reidratar as lâminas, transfira o suporte de lâminas para um prato de lavagem contendo água gelada de destilação dupla e deixe-a por 30 minutos.
Em seguida, coloque o transportador deslizante em um prato de coloração contendo 2,5 microgramas por mililitro de solução de iodeto de propídio. Feche a tampa do prato de coloração e incube-o por 20 minutos no escuro à temperatura ambiente. Após a incubação, transfira o transportador de lâminas para um prato separado e lave-o com água gelada de dupla destilação por 20 minutos.
Retire o suporte deslizante do prato e seque-o completamente no escuro, seja em uma incubadora de 37 graus Celsius ou à temperatura ambiente. Depois que os slides secarem completamente, armazene-os em uma caixa de slides no escuro até que estejam prontos para a análise da imagem. Os queratinócitos humanos foram irradiados com diferentes doses de UVA e UVB ou tratados com peróxido de hidrogênio 50 micromolares para induzir danos ao DNA.
A tensão ótima foi de 1,19 volts centímetros, pois induz a resposta mais sensível e a maior porcentagem de DNA da cauda. O sangue total humano foi irradiado com diferentes doses de UVA e tratado com diferentes concentrações de Fpg. O ensaio de cometa alcalino de alto rendimento revelou que os níveis ótimos de dano ao DNA foram induzidos com quatro unidades por mililitros de Fpg.
A linhagem celular de câncer de ovário SK-OV-3 foi tratada com uma combinação de cisplatina e peróxido de hidrogênio. As células não expostas não apresentaram danos. A exposição ao peróxido de hidrogênio por si só gerou um momento médio significativo da cauda de oliveira em comparação com as células nas quais as ligações cruzadas intrafilamentares de DNA foram induzidas.
Após o tratamento com cisplatina 100-micromolar, as ligações cruzadas intrafilamentares de DNA aumentaram com um pico em 12 horas, após o que os níveis diminuíram para zero após 30 horas É essencial colocar o bloco de gelo no tanque de eletroforese e incubar lâminas por 20 minutos para desenrolar o DNA antes da eletroforese. Este passo ajudará o DNA danificado a viajar pela corrente. Executar o ensaio com slides colocados verticalmente nos permitiu automatizar o ensaio do cometa.
Além disso, nossa técnica simplificou o ensaio de cometas para pesquisa.
