Este trabalho foi apoiar principalmente por 5-UO1-ES016045 com apoio parcial do 1-R21-R44-ES019498 e ES021116. DMW foi apoiado pela Formação Grant NIEHS em Toxicologia Ambiental T32-ES007020. O equipamento foi fornecido pelo Centro de Ciências da Saúde Ambiental P30-ES002109.

1 Preparação de Chip <ol style="margin-left: 40px;"><li> Remover gel chip da embalagem e coloque em um lado de um filme bem placa retangular, gel para baixo. </li><li> Lavar em gel em 25 ml de 1x PBS durante 15 min, repetir duas vezes. </li><li> Situado em gel em placa de vidro e da orientação da etiqueta de gel em conformidade. </li><li> Pressione suavemente um fundo placa de 96 poços invertido no gel; certificar-se de que todas as cavidades da placa de fundo bem dentro da área do gel. </li><li> Use 1,5 &#39;&#39; grampos da pasta em cada lado da placa de fixação para fixar com o vidro. </li><li> Aspirar o excesso de tampão PBS em cada poço. </li></ol> 2. Carregando Células <ol style="margin-left: 40px;"><li> Preparar suspensões de células: <ol><li> Para as linhas de células em suspensão, dilui-se a suspensão de células no meio para se obter uma concentração final de 10 5 a 10 6 células / ml. </li><li> Para as linhas de células aderentes, siga DESMONTAR / protocolos tripsinização normais e dilute células isoladas em meio a uma concentração final de 10 5 a 10 6 células / ml. Se as células agregam, passar a suspensão das células em um filtro de células para obter uma suspensão de célula única. </li></ol></li><li> Adicionar 100 ul de suspensão celular a cada poço da placa de 96 poços. </li><li> Cobrir a placa com película de gel para evitar a evaporação dos meios de comunicação. </li><li> Permitir que as células de carga durante pelo menos 30 minutos em 37 ° C incubadora. </li><li> Remover chip da mídia incubadora e aspirado de cada poço. </li><li> Remover grampos da pasta e sem fundo placa de 96 poços; segurar o chip, com a placa de vidro, num ângulo e lavar com 1x PBS para remover o excesso de células em agarose. </li><li> Verifique carregamento celular usando um microscópio de campo claro com uma lente objetiva de 4X. Se o carregamento não se tem observado, repita a partir do passo 2.1. </li><li> Coloque chips carregados numa superfície uniforme (bancada de laboratório). Chip de sobreposição com 1% de baixo ponto de fusão (LMP) de agarose, que é pré-aquecido a 37 ° C. Use aproximadamente 2̵1, 3 ml de agarose LMP é necessária para cada chip. </li><li> Permitir sobreposição para solidificar primeiro à temperatura ambiente durante 3 minutos e em seguida mover-se para 4 ° C durante 5 min refrigerador para a gelificação completa. </li></ol> 3. Dosagem e Reparação NOTA: Para estudo de base nível de dano do DNA, pule para o Passo 4. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Alinhar cuidadosamente os poços de o chip (criado a partir de aperto anterior), com os poços de um novo fundo de 96 poços da placa. Re-pressione o fundo placa de 96 poços em aperto superior e prenda com grampos da pasta. </li><li> Adicionar 100 ul de química de dose desejada para cada poço da placa de 96 poços; realizar dosagem / tratamento em gelo ou a 4 ° C em frigorífico durante período de tempo desejado. </li><li> Após a dosagem, produtos químicos aspirado de cada poço e lavar afastado químico residual usando 1x PBS. Se o dano direto é estudada aqui, vá para a Etapa 4. </li><li> Para estudar a cinética de reparação, permitir que as células no chip para reparar emmeios de comunicação, a 37 ° C. Lyse (vá para a Etapa 4) em momentos específicos. NOTA: O reparo pode ser realizada on-chip com um fundo da placa de 96 poços em anexo, ou o chip pode ser cortado em partes separadas, após a remoção do fundo da placa de 96 poços. </li></ol> 4. Lise <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para realizar o ensaio cometa alcalino: <ol><li> Fazer funcionar tampão de lise alcalina pela adição de 1% de Triton X-100 a alcalino solução estoque de lise (2,5 M de NaCl, 100 mM de Na 2 EDTA, 10 mM Tris, de pH 10). Prepare a cerca de 25 ml de tampão de lise de trabalho para cada chip. </li><li> Pré-tampão de lise frio de trabalho alcalino, a 4 ° C. </li><li> Submerge chip no tampão de lise frio de trabalho e permitir que a lise alcalina para executar O / N a 4 ° C em frigorífico. </li></ol></li><li> Para realizar o teste do cometa neutro: <ol><li> Fazer funcionar tampão de lise neutro através da adição de 1% de Triton X-100 e 10% de DMSO a uma solução estoque de lise neutro (2,5 M NaCl, 100 mM de Na 2 EDTA, 10mM de Tris, 1% de N -Lauroylsarcosine, pH 9,5). Prepare a cerca de 25 ml de tampão de lise de trabalho para cada chip. </li><li> Pré-aquecer a trabalhar tampão de lise neutro a 43 ° C. </li><li> Submerge chip no tampão de lise de trabalho quente neutra e permitir realizar a lise S / N em 43 ° C incubadora. </li></ol></li></ol> 5. Eletroforese <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para realizar o ensaio cometa alcalino: <ol><li> Remover o tampão de lise e lavar rapidamente com chip de 1x PBS. </li><li> Chip de seguro em uma câmara de eletroforese com gel lado filme voltado para baixo usando a fita dupla face. </li><li> Traga a câmara a 4 ° C, uma sala fria. </li><li> Encher a câmara com tampão frio electroforese alcalina (NaOH 0,3 M, 1 mM de Na 2 EDTA) a um nível que apenas cobre o gel. </li><li> Permitir para relaxar alcalina por 40 min. </li><li> Executar electroforese a 1 V / cm e 300 mA durante 30 minutos em câmara fria. Ajuste o volume de tampão de eletroforese no chaMBER alcançar corrente que desejado. </li></ol></li><li> Para realizar o teste do cometa neutro: <ol><li> Remover o tampão de lise e enxaguar chip com tampão de electroforese neutro (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM Tris, 90 mM ácido bórico, pH 8,5), durante 2 x 15 min a 4 ° C. </li><li> Chip de seguro em uma câmara de eletroforese com gel lado filme voltado para baixo usando a fita dupla face. </li><li> Traga a câmara a 4 ° C, uma sala fria. </li><li> Encher a câmara com tampão de electroforese neutro frio (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM Tris, 90 mM ácido bórico, pH 8,5) a um nível que apenas cobre o gel. </li><li> Permitir que o gel de sentar-se em câmara fria por 60 minutos. </li><li> Executar electroforese a 0,6 V / cm e 6 mA durante 60 minutos em câmara fria. Ajustar o volume de tampão de electroforese na câmara até atingir actual funcionamento desejado. </li></ol></li></ol> 6. imagem fluorescente <ol style="margin-left: 40px;"><li> Remover chip da câmara de electroforese de colsala d. </li><li> Neutraliza-se os géis em tampão de neutralização (0,4 M Tris, pH 7,5), durante 2 x 15 min em 4 ° C frigorífico. </li><li> Manchar o chip com mancha DNA fluorescente de escolha (ou seja, ouro SYBR, brometo de etídio) sob a fábrica recomenda procedimentos. Imagem por microscopia fluorescente. </li></ol> Análise de Dados 7. Analisar imagens do cometa por software ensaio cometa padrão como Komet 5.5.

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The CometChip has been licensed to Trevigen, Inc. based upon a patent submission that includes Wood, Weingeist, Bhatia and Engelward.

Genotoxinas onipresente no meio ambiente e também dentro das células humanas exercem estresse inevitável e danos ao DNA celular. De facto, foi estimado que existem 1,000 s de lesões do ADN presentes em células humanas em estado estacionário 18. Entender a susceptibilidade a danos e cinética de reparo em humanos não só traz conhecimento para a pesquisa básica, mas também beneficia o desenvolvimento de drogas. Ironicamente, apesar de a capacidade de dano ao DNA para promover o câncer, agentes danificadores do ADN são utilizados em níveis muito elevados para o tratamento de câncer, fazendo com que o conhecimento sobre o dano ao DNA e reparar relevantes para a medicina personalizada. O CometChip é um dispositivo de pesquisa romance que utiliza práticas de microfabricação para revolucionar um ensaio de dano ao DNA de longa existiu. Com base nos mesmos princípios do ensaio do cometa tradicional, o chip oferece significativamente maior rendimento e melhor reprodutibilidade. Descrevemos aqui métodos para usar este chip. Para esclarecer sua utilidade e robustez, mostramos resultados from várias experiências em que o chip foi usado para avaliar os danos induzidos por vários agentes que danificam o ADN diferente, e desde que tenha sido utilizado para avaliar a reparação do ADN. Juntos, os resultados aqui apresentados fornecem informações úteis para o uso do chip e demonstrar sua ampla aplicabilidade a investigação sobre os danos e reparo do DNA. Um dos passos mais importantes neste protocolo é realizar o carregamento de células eficaz. Muitas linhas celulares foram testadas neste sistema, incluindo tanto a suspensão e as células aderentes. Carregando a eficácia depende de muitas variáveis ​​tais como o tipo de células, o tamanho das células, a concentração de carga e tempo. Linhas de células em suspensão, tais como células linfoblastoides são os mais fáceis de se trabalhar. A concentração da suspensão de células pode variar de abril 10-junho 10 células por 96 poços e carregamento normalmente completa em 15-30 min. Densidade celular mais elevada facilita o carregamento e diminui a quantidade de tempo necessário para que as células se instalam nos micropoços. Parâmetros de carregamento de células aderentes pode ser diferente a partir de células em suspensão. As linhas celulares, tais como de ovário de hamster chinês (CHO) células, foram encontrados a ter semelhante eficiência de carga, como as células em suspensão (a seguir tripsinização) e, assim, utilizar condições de carga semelhantes. Outros tipos de células, tais como células tumorais que formam facilmente agregados de células em suspensão, requerem um tratamento adicional. Passando suspensões de células através de um filtro de uma única célula e adicionando tripsina para a mídia suspensão pode suprimir a formação de grupos de células durante o carregamento. Finalmente, em termos de tempo de carga, o tempo requerido para a captura de linhas de células aderentes em micropoços pode variar de 20 minutos a 1 hora. Como resultado, é recomendável que os usuários realizam experiências-piloto para determinar as condições de carga ideais antes de proceder a novas investigações. Carregando eficácia pode ser visualizada sob um microscópio de campo brilhante ou, mais precisamente através da coloração revelou que as células encapsuladas com DAPI ou outro DNAmanchas antes da avaliação sob o microscópio fluorescente. Uma grande vantagem deste método é a versatilidade e chip. Primeiro, os pesquisadores não estão restritos a uma concentração de células de trabalho específico, porque as células em excesso são lavados, eo microarray garante uniforme cometa densidade. Em segundo lugar, os micropoços podem ser feitas com tamanhos variados para acomodar os tipos de células de diferentes tamanhos. Em circunstâncias que várias células são capturadas em uma única microplaca, cometas multi-celulares são resultados de auto-calibrada e rendimento consistente em comparação com os cometas unicelulares 6,7. Outro benefício da padronização de células em um microarray é que todos os cometas são então no mesmo plano focal com posições fixas, reduzindo o ruído causado por cometas desfocados e facilitando a imagem e análise automatizada. As melhorias significativas no rendimento e sensibilidade fornecidas pelo CometChip permitir a aplicação do ensaio para os estudos de grande escala. Tomados em conjunto, o chip fornecersa ferramenta valiosa para avaliação de danos de DNA para pesquisadores, toxicologistas, epidemiologistas e clínicos. Enquanto o ensaio de cometa é conhecida pela sua excelente sensibilidade na detecção de uma ampla gama de danos no ADN, este ensaio também padece de baixa especificidade. Usando este protocolo melhora a reprodutibilidade e rendimento do ensaio, mas não demonstra avanço na especificidade. No entanto, o ensaio de multiplexagem com outras metodologias tem sido relatada como sendo eficaz na obtenção de uma maior especificidade. Um exemplo é a inclusão de enzimas específicas de lesão purificadas. Estas enzimas podem converter lesões de base de outra forma indetectáveis ​​em rupturas dos filamentos detectáveis ​​e sítios abásicos 1,19-21. Um exemplo amplamente utilizado é o reparo endonuclease-DNA formamidopyrimidine glicosilase (FPG), o que revela modificações no DNA oxidativo 19,22. Uma vez que o passo de digestão enzimática é aplicado após a lise celular, o sistema pode ser tratado da mesma maneira que umsa tradicional slides agarose sem alterações no protocolo. Embora o protocolo detalhado não é aqui descrito, esta abordagem foi adaptada por muitos utilizadores ensaio cometa tradicionais no passado e os protocolos podem ser facilmente encontrados. Em publicação anterior, foi utilizado este método para identificar induzida por luz fluorescente dano 22. A maior vantagem deste método é a taxa de transferência que proporciona, que abre as portas para os estudos que foram anteriormente virtualmente impossível. A capacidade de processamento de 96 amostras na mesma plataforma, não só reduz o trabalho e o tempo, mas também reduz o ruído experimental e aumenta muito a reprodutibilidade. Variação inter amostras é significativamente menor do que a variação tradicional slide-a-deslizante, que pode ser 2 vezes maior do que a variação observada com este chip 6,7. Redução de ruído também leva a melhor sensibilidade, permitindo a detecção de diferenças mais sutis entre as amostras. Uma vez que o dispositivo emprega um standard formato de 96 poços, é compatível com equipamentos de investigação geral e HTS tecnologias. Considere-se um estudo que requer uma avaliação de 100 amostras, assumindo que um pesquisador média pode processar ~ 30 lâminas de vidro ao longo de vários dias. Tendo em conta que cada amostra deve ser realizada em triplicado, que levaria cerca de um mês para completar esse estudo, que também sofreria inevitavelmente de amostra para amostra variação. Em contraste, o processamento de 100 condições, cada um em triplicado, com este chip requer apenas alguns pratos e pode ser realizada em três dias. Esta melhoria significativa na taxa de transferência abre as portas para estudos que antes eram inatingíveis. O protocolo aqui apresentado descreve ambos os procedimentos básicos para a realização do teste do cometa padrão e as etapas modificadas necessários para usar a plataforma CometChip. Com a capacidade de medir os níveis de danos ao DNA inerentes ea resposta posterior reparação, o ensaio é altamente relevante parauma variedade de aplicações biológicas e clínicas. Informações sobre o impacto da exposição a produtos químicos específicos no genoma facilita a prevenção e tratamento da doença. Além disso, há também um interesse significativo em determinar as variações na sensibilidade do dano no DNA e capacidade de reparação entre indivíduos 23,24. Esta técnica proporciona o rendimento necessário para tais estudos em larga escala. O conhecimento sobre as variações inter-individuais é fundamental para identificar pessoas suscetíveis e para a concepção de terapias individualizadas ou estratégias de prevenções. Tomados em conjunto, a tecnologia aqui apresentada proporciona um elevado rendimento, plataforma objectivo e análise quantitativa de dano de ADN que tem o potencial para se tornar uma metodologia padrão no futuro próximo.

A eletroforese em gel de célula única (SCGE) ensaio (também conhecido como o teste do cometa) é uma técnica amplamente utilizada para a quantificação de um amplo espectro de lesões de DNA, incluindo lesões da base, sitios não básicos, rupturas dos filamentos individuais, rupturas de filamentos duplos, ligações cruzadas e sensível alcalino locais. O princípio subjacente ao doseamento é que o DNA danificado migra mais rapidamente do que o ADN não danificado devido a fragmentação e perda de estrutura superhelical. A extensão da migração é proporcional à quantidade de dano de ADN, e podem ser visualizados por microscopia de fluorescência. -Captura de imagem e análise de perfil de intensidade de DNA em forma de cometa indivíduo em seguida, entregar as medições de parâmetros tais como o comprimento da cauda, ​​momento de cauda, ​​e% DNA na cauda para revelar o nível de danos no DNA em uma célula 1-4. Atualmente, existem duas versões comumente utilizados do ensaio do cometa: a) ensaio cometa alcalino e b) teste do cometa neutro. O ensaio cometa alcalino é o mais amplamenteversão utilizada, que usa um tampão de pH elevado para relaxar antes de eletroforese de DNA e, assim, detectar todos os tipos de quebras de fita e sítios álcali-sensíveis. O ensaio do cometa neutro, por outro lado, é menos experiente porque usa um tampão neutro para manter as hélices duplas e detectar apenas quebras da cadeia dupla 2,5. Para agentes químicos e físicos que induzem DSBs, SSBs são criados em conjunto, e são formadas em níveis muito mais elevados (por exemplo, SSBs induzidas γIR são uma ordem de magnitude mais comum do LAP). Para a maioria de DNA exposições prejudiciais, LAP são muito menos freqüentes do que outras classes de danos no DNA, e são, portanto, mais difíceis de detectar. Temos demonstrado em publicações anteriores, a janela de detecção de ambas as versões. 6,7 Embora o teste do cometa tem sido utilizado rotineiramente para pesquisa básica sobre danos e reparo do DNA e testes de genotoxicidade 1,2,8-15, o ensaio foi relatado ter fraca reprodutibilidade devido à amostra-a-exemplo, pessoa-a-pessoa e variabilidade de laboratório para laboratório. Além disso, o ensaio é de baixa taxa de transferência, em parte porque a aquisição de imagem e análise de dados são trabalhosos. Juntas, essas limitações contribuem para a sua relativamente baixa aceitação em estudos de grande escala. Através da integração de tecnologias e princípios de engenharia, o CometChip traz uma solução para os problemas de rendimento e inconsistências que estão associados com o ensaio cometa tradicional 6,7. Resumidamente, para criar o chip, de um molde é microfabricados utilizando fotolitografia para criar microposts com diâmetros tão pequenos como a de uma única célula. O molde é, então, utilizada para estampar em agarose fundida, resultando num conjunto de micropoços depois solidifica gel. Fichas estão sendo desenvolvidos para fornecer aos pesquisadores poços de tamanho variável para compatível com diferentes tipos de células. Para carregar o chip, as células em meios de comunicação estão autorizados a instalar-se nos poços de gravidade; células em excesso são lavados. As células são então presos nos encapsuladoção de uma fina camada de agarose de baixo ponto de fusão, e uma placa de 96 cavidades sem fundo é então presa à superfície do gel para criar macrowells 96, cada um com centenas de micropoços na sua superfície inferior. Este protocolo descreve os procedimentos gerais para experimentos com esse chip, que incluem preparação de gel, o carregamento de células, dosagem e reparação, a lise celular, eletroforese, e imagens fluorescentes. Demonstramos dois exemplos de experiências de resposta à dose com células linfoblásticas expostas conhecido agentes danificadores de ADN, utilizando versões neutras e alcalinas de ensaio, respectivamente. Duas experiências de reparação também são mostradas a descrever como a resposta de reparação pós-exposição pode ser avaliada usando o sistema.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="797">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">UltraPure LMP Agarose (low melting point)</td>
			<td style="width:129px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">16520</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td style="width:129px;">Gibco by life technologies</td>
			<td style="width:101px;">14190</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaCl</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7581-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Na2EDTA</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">4931-04</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (base)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (acid)</td>
			<td style="width:129px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:101px;">4106</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline N-lauroylsarcosine</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L9150</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">X100</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D4540</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaOH</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7708-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">BDH3871</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline boric acid</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">B6768</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Equipments</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">CometChip</td>
			<td style="width:129px;">Trevigen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1-well dish</td>
			<td style="width:129px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:101px;">73521-420</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Bottomless 96-wel plate</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">655000-06</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5&#8243; binder clips</td>
			<td style="width:129px;">Staples</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass plate</td>
			<td style="width:129px;">Tag Hardware</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Customized to size of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Owl Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">27372-131</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:101px;">164-5050</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cometchip: a high-throughput 96-well platform for measuring dna damage in microarrayed human cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

Neste primeiro exemplo, descreve-se a abordagem para a quantificação dos níveis iniciais de danos ao DNA em células linfoblastóides humanas após exposição a dano oxidativo utilizando H 2 O 2. A fim de avaliar a H 2 O 2 a lesões induzidas por base e quebras de cadeia simples, são utilizadas condições de cometa alcalinas. Após o carregamento está completo e as células foram encapsuladas com a camada de agarose, um fundo de 96 poços da placa é pressionada contra a superfície 96 para criar-compartimentos no chip. Cada um dos 96 poços pode ser doseada com um tipo ou a concentração de produtos químicos diferentes. Aqui foram utilizadas quatro doses diferentes de H 2 O 2 e 1x PBS foi utilizado como controlo negativo. Imagens representativas de cometas dispostas são mostrados na Figura 1A, em que o não-tratada (em cima), 50 ^ M (meio) e 100 uM (parte inferior) H 2 O 2 -exposed amostras demonstrado diferentes níveis de cauda do cometa. Análise de imagens de cometa pode ser performed utilizando software disponível comercialmente, que geralmente quantifica os níveis de danos com base na intensidade da fluorescência e da migração distância total de cada cauda do cometa. Medidas são comumente realizados em 50 a 100 cometas por condição e do valor médio (ou rabo% DNA ou comprimento da cauda) é calculado. Figura 1B ilustra a curva de resposta DNA percentual cauda analisados ​​a partir das TK6 cometas celulares linfoblastóides expostos a quatro concentrações diferentes de H 2 O 2. A consistência entre os experimentos independentes demonstra a eficácia desta abordagem na avaliação da resposta a danos do DNA de vários níveis de tratamentos químicos nas células. Para aprender mais sobre a variação entre as amostras (por exemplo, entre macrowells) e entre as repetições da mesma experiência, inter-amostra e da variabilidade inter-experimental foi representada graficamente na figura 2A e 2B, respectivamente. Dentro de cada experiência, cada uma das cavidades da 96-wchip de ell é equivalente ao de uma amostra diferente e, por conseguinte, a variação de poço a poço revela a variação inter-amostra do dispositivo. Aqui, TK6 carregadas em poços de 12 a 96 poços de chips foram tratados com a mesma dose de H 2 O 2 e imediatamente lisadas após o tratamento. Todas as outras etapas experimentais foram realizados em paralelo e as medianas de pelo menos 50 cometas de cada macrowell foram plotados na Figura 2A. A média das medianas é 77,53% no ADN da cauda, ​​com o desvio padrão é de 3,99%. A partir destes dados, calcula-se que o coeficiente de variação entre as amostras é de 5,2%, o que é várias vezes inferior do que o tradicional ensaio, o que demonstra a melhoria da robustez deste ensaio de 6,16. Para aprender mais sobre a reprodutibilidade do ensaio, foram expostas TK6 num chip com 75 pM de H 2 O 2 e analisar o nível imediata de danos no ADN. Esta experiência foi repetida seis vezes e os dados de cada experiência foi representada graficamente em Figura 2B. Sob condições experimentais idênticas, obtivemos resultados que variaram entre 41,76% e 57,87%, mostrado como barras cinzentas na figura. A média de seis repetições é 49,57%, com o erro padrão da média de apenas 2,04%. A baixa variação entre repetições implica que o teste do cometa realizadas neste novo dispositivo é altamente reprodutível. Para avaliar a cinética de reparação, as células são permitidos para reparar o ADN em meio fresco após o tratamento. Lise macrowells em vários pontos de tempo revela a mudança no dano do DNA ao longo do tempo. Um exemplo é mostrado na Figura 3. Nesta experiência, as células foram encapsuladas TK6 primeiro no chip, tratadas com 50 pM de H 2 O 2, e deixou-se reparar e 60 minutos pós-exposição. As células foram lisadas com 0, 20, 45 e 60 min, respectivamente. Comet imagens representativas em diferentes pontos de tempo são mostrados na Figura 3A, e a mudança nos níveis de danos de DNA ao longo do tempo está traçada na figura3B. Estes dados revelaram que quase todo o dano é reparado no prazo de 45 min pós H 2 O 2 tratamento. Muitas variáveis ​​podem afetar a taxa de reparação, incluindo o tipo de linha celular e agente químico utilizado. Por isso os pesquisadores podem fazer alterações ao protocolo (ou seja, aumentando o tempo de reparação) para acomodar as necessidades adicionais em suas investigações. Aqui nós fornecemos um outro exemplo de reparação experiência usando este chip, onde TK6 são desafiados com um agente genotóxico diferente N-metil-N &#39;-nitro-N -Nitrosoguanidine (MNNG) é um agente alquilante conhecida por induzir lesões de base, incluindo 7-metilguanina e 3-metiladenina. Estas lesões são convertidos em sítios abásicos, quer por despurinação espontânea ou por remoção enzimática por glicosilase de ADN. O sítio abásico resultante pode ser clivada sob condições alcalinas e, assim, detectada no chip. Exposição inicial provoca um aumento significativo no dano, evidente a partir da longacaudas, e ao longo do tempo essas caudas são reduzidas como as células restaurar DNA intacto durante o reparo. Apesar de alquilação e danos oxidativos são reparadas principalmente por tanto a via de reparação de excisão de bases, a quantidade de lesões geradas e as proteínas envolvidas na reparação variar. Estas variações podem conduzir a diferentes taxas de conversão em sítios abásicos, bem como diferentes taxas de reparação dos sítios abásicos resultantes. Na Figura 4, a cinética de reparação de TK6 expostos a 0,1, 1, e 3 ug / ml de MNNG são mostrados. Neste experimento, estendeu o tempo de experiência de 2 horas após a exposição, porque o dano induzido por MNNG parece persistir por mais tempo e é eliminado em um ritmo mais lento em comparação com H 2 O 2 induzida por danos. Análise de LAP, usando condições neutras é muito semelhante ao protocolo para a análise de lesões de cadeia simples, utilizando as condições alcalinas. Para mostrar os níveis de danos iniciais, TK6 foram expostos a níveis variáveis ​​de Gir,<html> e as células resultantes foram lisadas e submetidas a electroforese a um pH neutro (Figura 5A). É digno de nota que a morfologia das caudas de cometa é diferente das condições de ensaio alcalinas. Para obter o DNA fragmentado observável com este ensaio, a dose IV utilizado é significativamente mais elevada (0-100 Gy) do que a dose necessária para ver danos usando as condições alcalinas. Além disso, verificou-se que o comprimento da cauda é o parâmetro mais sensível para refletir a extensão dos danos do DNA quando se utiliza o teste do cometa neutro 7. A curva de resposta a dose analisada é ilustrada na Figura 5B. Reparação de ADN quebras de cadeia dupla em células também pode ser avaliada, e foi mostrado por Weingeist et. al. 7. Tomados em conjunto, o CometChip neutro oferece uma valiosa ferramenta para análise de alta taxa de transferência de DNA LAP. &quot;Width =&quot; 1highres.jpg 500 &quot;/&gt; Figura 1. H 2 O 2 de dose de resposta de células utilizando o ensaio TK6 cometa alcalino. (A) cometas micropoços dispostas de linfoblastos não tratados TK6 (topo) e TK6 expostas a 50 ^ M (meio) e 100 uM (parte inferior) H 2 O 2 durante 20 min a 4 ° C. A barra de escala é 100 um. (B) H 2 O 2 a resposta à dose de TK6 expostas a níveis diferentes de H 2 O 2. Cada ponto de dados é a média de três experiências independentes, em que a percentagem média da cauda de ADN de pelo menos 50 cometas individuais foi obtido em cada experiência. As barras de erro representam o erro padrão da média de três experimentos independentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Inter-Sample e Inter-Experimental variabilidade. (A) variação de amostra-a-amostra. As células linfoblásticas humanas TK6 foram carregadas em poços de 12 a 96 poços de chip. Cada poço foi exposto a 100 ul de 50 uM de H 2 O 2 durante 20 min a 4 ° C. As células foram de imediato lisadas e ensaiadas quanto à% de ADN da cauda. Os dados de cada poço é mostrado aqui. Cada caixa representa a mediana de, pelo menos, 50 cometas individuais de cada poço. A média das 12 cavidades é 77,53%, o desvio padrão é de 3,99%, e o coeficiente de variação é calculada para ser 5,2%. (B) variação Experiment-to-Experiment. As células linfoblásticas humanas TK6 foram carregados para o chip de 96 poços, expostas a 100 ul de 75 uM de H 2 O 2 durante 20 min a 4 ° C. As células foram de imediato lisadas e ensaiadas quanto à% de ADN da cauda.A mesma experiência foi repetida 6 vezes e os dados de cada repetição é mostrado como uma barra cinzenta. Cada caixa representa a mediana% da cauda de ADN de pelo menos 100 cometas individuais de cada repetição. A média de 6 repetições é 49,57%, como a barra de volta aqui. O desvio padrão de seis repetições é de 4,99%, e o erro padrão da média é calculada para ser de 2,04%, representado como a barra de erro na figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" width="500" /> Reparação de H 2 O 2 induzida por danos Figura 3. Nos linfoblastos TK6. (A) Esquema do estudo de reparo com cometas representativas. TK6 são tratadas com agentes de danificação e deixou-se em meios de reparar a 37 ° C antes da lise. (B) uma cinética de reparação de TK6 após o tratamento com 50 uM de H 2 O 2 durante 20 minutos a 4 &amp; #176; C. Cada ponto de dados é a média de três experiências independentes, em que a percentagem média da cauda de ADN de pelo menos 50 cometas individuais foi obtido em cada experiência. As barras de erro representam o erro padrão da média a partir de experimentos repetidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Reparação dos danos induzidos pela MNNG em linfoblastos TK6. TK6 são tratados com 0,1, 1, e 3 ug / ml de MNNG durante 30 min a 4 ° C e deixou-se em meios de reparar a 37 ° C até 120 minutos pós exposição. A percentagem média da cauda de ADN de pelo menos 50 cometas individuais foi obtido para cada uma das três experiências independentes. As barras de erro representam o erro padrãoda média de três experiências independentes. <img alt="Figura 5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" width="300" /> Figura 5. Resposta a dose IV de TK6 utilizando o ensaio cometa neutro. (A) em matriz cometas micropoços de linfoblastos não tratados TK6 (em cima) e TK6 expostas a 40 Gy (meio) e 80 Gy (inferior) irradiação gama. A barra de escala é 100 um. Dose-resposta (B) IR de TK6 expostos a vários níveis de radiação gama. Cada ponto representa o comprimento da cauda mediana (mm) de pelo menos 300 cometas agrupados de seis macrowells no chip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

Descrevemos aqui uma plataforma que permite a detecção de teste do cometa de danos no DNA, com taxa de transferência sem precedentes. Os padrões de dispositivos de células de mamíferos para um microarranjo e permite o processamento em paralelo de amostras 96. A abordagem facilita a análise de danos ao DNA nível base, danos ao DNA induzidos por exposição e reparo do DNA cinética.

CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados ​​no DNA em células Microarrayed Humanos

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

cometchip-high-throughput-96-well-platform-for-measuring-dna-damage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.2K visualizações.  Massachusetts Institute of Technology.  Descrevemos aqui uma plataforma que permite a detecção de teste do cometa de danos no DNA, com taxa de transferência sem precedentes. Os padrões de dispositivos de células de mamíferos para um microarranjo e permite o processamento em paralelo de amostras 96. A abordagem facilita a análise de danos ao DNA nível base, danos ao DNA induzidos por exposição e reparo do DNA cinética. 

Vídeo: CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Microcápsulas de alginato como uma plataforma 3D para Propagação e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias (hESC) para diferentes linhagens

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Bioengenharia

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

Alto rendimento Gerador Protein Expression Usando uma plataforma microfluídica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

Plataforma microfluídica para medição de quimiotaxia de neutrófilos não transformados Sangue Total

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Uso do elevado-Throughput Microbioreactor sistema automatizado para produção de IgG1 modelo em células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Fenotipagem de tensão de levedura de alta produtividade com sequenciamento de RNA baseado em gotículas

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Desenvolvimento de tecido cardíaco humano organizado 3D dentro de uma plataforma microfluida

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados ​​no DNA em células Microarrayed Humanos

CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados no DNA em células Microarrayed Humanos