Name: comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress
Uploaded: 2015-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a LHW Stiftung, em Triesen, Liechtenstein, pelo apoio financeiro a nossa pesquisa sobre o estresse oxidativo.

Estudos sobre ensaio do cometa realizadas na Universidade de Basel, Departamento de Oftalmologia foram aprovados pelo Comitê de Ética local Basel 1. Preparação dos Reagentes <ol><li> Prepare a solução pela adição de PBS (1 L de pacotes) e 990 ml de dH2O para a mídia fosfato salino tamponado de Dulbecco (PBS) (livre de Ca ++, Mg ++). Ajustar o pH para 7,4. Armazenar à temperatura ambiente. </li><li> Preparar solução de lise: Para preparar 1000 ml de adicionar 2,5 M de NaCl (146,1 g), EDTA 100 mM (37,2 g) e 10 mM de base de Trizma (1,2 g) em dH2O </li><li> Preparar tampão de electroforese (NaOH a 300 mM / EDTA 1 mM), adicionando 30 mL de NaOH 10 M e 7,5 ml de 0,2 M de EDTA, qs para 1500 ml de dH2O e misturar bem. O volume total depende da capacidade de caixa de gel. Antes da utilização, medir o pH do tampão para garantir um pH&gt; 13. </li><li> Preparar tampão de neutralização de Tris contendo 0,4 M (48,5 g adicionado a ~ 800 mL de dH2O, ajustar o pH a 7,5), concentrou-se (&amp; #62; 10 M HCl) em 1000 ml com dH 2 O. Guardar a solução à TA. </li><li> Prepare a solução de coloração. Para o brometo de etídio (EtBr; 10x da, 20 ug / ml) adicionam-se 10 mg de EtBr em 50 ml dH2O e armazenamento à temperatura ambiente. Para 1x Ações - misturar 1 ml com 9 ml dH 2 O. CAUTELOSOS! Lidar com EtBr com precaução adequada, pois é um conhecido agente cancerígeno. </li></ol> 2. Isolamento de Leucócitos <ol><li> Obtenção de amostras de sangue humano (20 ml) com anti-coagulante, tal como a heparina por punção venosa. </li><li> Separa-se os linfócitos utilizando um separador de células por gradiente de densidade, tais como Histopaque. <ol><li> Resumidamente, o sangue diluído em proporção 1: 1 com PBS ou meio RPMI (sem FBS) e camada de mais de 600 ul líquido separador de células. </li><li> Centrífuga 1800 xg durante 20 min a 4 ° C. Aspirar o revestimento &quot;buffy&quot; em 3-5 mL de PBS / RPMI e centrifugado a 300 xg durante 10 min para sedimentar os linfócitos. </li><li> Recuperar linfócitos de apenas acima fronteira entre PBS (RPMI) E líquido separador de células, usando uma pipeta. Retirar as bandas de leucócitos a partir da interface entre o plasma e os separadores de célula camadas líquidas de cada tubo e recolher em um tubo de 50 ml. </li></ol></li><li> Levar o volume total a 50 ml com Meio Eagle Modificado de Dulbecco frio (DMEM). Lava-se a suspensão de células três vezes com DMEM a 300 xg durante 10 min. </li><li> Contar o número total de células utilizando um hemocitómetro. Suspender as células em PBS e alíquota em tubos de microcentrífuga a 10 7 células / tubo. </li><li> Pipetar 0,4 ml de células em 5 ml de um tubo de plástico descartável. Adicionar 1,2 ml de 1% de agarose-gelificante de baixa temperatura a 40 ° C. Misture e rapidamente e pipetar 1,2 ml de suspensão de células sobre a superfície coberta de agarose de uma lâmina pré-revestidos. Evitar a produção de bolhas. </li><li> Permitir que o gel de agarose a durante cerca de 2 min. Seja consistente com o tempo e temperatura utilizadas para a gelificação, e garantir que agarose está totalmente definido antes de submergir em solução de lise. Depois de totalmente set, mergulhe em solução de lise em ~ 4 ºC. </li></ol> 3. A lise e electroforese NOTA: O procedimento descrito é para a electroforese em condições de pH&gt; 13 alcalino. <ol><li> Depois de pelo menos 2 horas a ~ 4 ° C, remover suavemente slides da Solução de Lise. Colocar as lâminas lado a lado na caixa de gel na horizontal perto de uma extremidade, deslizando-los tão próximos quanto possível. </li><li> Encha os reservatórios de buffer com pH&gt; 13 eletroforese recentemente feito até que o nível do líquido cobre completamente os slides (evitar bolhas sobre a agarose). </li><li> Deixe lâminas sentar-se no tampão alcalina durante 20 min para permitir o desenrolamento do DNA e a expressão dos danos alcalino-lábil. </li><li> Ligue a fonte de alimentação de 25 volts (~ 0,75 V / cm) e ajustar a corrente de 300 miliamperes, aumentando ou diminuindo o nível de buffer. Electroforese as lâminas durante 30 min. </li><li> Desligue a energia. Levante cuidadosamente os slides do buffer e prendas em uma bandeja de drenagem. Deixe cair casaco sábio as lâminas com neutralização Buffer. Permitir que os slides para descansar por pelo menos 5 min. Escorra lâminas e repetir mais duas vezes. </li><li> Manchar as lâminas com 80 ul 1x brometo de etídio (EtBr) e deixe por 5 minutos e em seguida, mergulhar em água destilada gelada para remover o excesso mancha. Em seguida, coloque uma lamela sobre a lâmina e armazená-los imediatamente. Loja desliza por um mês à temperatura ambiente em condições secas. NOTA: Outras manchas de ADN (por exemplo, SYBR verde) podem também ser utilizados. Cuidado! usar luvas de proteção como a maioria dos corantes são mutagênicos. </li></ol> 4. Quantificação de quebras de DNA <ol><li> Para visualizar o dano ao DNA, observar o slide DNA EtBr manchada sob um microscópio de fluorescência 40X objetiva. </li><li> Avaliar quantitativamente danos no ADN nas células, medindo o comprimento da migração de DNA e a percentagem de ADN migrou (Figura 1A). Quantificar o dano ao DNA (Figura 1B) pelo momento Cauda e Olive-moment. Definições de Cauda-Moment e Olive -Moment tenham sido previamente dada 8-10. NOTA: Em nossa experiência, é o suficiente para ficar por um dos parâmetros. As células são fotografados, definindo a ferramenta automatizada que varre sobre as células de slides e fotografias microscópio. Quantificação de quebras de ADN pode ser feito por pacotes de software de análise de imagem. Existem vários pacotes de software diferentes que são feitos para capturar a imagem das células e quantificação dos danos de ADN. Recomendamos usar o mesmo pacote de software durante todo o experimento. O técnico de laboratório identifica a célula ou cometa intacta para ser marcado no computador e clica com o mouse sobre ele. A célula cometa ou intacto é, então, marcou automaticamente. </li></ol>

<ol>
	<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromagnetic+fields+and+DNA+damage.">Electromagnetic fields and DNA damage.</a> Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).</li><li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay:+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models.">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).</li><li>Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-repair+genes+and+vitamin+E+in+the+prevention+of+N-nitrosodiethylamine+mutagenicity.">DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).</li><li>Bartsch, H., Nair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+genesis+and+perpetuation+of+cancer:+role+of+lipid+peroxidation,+DNA+damage,+and+repair.">Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair.</a> Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).</li><li>Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair:+relevance+to+mechanisms+of+neurodegeneration.">DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).</li><li>Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-mediated+DNA+strand+breaks+in+corneal+epithelial+cells+assessed+using+the+comet+assay+procedure.">UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure.</a> Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).</li><li>Mozaffarieh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay+analysis+of+single-stranded+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes+of+glaucoma+patients.">Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients.</a> Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).</li><li>Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+a+pack+of+cigarettes+a+day+more+than+doubles+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes.">Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes.</a> Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).</li><li>Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ranibizumab+versus+photodynamic+therapy+on+DNA+damage+in+patients+with+exudative+macular+degeneration.">The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration.</a> Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).</li><li>Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+Advanced+Glycation+End+Products+With+Cardiovascular+Disease+in+Menopausal+Women.">Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women.</a> Reprod Sci. , (2014).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells).">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells).</a> Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).</li><li>Gaiv&#227;o, I., Sierra, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+comet+assay:+insights,+uses,+and+future+perspectives.">Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives.</a> Front Genet. 5, 304 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+in+lens+epithelial+cells+and+peripheral+lymphocytes+from+age-related+cataract+patients.">DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients.</a> Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).</li><li>Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesn&#233;, C., Fessard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+comet+and+micronucleus+assays+in+metabolic+competent+HepaRG+cells+to+predict+in+vivo+genotoxicity.">Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity.</a> Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).</li><li>Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+comet-X+assay+as+a+pharmacodynamic+assay+for+measuring+DNA+cross-linking+produced+by+the+novel+anticancer+agent+RH1+during+a+phase+I+clinical+trial.">Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).</li><li>Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+and+reduction+of+comet+assay+variation+in+relation+to+DNA+damage:+studies+from+the+European+Comet+Assay+Validation+Group.">Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group.</a> Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).</li><li>Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+mitochondrial+DNA+damage+and+copy+number+in+circulating+blood:+a+sensitive+approach+to+systemic+oxidative+stress.">Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress.</a> BioMed Res Int. , 157-547 (2013).</li><li>Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+lipoproteins+as+biomarkers+of+cardiovascular+risk+in+diabetes+mellitus.">Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus.</a> Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).</li><li>Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station.">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li><li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes.">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li></ol>

Cientistas suecos Ostling e Johanson foram os primeiros em seu campo para usar ensaio cometa para quantificar o dano ao DNA em células de um. As condições neutras que os dois cientistas utilizado, no entanto, apenas foi possível a detecção de quebras de cadeia dupla de ADN. Singh et al., Depois adaptado o ensaio para o uso sob condições alcalinas, o que produziu uma versão sensível que poderia avaliar quebras duplas e ADN de cadeia simples e detectar sítios lábeis alcalino-12. Uma vez que o seu desenvolvimento inicial, o teste foi modificado em vários passos para torná-lo adequado para avaliar os tipos de danos no DNA em diferentes tipos de células 13-15. Tal como acontece com todas as técnicas, prestando atenção rigorosa aos detalhes técnicos é importante para obter resultados precisos 16. Com base em nossa experiência, os melhores resultados são obtidos se cada passo da preparação metodológica solução para cometa quantificação-é realizada por especialista tecnol laboratórioicians. O uso de fresco e preparado corretamente mídia, técnicas de pipetagem adequadas, tempo exato e (como mencionado anteriormente na seção de resultados) o uso de leucócitos preparados na hora são essenciais para que a lise e eletroforese em gel para obter resultados precisos 17. Todas as etapas individuais neste ensaio são igualmente importantes para a obtenção de resultados confiáveis. Em 16 melhores resultados gerais são obtidos se cada passo metodológico de preparação da solução até cometa quantificação é realizada por especialista technicians.Important laboratório parecem a utilização de meios frescos e preparados corretamente , técnicas de pipetagem adequadas, tempo exato e como já foi referido na seção de resultados do uso de leucócitos preparados na hora para lise e electroforese em gel para obter resultados adequados a partir do ensaio 17. Como fazer outras metodologias, a técnica de ensaio do cometa tem sua advantages e desvantagens. Sendo um método sensível, o ensaio é vulnerável a factores (por exemplo, luz UV), que poderia aumentar quebras de DNA e, assim, afetar os resultados. Qualquer fator que pode aumentar o estresse oxidativo, exceto o que está sendo pesquisado, deve ser evitado. Factores de stress pode aumentar o nível de estresse oxidativo, não só em leucócitos, mas também em todos os outros meios e linfócitos sanguíneos. Como mencionado anteriormente, existem muitas maneiras diferentes e mais diretos de medição de estresse oxidativo 18,19. O ensaio do cometa é um dos muitos métodos que tem certas vantagens. Estes incluem o seu custo relativamente baixo, o pequeno número de células necessárias (&lt;10.000 células) e, portanto, as pequenas amostras de sangue necessários por paciente, o período relativamente curto de tempo necessário para quantificar os danos no DNA em células (aproximadamente 3 dias), a sua sensibilidade e sua aplicabilidade generalizada a danos no DNA jumentos em diferentes tipos de células. No passado, nós escolhemos trabalhar com leucócitos desde que teve experiência com estedo tipo de célula e que era aplicável para o estudo particular planeada. Outra vantagem do ensaio de cometa é que ele pode ser utilizado para detectar diferentes tipos e níveis de danos no ADN e, portanto, pode ser aplicada em várias outras áreas para além dos estudos de stress oxidativo, tais como estudos de reparação de ADN, ensaios de complementação ou estudos de genotoxicidade. O stress oxidativo é agora reconhecido como desempenhando um papel crucial na patogénese de várias doenças. O método de ensaio de cometa, enquanto uma das muitas maneiras de medir o stress oxidativo 18,19, é relativamente simples, barata e versátil. Quando dominado, este método pode ser usado em todas as áreas da medicina, em que o stress oxidativo desempenha um papel 8-10,20,21.

Ensaio Cometa foi desenvolvido pela primeira vez por cientistas suecos Ostling e Johanson 1. O DNA é uma molécula carregada negativamente. Durante a eletroforese, fragmentos de DNA menores, danificadas viajar mais rápido em direção a um ânodo positivamente carregado 2. O menor dos fragmentos de ADN, mais rapidamente a sua migração para o ânodo, para formar um &quot;cometa&quot; típica com uma &quot;cabeça&quot; do composto intacto, o ADN intacto e uma &quot;cauda&quot; constituída por fragmentos de ADN danificadas 3. O DNA danificado pode ser reparado por diferentes mecanismos do corpo 4, que mantêm a geração de DNA breaks bastante equilibradas 5. Se, no entanto, o equilíbrio é a favor de quebras no ADN, as quebras podem acumular-se e, finalmente, contribuir para o desenvolvimento de uma doença. O nosso DNA sofre danos aproximadamente 0.000165% em um determinado momento 6. Quebras de ADN de cadeia simples referem-se a um defeito de um dos dois cordões da dupla hélice de ADNConsiderando quebras de cadeia dupla de ADN são causados ​​quando ambas as cadeias da dupla hélice de ADN são danificados. Existem vários factores que podem aumentar a quantidade de quebras no ADN em um determinado momento, tais como a idade da célula, o fumo do cigarro, várias drogas ou stress oxidativo 7-9. Se todos os fatores que levam a quebras de DNA aprimorados são mantidas constantes, em seguida, a quantificação de quebras de DNA por meio de teste do cometa é um bom parâmetro indireto do estresse oxidativo. O método de ensaio do cometa é usado cada vez mais hoje em medicina incluindo oftalmologia. Uma razão para isto é que o stress oxidativo é cada vez mais reconhecido como um mecanismo patogénico para várias doenças e 8-11 comet assay é um método com o qual o stress oxidativo pode ser quantificada indirectamente.

<table><tbody><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Qualigens</td><td>(CPW59)</td><td></td></tr><tr><td>Disodium EDTA</td><td>HiMedia</td><td>(RM1370)</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma</td><td>(E-8751)</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>(1077-1)</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free)</td><td>HiMedia</td><td>(TS1006)</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Ranbaxy Rankem</td><td>(S0160)</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>BDH-Merck</td><td>(89021)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>(RM 845)</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Spectrochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materials required for gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Normal Melting Agarose (NMA)</td><td>HiMedia</td><td>(RM273)</td><td></td></tr><tr><td>Low Melting Point Agarose (LMPA)</td><td>Sigma</td><td>(A9414)</td><td></td></tr><tr><td>Methanol - Qualigens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm)</td><td>Blue Star</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes</td><td>Tarsons</td><td>(500010)</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor and Tips</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress

Organismos eucarióticos superiores não podem viver sem oxigênio; No entanto, paradoxalmente, o oxigênio pode ser prejudicial para eles. A molécula de oxigênio é quimicamente inerte relativamente porque tem dois elétrons desemparelhados localizados em diferentes pi * anti-colagem orbitais. Estes dois elétrons têm spins paralelos, o que significa que gira na mesma direção sobre seus próprios eixos. É por isso que a molécula de oxigênio não é muito reativo. A activação de oxigénio pode ocorrer por dois mecanismos diferentes; ou através de redução por meio de um electrão de cada vez (monovalente redução), ou por meio da absorção de energia suficiente para inverter a rotação de um dos electrões desemparelhados. Isto resulta na produção de espécies oxidativas reactivas (ROS). Há um certo número de maneiras pelas quais o corpo humano elimina ROS no seu estado fisiológico. Se a produção de ROS excede a capacidade de reparação, os resultados de estresse oxidativo e danos moléculas diferentes. Existem muitos métodos diferentes pelos quais o estresse oxidativo pode estar measured. Este manuscrito incide sobre um dos chamados métodos de electroforese em gel de célula, também conhecido como &quot;comet assay&quot;, que permite a medição das quebras de ADN. Se todos os factores conhecidos por causarem danos no ADN, à excepção de stress oxidativo são mantidas constantes, a quantidade de danos no ADN medida pelo ensaio do cometa é um bom parâmetro de estresse oxidativo. O princípio é simples e baseia-se no facto de que as moléculas de DNA são carregadas negativamente. Uma molécula de DNA intacto tem um tamanho tão grande que não migrar durante a electroforese. Quebras de ADN, no entanto, se estiverem presentes resultado em fragmentos mais pequenos, que se movem no campo eléctrico em direcção ao ânodo. Fragmentos menores migram mais rapidamente. À medida que os fragmentos têm diferentes tamanhos do resultado final da electroforese não é uma linha distinta, mas sim um contínuo com a forma de um cometa. O sistema permite uma quantificação do &quot;cometa&quot; resultante e, portanto, das quebras de ADN na célula.

Embora o método de teste do cometa torna reprodutibilidade dos resultados, que podem ser influenciadas por uma série de factores. Um desses factores é se ou não os leucócitos são criopreservadas antes da lise e electroforese em gel ou se este passo for realizado em leucócitos recentemente preparadas. A Figura 2 mostra que, no Grupo 2, em que os leucócitos foram criopreservados antes de ADN de lise e electroforese em gel de SS- breaks foram significativamente maiores do que no Grupo 1, onde lise e gel -electrophoresis foi feito em células preparados na hora. O ensaio também pode ser utilizado para avaliar indirectamente estresse oxidativo sistémica. A Tabela 1 mostra a estatística descritiva para Cauda momento e momento de azeitona em fumantes e indivíduos saudáveis. Os dados revelam que fumar meio maço de cigarros por dia mais do que duplica breaks ssDNA nos leucócitos circulantes 9. <img alt="Figura 1A" src= &quot;/ Files / ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="A Figura 1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> Figura 1. (A) representa o microscópio utilizado durante a análise comet assay. (B) Δ descreve um &quot;cometa&quot; típico com uma cabeça e cauda (danificado fragmentos de DNA menores) brilhante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> Figura 2. quebras de ADNcs foram significativamente mais elevados quando os leucócitos foram criopreservados (Grupo 2) do que quando os leucócitos preparadas de fresco foram usadas antes da lise e electroforese em gel. <imgalt = &quot;Tabela 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; Tabela 1. Os fumantes tinham mais do dobro do número de ssDNA quebra em relação à idade e sexo correspondentes saudáveis ​​não-fumantes.

Watch this Scientific Journal Video about Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress at JoVE.com

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Ensaio Cometa mede quebras de DNA induzidas por diferentes fatores. Se todos os fatores (exceto estresse oxidativo) que causam danos ao DNA são mantidas constantes, a quantidade de dano ao DNA é um bom parâmetro indireto do estresse oxidativo. O objetivo deste protocolo é usar o teste do cometa para a medição indireta do estresse oxidativo.

Ensaio Cometa como uma medida indireta do Systemic Estresse Oxidativo

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

comet-assay-as-an-indirect-measure-of-systemic-oxidative-stress

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

29.3K visualizações.  University of Basel.  Ensaio Cometa mede quebras de DNA induzidas por diferentes fatores. Se todos os fatores (exceto estresse oxidativo) que causam danos ao DNA são mantidas constantes, a quantidade de dano ao DNA é um bom parâmetro indireto do estresse oxidativo. O objetivo deste protocolo é usar o teste do cometa para a medição indireta do estresse oxidativo. 

Vídeo: Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer therapies, such as radio- and chemotherapy, introduce enormous amount of additional DNA damage, leading to cell cycle arrest and apoptosis to limit cancer progression. Quantitative assessment of DNA damage during experimental cancer therapy is a key step to justify the effectiveness of a genotoxic agent. In this study, we focus on a single cell electrophoresis assay, also known as the comet assay, which can quantify single and double-strand DNA breaks in vitro. The comet assay is a DNA damage quantification method that is efficient and easy to perform, and has low time/budget demands and high reproducibility. Here, we highlight the utility of the comet assay for a preclinical study by evaluating the genotoxic effect of olaparib/temozolomide combination therapy to U251 glioma cells.

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

The comet assay is an efficient method to detect DNA damage including single and double-stranded DNA breaks. We describe alkaline and neutral comet assays to measure DNA damage in cancer cells to evaluate the therapeutic effect of chemotherapy.

Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Pesquisa do câncer

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

Abordagens para avaliação de estresse oxidativo toxicológico usando sensores Fluorogenic geneticamente codificado de imagem

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados ​​no DNA em células Microarrayed Humanos

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Bioengenharia

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Um Ensaio Comportamental para Medida de capacidade de resposta a alterações em Zebrafish intensidades de luz

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biologia

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other environmental stressors. Use of the comet assay in regulatory testing for genotoxic potential in rodents has been driven by adoption of an Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline in 2014. Comet assay slides are typically prepared from fresh tissue at the time of necropsy; however, freezing tissue samples can avoid logistical challenges associated with simultaneous preparation of slides from multiple organs per animal and from many animals per study. Freezing also enables shipping samples from the exposure facility to a different laboratory for analysis, and storage of frozen tissue facilitates deferring a decision to generate DNA damage data for a given organ. The alkaline comet assay is useful for detecting exposure-related DNA double- and single-strand breaks, alkali-labile lesions, and strand breaks associated with incomplete DNA excision repair. However, DNA damage can also result from mechanical shearing or improper sample processing procedures, confounding the results of the assay. Reproducibility in collection and processing of tissue samples during necropsies may be difficult to control due to fluctuating laboratory personnel with varying levels of experience in harvesting tissues for the comet assay. Enhancing consistency through refresher training or deployment of mobile units staffed with experienced laboratory personnel is costly and may not always be feasible. To optimize consistent generation of high quality samples for comet assay analysis, a method for homogenizing flash frozen cubes of tissue using a customized tissue mincing device was evaluated. Samples prepared for the comet assay by this method compared favorably in quality to fresh and frozen tissue samples prepared by mincing during necropsy. Moreover, low baseline DNA damage was measured in cells from frozen cubes of tissue following prolonged storage.

This protocol describes several procedures for preparing high quality frozen tissue samples at the time of necropsy for use in the comet assay to assess DNA damage: 1) minced tissue, 2) scraped epithelial cells from the gastrointestinal tract, and 3) cubed tissue samples, requiring homogenization using a tissue mincing device.

Uso de tecido congelado no ensaio do cometa para avaliação de danos no DNA

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...

Genética

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Ensaio danos no DNA em neurônios do hipocampo Usando o Ensaio Cometa

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Neurociência

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In Vivo Alkaline Ensaio Cometa e Enzyme-modificado Alkaline Comet Ensaio para medição Breaks DNA Strand e dano oxidativo ao DNA em Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell function, and therefore DNA damage may play a critical role in the development of, conceivably, all major human diseases, e.g., cancer, neurodegenerative and cardiovascular disease, and aging. Single-cell gel electrophoresis (i.e., the comet assay) is one of the most common and sensitive methods to study the formation and repair of a wide range of types of DNA damage (e.g., single- and double-strand breaks, alkali-labile sites, DNA-DNA crosslinks, and, in combination with certain repair enzymes, oxidized purines, and pyrimidines), in both in vitro and in vivo systems. However, the low sample throughput of the conventional assay and laborious sample workup are limiting factors to its widest possible application. With the "scoring" of comets increasingly automated, the limitation is now the ability to process significant numbers of comet slides. Here, a high-throughput (HTP) variant of the comet assay (HTP comet assay) has been developed, which significantly increases the number of samples analyzed, decreases assay run time, the number of individual slide manipulations, reagent requirements, and risk of physical damage to the gels. Furthermore, the footprint of the electrophoresis tank is significantly decreased due to the vertical orientation of the slides and integral cooling. Also reported here is a novel approach to chilling comet assay slides, which conveniently and efficiently facilitates the solidification of the comet gels. Here, the application of these devices to representative comet assay methods has been described. These simple innovations greatly support the use of the comet assay and its application to areas of study such as exposure biology, ecotoxicology, biomonitoring, toxicity screening/testing, together with understanding pathogenesis.

The comet assay is a popular means of detecting DNA damage. This study describes an approach to running slides in representative variants of the comet assay. This approach significantly increased the number of samples while decreasing assay run-time, the number of slide manipulations, and the risk of damage to gels.

Uma abordagem de ensaio de cometa de alto rendimento para avaliar danos ao DNA celular

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell ...

Thiobarbituric Acid-Reactive Substances Assay to Assess Oxidative Stress in Human Serum

Label the glass tubes for the samples to be analyzed, then, add 100 microliters of the prepared sample to each tube. Add 200 microliters of 8.1% SDS to each sample, and gently swirl the glass tube in a circular motion to mix.
Add 1.5 milliliters of 3.5 molar sodium acetate buffer to each sample. Then, add 1.5 milliliters of aqueous 0.8% thiobarbituric acid solution. Bring the final volume in each tube to 4 milliliters by adding 700 microliters of deionized water. Tightly cap the glass tubes, and incubate them in a heating block set to 95 degrees Celsius for 1 hour. Cover the tubes with aluminum foil to prevent condensation. Then, remove the tubes from the block and incubate them on ice for 30 minutes.
After the incubation, centrifuge the samples and standards at 1,500 x g for 10 minutes at 4 degrees Celsius. Transfer 150 microliters of supernatant from each tube to a well in a 96-well plate, removing any air bubbles with a pipette tip.
Measure the absorbance of the samples at 532 nanometers. Then, subtract the average absorbance reading of the blank samples from all other absorbance readings.
Create a standard curve and use it to calculate unknown sample concentrations.

Ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico para avaliar o estresse oxidativo no soro humano

JoVE Encyclopedia of Experiments

Técnicas Biológicas

Técnicas de Ensaio

Ensaios bioquímicos

EoE Sub Articles

Comet Assay for DNA Damage Detection in Cells

To begin, prepare 0.6% low melting point agarose in PBS, and place it in a water bath at 37 degrees Celsius. Labeled the frosted end of the pre-coated slides with name, date, and treatment information using a permanent marker or pencil.
Place a chilling plate on a flat bench, and insert two frozen cooling packs into the sliding drawer below the metal surface. Then, place the slides on the chilling plate to pre-chill for 1 to 2 minutes. Centrifuge and remove the supernatant from the sample tubes, and place them immediately back on ice. Resuspend the cell pellet with 200 microliters of 0.6% low melting point agarose, and mix by pipetting.
Next, add 80 microliters of agarose-containing cells onto a chilled slide, and quickly place a coverslip on the gel. Allow the gel to set on the chilling plate for 1 to 2 minutes. In the meantime, prepare 500 milliliters of working solution of lysis buffer, and pour it into the lysis dish.
After the gels have set, remove the coverslips quickly by gently holding the slide between thumb and forefinger, and sliding the coverslip off the gel. Then, place the slides inside a slide carrier, with all the black dot marks on the slides facing in the same direction. Place the slide carrier inside the lysis dish. Close the lid of the lysis dish, and put it for incubation.
Carefully remove the slide carrier from the lysis dish without disturbing the gels. Gently, place the slide carrier in a washing dish pre-loaded with ice-cold double-distilled water. Ensure that the slides are completely submerged, and leave the setup for 30 minutes.
Place a frozen cooling pack under the electrophoresis tank to maintain optimal buffer temperature. Then, add ice-cold electrophoresis working solution to the tank, and transfer the slide carrier into it. Orient the slides, such that the cell containing gels point toward the cathode.
Incubate the slides in the electrophoresis tank for 20 minutes, to allow the DNA to unwind. Then, turn on the power supply to perform electrophoresis for 20 minutes at 1.19 volts per centimeter. After the electrophoresis is complete, turn off the power supply, and remove the slide carrier from the electrophoresis tank. Allow the slide carrier to drain on tissue paper for 30 seconds.
Next, place the slide carrier into a dish containing neutralization buffer, and leave it for 20 minutes. Following this, place it in a washing dish containing ice-cold double-distilled water, and leave it for 20 minutes. After washing, remove the slide carrier from the water, and allow the slides to dry in an incubator at 37 degrees Celsius for 1 hour.
To rehydrate the slides, transfer the slide carrier to a washing dish containing ice-cold double-distilled water and leave it for 30 minutes. Then, place the slide carrier into a staining dish containing 2.5 micrograms per milliliter propidium iodide solution.
Close the lid of the staining dish, and incubate it for 20 minutes in the dark at room temperature. After incubation, transfer the slide carrier to a separate dish, and wash it with ice-cold double-distilled water for 20 minutes.
Remove the slide carrier from the dish, and dry it completely in the dark, either in a 37 degrees Celsius incubator or at room temperature. After the slides dry completely, store them in a slide box in the dark until ready for image analysis.

Ensaio Cometa como uma medida indireta do Systemic Estresse Oxidativo

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

Abordagens para avaliação de estresse oxidativo toxicológico usando sensores Fluorogenic geneticamente codificado de imagem

CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados no DNA em células Microarrayed Humanos

Um Ensaio Comportamental para Medida de capacidade de resposta a alterações em Zebrafish intensidades de luz

Uso de tecido congelado no ensaio do cometa para avaliação de danos no DNA

Ensaio danos no DNA em neurônios do hipocampo Usando o Ensaio Cometa

In Vivo Alkaline Ensaio Cometa e Enzyme-modificado Alkaline Comet Ensaio para medição Breaks DNA Strand e dano oxidativo ao DNA em Rat Liver

Uma abordagem de ensaio de cometa de alto rendimento para avaliar danos ao DNA celular

Ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico para avaliar o estresse oxidativo no soro humano

Ensaio cometa para detecção de danos ao DNA em células

Ensaio Cometa como uma medida indireta do Systemic Estresse Oxidativo

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

Abordagens para avaliação de estresse oxidativo toxicológico usando sensores Fluorogenic geneticamente codificado de imagem

CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados ​​no DNA em células Microarrayed Humanos

Um Ensaio Comportamental para Medida de capacidade de resposta a alterações em Zebrafish intensidades de luz

Uso de tecido congelado no ensaio do cometa para avaliação de danos no DNA

Ensaio danos no DNA em neurônios do hipocampo Usando o Ensaio Cometa

In Vivo Alkaline Ensaio Cometa e Enzyme-modificado Alkaline Comet Ensaio para medição Breaks DNA Strand e dano oxidativo ao DNA em Rat Liver

Uma abordagem de ensaio de cometa de alto rendimento para avaliar danos ao DNA celular

Ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico para avaliar o estresse oxidativo no soro humano

Ensaio cometa para detecção de danos ao DNA em células

CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados no DNA em células Microarrayed Humanos