Gostaríamos de agradecer a LHW Stiftung, em Triesen, Liechtenstein, pelo apoio financeiro a nossa pesquisa sobre o estresse oxidativo.

Estudos sobre ensaio do cometa realizadas na Universidade de Basel, Departamento de Oftalmologia foram aprovados pelo Comitê de Ética local Basel 1. Preparação dos Reagentes <ol><li> Prepare a solução pela adição de PBS (1 L de pacotes) e 990 ml de dH2O para a mídia fosfato salino tamponado de Dulbecco (PBS) (livre de Ca ++, Mg ++). Ajustar o pH para 7,4. Armazenar à temperatura ambiente. </li><li> Preparar solução de lise: Para preparar 1000 ml de adicionar 2,5 M de NaCl (146,1 g), EDTA 100 mM (37,2 g) e 10 mM de base de Trizma (1,2 g) em dH2O </li><li> Preparar tampão de electroforese (NaOH a 300 mM / EDTA 1 mM), adicionando 30 mL de NaOH 10 M e 7,5 ml de 0,2 M de EDTA, qs para 1500 ml de dH2O e misturar bem. O volume total depende da capacidade de caixa de gel. Antes da utilização, medir o pH do tampão para garantir um pH&gt; 13. </li><li> Preparar tampão de neutralização de Tris contendo 0,4 M (48,5 g adicionado a ~ 800 mL de dH2O, ajustar o pH a 7,5), concentrou-se (&amp; #62; 10 M HCl) em 1000 ml com dH 2 O. Guardar a solução à TA. </li><li> Prepare a solução de coloração. Para o brometo de etídio (EtBr; 10x da, 20 ug / ml) adicionam-se 10 mg de EtBr em 50 ml dH2O e armazenamento à temperatura ambiente. Para 1x Ações - misturar 1 ml com 9 ml dH 2 O. CAUTELOSOS! Lidar com EtBr com precaução adequada, pois é um conhecido agente cancerígeno. </li></ol> 2. Isolamento de Leucócitos <ol><li> Obtenção de amostras de sangue humano (20 ml) com anti-coagulante, tal como a heparina por punção venosa. </li><li> Separa-se os linfócitos utilizando um separador de células por gradiente de densidade, tais como Histopaque. <ol><li> Resumidamente, o sangue diluído em proporção 1: 1 com PBS ou meio RPMI (sem FBS) e camada de mais de 600 ul líquido separador de células. </li><li> Centrífuga 1800 xg durante 20 min a 4 ° C. Aspirar o revestimento &quot;buffy&quot; em 3-5 mL de PBS / RPMI e centrifugado a 300 xg durante 10 min para sedimentar os linfócitos. </li><li> Recuperar linfócitos de apenas acima fronteira entre PBS (RPMI) E líquido separador de células, usando uma pipeta. Retirar as bandas de leucócitos a partir da interface entre o plasma e os separadores de célula camadas líquidas de cada tubo e recolher em um tubo de 50 ml. </li></ol></li><li> Levar o volume total a 50 ml com Meio Eagle Modificado de Dulbecco frio (DMEM). Lava-se a suspensão de células três vezes com DMEM a 300 xg durante 10 min. </li><li> Contar o número total de células utilizando um hemocitómetro. Suspender as células em PBS e alíquota em tubos de microcentrífuga a 10 7 células / tubo. </li><li> Pipetar 0,4 ml de células em 5 ml de um tubo de plástico descartável. Adicionar 1,2 ml de 1% de agarose-gelificante de baixa temperatura a 40 ° C. Misture e rapidamente e pipetar 1,2 ml de suspensão de células sobre a superfície coberta de agarose de uma lâmina pré-revestidos. Evitar a produção de bolhas. </li><li> Permitir que o gel de agarose a durante cerca de 2 min. Seja consistente com o tempo e temperatura utilizadas para a gelificação, e garantir que agarose está totalmente definido antes de submergir em solução de lise. Depois de totalmente set, mergulhe em solução de lise em ~ 4 ºC. </li></ol> 3. A lise e electroforese NOTA: O procedimento descrito é para a electroforese em condições de pH&gt; 13 alcalino. <ol><li> Depois de pelo menos 2 horas a ~ 4 ° C, remover suavemente slides da Solução de Lise. Colocar as lâminas lado a lado na caixa de gel na horizontal perto de uma extremidade, deslizando-los tão próximos quanto possível. </li><li> Encha os reservatórios de buffer com pH&gt; 13 eletroforese recentemente feito até que o nível do líquido cobre completamente os slides (evitar bolhas sobre a agarose). </li><li> Deixe lâminas sentar-se no tampão alcalina durante 20 min para permitir o desenrolamento do DNA e a expressão dos danos alcalino-lábil. </li><li> Ligue a fonte de alimentação de 25 volts (~ 0,75 V / cm) e ajustar a corrente de 300 miliamperes, aumentando ou diminuindo o nível de buffer. Electroforese as lâminas durante 30 min. </li><li> Desligue a energia. Levante cuidadosamente os slides do buffer e prendas em uma bandeja de drenagem. Deixe cair casaco sábio as lâminas com neutralização Buffer. Permitir que os slides para descansar por pelo menos 5 min. Escorra lâminas e repetir mais duas vezes. </li><li> Manchar as lâminas com 80 ul 1x brometo de etídio (EtBr) e deixe por 5 minutos e em seguida, mergulhar em água destilada gelada para remover o excesso mancha. Em seguida, coloque uma lamela sobre a lâmina e armazená-los imediatamente. Loja desliza por um mês à temperatura ambiente em condições secas. NOTA: Outras manchas de ADN (por exemplo, SYBR verde) podem também ser utilizados. Cuidado! usar luvas de proteção como a maioria dos corantes são mutagênicos. </li></ol> 4. Quantificação de quebras de DNA <ol><li> Para visualizar o dano ao DNA, observar o slide DNA EtBr manchada sob um microscópio de fluorescência 40X objetiva. </li><li> Avaliar quantitativamente danos no ADN nas células, medindo o comprimento da migração de DNA e a percentagem de ADN migrou (Figura 1A). Quantificar o dano ao DNA (Figura 1B) pelo momento Cauda e Olive-moment. Definições de Cauda-Moment e Olive -Moment tenham sido previamente dada 8-10. NOTA: Em nossa experiência, é o suficiente para ficar por um dos parâmetros. As células são fotografados, definindo a ferramenta automatizada que varre sobre as células de slides e fotografias microscópio. Quantificação de quebras de ADN pode ser feito por pacotes de software de análise de imagem. Existem vários pacotes de software diferentes que são feitos para capturar a imagem das células e quantificação dos danos de ADN. Recomendamos usar o mesmo pacote de software durante todo o experimento. O técnico de laboratório identifica a célula ou cometa intacta para ser marcado no computador e clica com o mouse sobre ele. A célula cometa ou intacto é, então, marcou automaticamente. </li></ol>

<ol>
	<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromagnetic+fields+and+DNA+damage.">Electromagnetic fields and DNA damage.</a> Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).</li><li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay:+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models.">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).</li><li>Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-repair+genes+and+vitamin+E+in+the+prevention+of+N-nitrosodiethylamine+mutagenicity.">DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).</li><li>Bartsch, H., Nair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+genesis+and+perpetuation+of+cancer:+role+of+lipid+peroxidation,+DNA+damage,+and+repair.">Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair.</a> Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).</li><li>Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair:+relevance+to+mechanisms+of+neurodegeneration.">DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).</li><li>Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-mediated+DNA+strand+breaks+in+corneal+epithelial+cells+assessed+using+the+comet+assay+procedure.">UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure.</a> Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).</li><li>Mozaffarieh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay+analysis+of+single-stranded+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes+of+glaucoma+patients.">Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients.</a> Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).</li><li>Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+a+pack+of+cigarettes+a+day+more+than+doubles+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes.">Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes.</a> Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).</li><li>Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ranibizumab+versus+photodynamic+therapy+on+DNA+damage+in+patients+with+exudative+macular+degeneration.">The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration.</a> Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).</li><li>Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+Advanced+Glycation+End+Products+With+Cardiovascular+Disease+in+Menopausal+Women.">Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women.</a> Reprod Sci. , (2014).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells).">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells).</a> Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).</li><li>Gaiv&#227;o, I., Sierra, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+comet+assay:+insights,+uses,+and+future+perspectives.">Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives.</a> Front Genet. 5, 304 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+in+lens+epithelial+cells+and+peripheral+lymphocytes+from+age-related+cataract+patients.">DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients.</a> Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).</li><li>Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesn&#233;, C., Fessard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+comet+and+micronucleus+assays+in+metabolic+competent+HepaRG+cells+to+predict+in+vivo+genotoxicity.">Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity.</a> Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).</li><li>Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+comet-X+assay+as+a+pharmacodynamic+assay+for+measuring+DNA+cross-linking+produced+by+the+novel+anticancer+agent+RH1+during+a+phase+I+clinical+trial.">Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).</li><li>Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+and+reduction+of+comet+assay+variation+in+relation+to+DNA+damage:+studies+from+the+European+Comet+Assay+Validation+Group.">Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group.</a> Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).</li><li>Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+mitochondrial+DNA+damage+and+copy+number+in+circulating+blood:+a+sensitive+approach+to+systemic+oxidative+stress.">Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress.</a> BioMed Res Int. , 157-547 (2013).</li><li>Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+lipoproteins+as+biomarkers+of+cardiovascular+risk+in+diabetes+mellitus.">Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus.</a> Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).</li><li>Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station.">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li><li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes.">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li></ol>

Cientistas suecos Ostling e Johanson foram os primeiros em seu campo para usar ensaio cometa para quantificar o dano ao DNA em células de um. As condições neutras que os dois cientistas utilizado, no entanto, apenas foi possível a detecção de quebras de cadeia dupla de ADN. Singh et al., Depois adaptado o ensaio para o uso sob condições alcalinas, o que produziu uma versão sensível que poderia avaliar quebras duplas e ADN de cadeia simples e detectar sítios lábeis alcalino-12. Uma vez que o seu desenvolvimento inicial, o teste foi modificado em vários passos para torná-lo adequado para avaliar os tipos de danos no DNA em diferentes tipos de células 13-15. Tal como acontece com todas as técnicas, prestando atenção rigorosa aos detalhes técnicos é importante para obter resultados precisos 16. Com base em nossa experiência, os melhores resultados são obtidos se cada passo da preparação metodológica solução para cometa quantificação-é realizada por especialista tecnol laboratórioicians. O uso de fresco e preparado corretamente mídia, técnicas de pipetagem adequadas, tempo exato e (como mencionado anteriormente na seção de resultados) o uso de leucócitos preparados na hora são essenciais para que a lise e eletroforese em gel para obter resultados precisos 17. Todas as etapas individuais neste ensaio são igualmente importantes para a obtenção de resultados confiáveis. Em 16 melhores resultados gerais são obtidos se cada passo metodológico de preparação da solução até cometa quantificação é realizada por especialista technicians.Important laboratório parecem a utilização de meios frescos e preparados corretamente , técnicas de pipetagem adequadas, tempo exato e como já foi referido na seção de resultados do uso de leucócitos preparados na hora para lise e electroforese em gel para obter resultados adequados a partir do ensaio 17. Como fazer outras metodologias, a técnica de ensaio do cometa tem sua advantages e desvantagens. Sendo um método sensível, o ensaio é vulnerável a factores (por exemplo, luz UV), que poderia aumentar quebras de DNA e, assim, afetar os resultados. Qualquer fator que pode aumentar o estresse oxidativo, exceto o que está sendo pesquisado, deve ser evitado. Factores de stress pode aumentar o nível de estresse oxidativo, não só em leucócitos, mas também em todos os outros meios e linfócitos sanguíneos. Como mencionado anteriormente, existem muitas maneiras diferentes e mais diretos de medição de estresse oxidativo 18,19. O ensaio do cometa é um dos muitos métodos que tem certas vantagens. Estes incluem o seu custo relativamente baixo, o pequeno número de células necessárias (&lt;10.000 células) e, portanto, as pequenas amostras de sangue necessários por paciente, o período relativamente curto de tempo necessário para quantificar os danos no DNA em células (aproximadamente 3 dias), a sua sensibilidade e sua aplicabilidade generalizada a danos no DNA jumentos em diferentes tipos de células. No passado, nós escolhemos trabalhar com leucócitos desde que teve experiência com estedo tipo de célula e que era aplicável para o estudo particular planeada. Outra vantagem do ensaio de cometa é que ele pode ser utilizado para detectar diferentes tipos e níveis de danos no ADN e, portanto, pode ser aplicada em várias outras áreas para além dos estudos de stress oxidativo, tais como estudos de reparação de ADN, ensaios de complementação ou estudos de genotoxicidade. O stress oxidativo é agora reconhecido como desempenhando um papel crucial na patogénese de várias doenças. O método de ensaio de cometa, enquanto uma das muitas maneiras de medir o stress oxidativo 18,19, é relativamente simples, barata e versátil. Quando dominado, este método pode ser usado em todas as áreas da medicina, em que o stress oxidativo desempenha um papel 8-10,20,21.

Ensaio Cometa foi desenvolvido pela primeira vez por cientistas suecos Ostling e Johanson 1. O DNA é uma molécula carregada negativamente. Durante a eletroforese, fragmentos de DNA menores, danificadas viajar mais rápido em direção a um ânodo positivamente carregado 2. O menor dos fragmentos de ADN, mais rapidamente a sua migração para o ânodo, para formar um &quot;cometa&quot; típica com uma &quot;cabeça&quot; do composto intacto, o ADN intacto e uma &quot;cauda&quot; constituída por fragmentos de ADN danificadas 3. O DNA danificado pode ser reparado por diferentes mecanismos do corpo 4, que mantêm a geração de DNA breaks bastante equilibradas 5. Se, no entanto, o equilíbrio é a favor de quebras no ADN, as quebras podem acumular-se e, finalmente, contribuir para o desenvolvimento de uma doença. O nosso DNA sofre danos aproximadamente 0.000165% em um determinado momento 6. Quebras de ADN de cadeia simples referem-se a um defeito de um dos dois cordões da dupla hélice de ADNConsiderando quebras de cadeia dupla de ADN são causados ​​quando ambas as cadeias da dupla hélice de ADN são danificados. Existem vários factores que podem aumentar a quantidade de quebras no ADN em um determinado momento, tais como a idade da célula, o fumo do cigarro, várias drogas ou stress oxidativo 7-9. Se todos os fatores que levam a quebras de DNA aprimorados são mantidas constantes, em seguida, a quantificação de quebras de DNA por meio de teste do cometa é um bom parâmetro indireto do estresse oxidativo. O método de ensaio do cometa é usado cada vez mais hoje em medicina incluindo oftalmologia. Uma razão para isto é que o stress oxidativo é cada vez mais reconhecido como um mecanismo patogénico para várias doenças e 8-11 comet assay é um método com o qual o stress oxidativo pode ser quantificada indirectamente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>(CPW59)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM1370)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(E-8751)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(1077-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(TS1006)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Ranbaxy Rankem</td>
			<td>(S0160)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>BDH-Merck</td>
			<td>(89021)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM 845)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Spectrochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials required for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Melting Agarose (NMA)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM273)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point Agarose (LMPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(A9414)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol - Qualigens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>(500010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor and Tips</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress

Organismos eucarióticos superiores não podem viver sem oxigênio; No entanto, paradoxalmente, o oxigênio pode ser prejudicial para eles. A molécula de oxigênio é quimicamente inerte relativamente porque tem dois elétrons desemparelhados localizados em diferentes pi * anti-colagem orbitais. Estes dois elétrons têm spins paralelos, o que significa que gira na mesma direção sobre seus próprios eixos. É por isso que a molécula de oxigênio não é muito reativo. A activação de oxigénio pode ocorrer por dois mecanismos diferentes; ou através de redução por meio de um electrão de cada vez (monovalente redução), ou por meio da absorção de energia suficiente para inverter a rotação de um dos electrões desemparelhados. Isto resulta na produção de espécies oxidativas reactivas (ROS). Há um certo número de maneiras pelas quais o corpo humano elimina ROS no seu estado fisiológico. Se a produção de ROS excede a capacidade de reparação, os resultados de estresse oxidativo e danos moléculas diferentes. Existem muitos métodos diferentes pelos quais o estresse oxidativo pode estar measured. Este manuscrito incide sobre um dos chamados métodos de electroforese em gel de célula, também conhecido como &quot;comet assay&quot;, que permite a medição das quebras de ADN. Se todos os factores conhecidos por causarem danos no ADN, à excepção de stress oxidativo são mantidas constantes, a quantidade de danos no ADN medida pelo ensaio do cometa é um bom parâmetro de estresse oxidativo. O princípio é simples e baseia-se no facto de que as moléculas de DNA são carregadas negativamente. Uma molécula de DNA intacto tem um tamanho tão grande que não migrar durante a electroforese. Quebras de ADN, no entanto, se estiverem presentes resultado em fragmentos mais pequenos, que se movem no campo eléctrico em direcção ao ânodo. Fragmentos menores migram mais rapidamente. À medida que os fragmentos têm diferentes tamanhos do resultado final da electroforese não é uma linha distinta, mas sim um contínuo com a forma de um cometa. O sistema permite uma quantificação do &quot;cometa&quot; resultante e, portanto, das quebras de ADN na célula.

Embora o método de teste do cometa torna reprodutibilidade dos resultados, que podem ser influenciadas por uma série de factores. Um desses factores é se ou não os leucócitos são criopreservadas antes da lise e electroforese em gel ou se este passo for realizado em leucócitos recentemente preparadas. A Figura 2 mostra que, no Grupo 2, em que os leucócitos foram criopreservados antes de ADN de lise e electroforese em gel de SS- breaks foram significativamente maiores do que no Grupo 1, onde lise e gel -electrophoresis foi feito em células preparados na hora. O ensaio também pode ser utilizado para avaliar indirectamente estresse oxidativo sistémica. A Tabela 1 mostra a estatística descritiva para Cauda momento e momento de azeitona em fumantes e indivíduos saudáveis. Os dados revelam que fumar meio maço de cigarros por dia mais do que duplica breaks ssDNA nos leucócitos circulantes 9. <img alt="Figura 1A" src= &quot;/ Files / ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="A Figura 1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> Figura 1. (A) representa o microscópio utilizado durante a análise comet assay. (B) Δ descreve um &quot;cometa&quot; típico com uma cabeça e cauda (danificado fragmentos de DNA menores) brilhante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> Figura 2. quebras de ADNcs foram significativamente mais elevados quando os leucócitos foram criopreservados (Grupo 2) do que quando os leucócitos preparadas de fresco foram usadas antes da lise e electroforese em gel. <imgalt = &quot;Tabela 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; Tabela 1. Os fumantes tinham mais do dobro do número de ssDNA quebra em relação à idade e sexo correspondentes saudáveis ​​não-fumantes.

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Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Ensaio Cometa mede quebras de DNA induzidas por diferentes fatores. Se todos os fatores (exceto estresse oxidativo) que causam danos ao DNA são mantidas constantes, a quantidade de dano ao DNA é um bom parâmetro indireto do estresse oxidativo. O objetivo deste protocolo é usar o teste do cometa para a medição indireta do estresse oxidativo.

Ensaio Cometa como uma medida indireta do Systemic Estresse Oxidativo

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.2K visualizações.  University of Basel.  Ensaio Cometa mede quebras de DNA induzidas por diferentes fatores. Se todos os fatores (exceto estresse oxidativo) que causam danos ao DNA são mantidas constantes, a quantidade de dano ao DNA é um bom parâmetro indireto do estresse oxidativo. O objetivo deste protocolo é usar o teste do cometa para a medição indireta do estresse oxidativo. 

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A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Um Ensaio Comportamental para Medida de capacidade de resposta a alterações em Zebrafish intensidades de luz

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biologia

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of aerobic life. Molecular oxygen is essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many damaging reactions within living organisms. The combination of aerobic metabolism and iron, which is another vital compound for life, is enough to produce radicals through Fenton chemistry and degrade cellular components. DNA degradation is arguably the most damaging process involving intracellular radicals, as DNA repair is far from trivial. The assay presented in this article offers a quantitative technique to measure and visualize the effect of molecules and enzymes on radical-mediated DNA damage.
The DNA protection assay is a simple, quick, and robust tool for the in vitro characterization of the protective properties of proteins or chemicals. It involves exposing DNA to a damaging oxidative reaction and adding varying concentrations of the compound of interest. The reduction or increase of DNA damage as a function of compound concentration is then visualized using gel electrophoresis. In this article we demonstrate the technique of the DNA protection assay by measuring the protective properties of the DNA-binding protein from starved cells (Dps). Dps is a mini-ferritin that is utilized by more than 300 bacterial species to powerfully combat environmental stressors. Here we present the Dps purification protocol and the optimized assay conditions for evaluating DNA protection by Dps.

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

The DNA-binding protein from starved cells (Dps) plays a crucial role in combating bacterial stress. This article discusses the purification of E. coli Dps and the protocol for an in vitro assay demonstrating Dps-mediated protection of DNA from degradation by reactive oxygen species.

A aplicação de um<em&gt; In vitro</em&gt; DNA Assay Proteção ao Visualize Propriedades Mediação stress do Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Quantitative Reação de Imunofluorescência Indireta para medir a variação nos níveis de proteína no centrossomas

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Método de Avaliação de efeitos de uma gama de comprimentos de onda e intensidades de Terapia da Luz Vermelha / near-infrared sobre o estresse oxidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Medição de resistência de Estresse Oxidativo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Em placas de 96 poços de microtitulação

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Ensaio in vitro para medir Fosfatidiletanolamina Metiltransferase Atividade

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In Vivo Alkaline Ensaio Cometa e Enzyme-modificado Alkaline Comet Ensaio para medição Breaks DNA Strand e dano oxidativo ao DNA em Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to stress conditions, are implicated in various aspects of cell metabolism and survival. SGs modulate cellular signaling pathways, post-transcriptional gene expression, and stress response programs. The formation of these mRNA-containing granules is directly connected to cellular translation. SG assembly is triggered by inhibited translation initiation, and SG disassembly is promoted by translation activation or by inhibited translation elongation. This relationship is further highlighted by SG composition. Core SG components are stalled translation pre-initiation complexes, mRNA, and selected RNA-binding Proteins (RBPs). The purpose of SG assembly is to conserve cellular energy by sequestering translationally stalled housekeeping mRNAs, allowing for the enhanced translation of stress-responsive proteins. In addition to the core constituents, such as stalled translation preinitiation complexes, SGs contain a plethora of other proteins and signaling molecules. Defects in SG formation can impair cellular adaptation to stress and can thus promote cell death. SGs and similar RNA-containing granules have been linked to a number of human diseases, including neurodegenerative disorders and cancer, leading to the recent interest in classifying and defining RNA granule subtypes. This protocol describes assays to characterize and quantify mammalian SGs.

Stress Granules (SGs) are nonmembranous cytoplasmic structures that form in cells exposed to a variety of stresses. SGs contain mRNAs, RNA-binding proteins, small ribosomal subunits, translation-related factors, and various cell signaling proteins. This protocol describes a workflow that uses several experimental approaches to detect, characterize, and quantify bona fide SGs.

Métodos para classificar os focos citoplasmáticos como grânulos de estresse de mamíferos

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

Crescimento glomerular como um ensaio ex vivo para analisar caminhos envolvidos na ativação de células epiteliais parietal

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...