Name: perfusable vascular network with a tissue model in a microfluidic device
Uploaded: 2018-04-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela crista JST (número de concessão JPMJCR14W4), sociedade para a promoção da ciência (JSPS) KAKENHI (número de concessão 25600060, 16K 16386), o centro de inovação programa do MEXT e JST, projeto focado no desenvolvimento de tecnologia de avaliação de chave de Agência do Japão para a pesquisa médica e desenvolvimento, AMED, Mizuho Fundação para a promoção das Ciências. Microfabrication foi apoiado pela Universidade de Kyoto Nano tecnologia Hub.

1. a fabricação do molde Microfluidic dispositivo
<ol><li>Desenha o padrão do dispositivo microfluidic usando software disponível comercialmente (Clewin5 ou AutoCAD 2016, etc.). Para a função do Clewin5, consulte o manual do usuário (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual). Nota: O arquivo de projeto está disponível no arquivo complementar 1.</li>
	<li>Transferir o arquivo de projeto para um gerador de padrão micro e carregar a ferramenta com uma máscara de cromo revestida com o fotorresiste positivo.</li>
	<li>Expor o fotorresiste positiva na área padrão usando um gerador de padrão micro.</li>
	<li>Desenvolver o fotorresiste positiva usando o desenvolvedor (Tabela de materiais) e enxaguar a máscara com água desionizada (DI).</li>
	<li>Usando o ácido de cromo (Tabela de materiais), condicione o cromo na área exposta onde o fotorresiste positivo foi removido. Enxague a máscara com água.</li>
	<li>Remova o restante o fotorresiste a máscara usando acetona. Nota: A máscara de transparência pode ser uma alternativa para a máscara de Cr.</li>
	<li>Preparar uma bolacha de silicone limpa (4 polegadas, P(100)) e rotação casaco hexamethyldisilazane (HMDS) a 3.000 rpm por 30 s.</li>
	<li>Softbake HMDS por 5 min a 120 ° C e esfriar a bolacha por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Spincoat o fotorresiste negativo (tabela de materiais) a 500 rpm para 10 s e 1.200 rpm por 30 s. Nota: A condição de revestimento de rotação deve produzir as camadas fotorresiste com uma espessura de aproximadamente 100 µm sobre as bolachas, depois fotolitografia.</li>
	<li>Prebake o negativo fotorresiste por 45 min a 95 ° C e esfriar a bolacha para 60 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Verifique a intensidade da luz UV em cada experimento e calcular o tempo de exposição para uma dose de energia de exposição total de 250 mW/cm2. Coloque a Fotomáscara (etapa 1.1-1.6) sobre a bolacha e expô-los à luz UV.</li>
	<li>Postbake o negativo fotorresiste por 1 min a 65 ° C e a 5 minutos a 95 ° C. Permita a bolacha refrigerar para baixo por 1 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Desenvolva a camada negativa fotorresiste por 15 min no banho primeiro desenvolvedor (Tabela de materiais) e a 2 min no segundo banho. Enxágue a bolacha no primeiro banho isopropanol (IPA) por 10 s e no segundo banho IPA por 10 s.</li>
	<li>Hardbake o negativo fotorresiste por 30 min a 200 ° C e esfriar a bolacha por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Medir a espessura da camada de fotorresiste negativo usando um gerador de perfil de superfície.</li>
	<li>Colocar a bolacha num exsicador ligado a uma bomba de vácuo e adicionar 200 µ l de silano (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane). Ligue a bomba durante 10 minutos, desligá-lo e continuar a bolacha no exsicador para 4 h.</li>
</ol>2. etapas a fabricação e a montagem de camadas PDMS
<ol><li>Conversão do pré-polímero de polidimetilsiloxano (PDMS) (PDMS base: agente de cura = 10:1 (w/w)) e desgaseificar em uma câmara de vácuo para 2h.</li>
	<li>Cura PDMS a 80° C em um forno ventilado de ar durante a noite.</li>
	<li>Retire o PDMS do wafer de silício.</li>
	<li>Socar a 1A de buracos - 3B (Figura 1) e a cultura de esferoide bem. Use um soco de 2 mm de diâmetro para furos 1A - 3B e um diâmetro de 1 mm um soco para o spheroid bem.</li>
	<li>Limpe a laje PDMS e uma lamela de vidro (24 mm × 24 mm) com fita adesiva, por várias vezes furando e descascando a fita. Em seguida, tratar a laje PDMS com plasma de ar para 40 s (40 mW, 50 sccm).</li>
	<li>Ligação da laje PDMS para o deslizamento da tampa de vidro para expulsar quaisquer bolhas de ar da superfície entre a laje PDMS e a lamínula e cura a 80 ° C, durante pelo menos 12 h.</li>
</ol>3. spheroid preparação
Nota: No estudo, proteína fluorescente vermelha expressando umbilical humano veia células endoteliais (RFP-HX) e expressar a proteína verde fluorescente HX (GFP-HX) é usados no esferoide e microcanais, respectivamente, para distinguir a origem do HX após a construção de uma rede vascular perfusable. Se a origem do HX não é necessário, sem rótulo HX é suficientes para o experimento.
<ol><li>Descongelar o RFP-HX (3,0 × 105 células/frasco) e fibroblastos de pulmão humano (fan) (1,0 × 106 células/frasco) e adicioná-los em 10 mL de meio para células endoteliais e células de fibroblastos, respectivamente (Tabela de materiais). Cultura-os em um prato de 100mm no 37 ° C e 5% de CO2 por 2-3 dias para sub confluente RFP-HX e hLFs. Esta preparação renderá ~ 200 esferoides.</li>
	<li>Desanexar a RFP-HX e hLFs de pratos com 2 mL de 0,05% do trypsin-EDTA e parar a reação de tripsina com 4 mL de DMEM contendo 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) e 1% (v/v) penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Após a centrifugação a 220 x g, durante 3 min, remover o sobrenadante e ressuspender o RFP-HX e hLFs a endotelial médio concentrações de final de célula em 2,5 × 104 e 1,0 × 105 células/mL, respectivamente.</li>
	<li>Delicadamente adicione 200 µ l de suspensão de célula (5.000 células para RFP-HX) e 20.000 células por hLFs por alvéolo em uma placa de 96 poços, com superfície de ligação ultra baixo.</li>
	<li>Incube a placa de 96 poços em 37 ° C e 5% de CO2 por um período de 2 a 4 dias. Nota: Uma vez que o diâmetro de esferoide depende o período de cultura e o número de célula inicial da placa de 96 poços, pode ser controlado por estes dois parâmetros.</li>
</ol>4. célula semeadura no dispositivo Microfluidic
Nota: A Convenção de nomenclatura para os furos, canais e o esferoide bem são demonstrados na Figura 1. Definimos o dia 0 como o dia quando a célula colheita no dispositivo microfluidic terminar. Diagrama esquemático de prazos das experimentais é mostrado na Figura 2.
<ol><li>Carregamento de esferoide − 1 dia) Nota: O passo seguinte deve ser executado no gelo para evitar gelificação de colágeno e fibrina.<ol>
<li>Dissolva o fibrinogênio em solução salina tamponada fosfato (PBS) para uma concentração final de 2,80 mg/mL.</li>
		<li>Prepare o colágeno neutralizado (3,0 mg/mL de PBS) de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Combine 107,2 µ l da solução de fibrinogênio (2,80 mg/mL), 8,0 µ l de colágeno neutralizado (3,0 mg/mL) e 3,6 µ l de aprotinina (5 U/mL) por reação em um tubo. Esta solução é rotulada "mestre mistura solução" (MS). Nota: O volume é suficiente para carregar um esferoide. Se houver mais de um esferoide, multiplique cada volume pelo número de esferoides.</li>
		<li>Dissolva a trombina em PBS para uma concentração final de 50 U/mL. Nota: Alíquotas de 50 trombina U/mL (20 µ l/tubo) são armazenadas em 30 ° C e são descongeladas antes de cada experimento.</li>
		<li>Coloque a placa de 96 poços, contendo os esferoides dentro da armário de biossegurança.</li>
		<li>Prepare dois pratos de Petri 35mm dentro do armário, com um prato no gelo (prato 1) e o outro prato sobre a bancada (prato 2) a biossegurança. Pipeta 99 µ l de MS no centro do prato 1 (Figura 3a) para formar uma gota.</li>
		<li>Apare as pontas de 2 amarelo (10-100 µ l) e 3 limpar pontas de pipetas (1-100 µ l) para a coleção de esferoides da placa de 96 poços, mistura de trombina com MS, precisa coleção dos esferoides, injetando os esferoides o dispositivo e injetando o dispositivo de mídia , respectivamente. O tamanho dos poros da ponta deve ser ligeiramente maior que o diâmetro dos furos 1A - 3B dos canais 1 e 3 ou o spheroid bem no canal 2 para um confortável apto. Nota: Daqui em diante, a menos que indicado o contrário, use as pontas de pipeta cortadas nesta etapa. A fotografia de dicas de corte está disponível na Figura 4.</li>
		<li>Coletar um esferoide com 100 µ l do meio da placa de 96 poços e adicioná-lo ao prato 2 (Figura 3a).</li>
		<li>Pega o spheroid com volume mínimo de mídia do prato 2. Mantendo a pipeta na posição vertical, o spheroid deve avançar para a parte inferior da ponta da pipeta por gravidade. Ejete o spheroid tocando a ponta da pipeta para o menisco do MS gota no prato 1 (Figura 3a). Nota: Os passos seguintes 4.1.10 & 4.1.11 devem ser realizados rapidamente.</li>
		<li>Adicione 1 µ l de trombina (50 U/mL) e misture delicadamente com a ponta da pipeta amarelo.</li>
		<li>Com a pipeta, situada a 7 µ l, pegar o spheroid e lentamente coloque-o dentro do poço de esferoide (Figura 3b).</li>
		<li>Incube por 15 min a 37 ° C para a gelificação de fibrina.</li>
		<li>Lentamente injete endotelial médio dos buracos 1A e 3A e preenchimento canais 1 e 3 com mídia (20 ~ 30 µ l/canal).</li>
		<li>Coloque o dispositivo em um prato de 100mm com um Kimwipe molhado para evitar a evaporação de mídia do dispositivo (Figura 3C).</li>
		<li>Coloque o dispositivo em 37 ° C e 5% CO2 por 24 h remover as bolhas na interface entre a mídia e a fibrina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dia 0) HX carregando<ol>
<li>Descongelar o GFP-HX (3,0 x 105 células/frasco) e adicioná-los à 10 mL do meio de endotelial. Cultura-os em um prato de 100mm no 37 ° C e 5% CO2 por 2-3 dias para chegar a subconfluência. Um prato de sub confluente GFP-HX é suficiente para a preparação de dispositivos de 8-10.</li>
		<li>Desanexar GFP-HX de pratos com 2 mL de 0,05% do trypsin-EDTA e parar a reação de tripsina com 4 mL de DMEM contendo 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) e 1% (v/v) penicilina/estreptomicina.</li>
		<li>Após a centrifugação a 220 x g, durante 3 min, resuspenda o GFP-HX a endotelial médio no 5.0 x 106 células/mL.</li>
		<li>Injetar suspensão de células de HX no canal 1 através do buraco 1B (20 µ l/canal).</li>
		<li>O dispositivo microfluidic 90° de inclinação, coloque-o no lado e incubar a 37 ° C por 30 min garantir que o HX adere a fibrina no canal 2.<ol>
<li>Confirme a penhora de HX sobre a fibrina. Quando o número de HX anexado na interface entre o gel e o médio não é suficiente, a vasculatura pode ser desconectada na raiz vascular após alguns dias de cultura de dispositivo (Figura 5). No protocolo, a taxa de sucesso da perfusão é > 50%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Repita as etapas 4.2.4 e 4.2.5 para canal 3.</li>
		<li>Células de cultura em um prato de 100mm com um Kimwipe úmido a 37 ° C e 5% CO2 por 7-14 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 dia ~) troca de mídia<ol>
<li>Metade dos meios de comunicação nos canais 1 e 3 troca todos os dias.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. núcleos de coloração
<ol><li>Prepare o paraformaldeído 4% (PFA) em PBS.</li>
	<li>Remova a mídia dos canais 1 e 3 e adicionar 20 µ l de 4% PFA por canal. Para substituir a solução em 4% PFA, repetição removendo a solução do dispositivo e adicionar 4% PFA três vezes.</li>
	<li>Incube o dispositivo a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>Remover 4% PFA do dispositivo e lavagem dos canais três vezes com PBS.</li>
	<li>Adicione 20 µ l de 10 µ g/mL a tintura fluorescente (Tabela de materiais) por canal para manchar os núcleos celulares. Para trocar a solução no dispositivo, repita removendo a solução do dispositivo e adicionando 10 µ g/mL a tintura fluorescente três vezes.</li>
	<li>Armazene o dispositivo em 4 ° C por 24 h.</li>
</ol>6. fluido perfusão de um esferoide
<ol><li>Prepare o spheroid após cultivo para mais de 7 dias no dispositivo a 37 ° C e 5% de CO2 para a conclusão de um percurso vascular contínuo.</li>
	<li>Remova o meio de 3B, 1B, 3A e 1A de buracos.</li>
	<li>Introduzir 10 µ l de solução de 10 µM de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextran em PBS em buracos 1A e 1B.</li>
	<li>Monitore o fluxo de microbeads ou tintura FITC sob um microscópio invertido.</li>
</ol>7. quantificação de comprimento Sprout
Nota: O software de ver. 1,49 ImageJ é usada para todas da análise da imagem neste estudo.
<ol><li>Sobrepor as imagens dos dias de GFP-HX 0, 1, 3, 5 e 7.</li>
	<li>Subtrai a posição da ponta da vasculatura do dia 0 na mesma posição para imagens tiradas nos dias 1, 3, 5 e 7.</li>
	<li>Determine o crescimento da ponta vascular da posição de raiz (Figura 6). A distância entre a ponta vascular e raiz foi definida como o comprimento do broto neste estudo (Figura 7b).</li>
</ol>8. quantificação dos ângulos Vascular
Nota: Ângulo Vascular foi definido como o ângulo consistia por ângulo vascular, raiz e centro do spheroid (Figura 7C).
<ol><li>Binarize as imagens fluorescentes do spheroid coculture contendo RFP-HX e medir a posição de "centroide" pela função de análise no ImageJ. Neste estudo, a posição de medida "centroide" é definida como o centro do spheroid (Figura 6).</li>
	<li>Determine a posição das pontas vasculares e raízes na mesma maneira na etapa 7.</li>
	<li>Medir os ângulos vasculares usando a função de análise no software ImageJ.</li>
</ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Perfused+Human+Capillary+Networks.">In Vitro Perfused Human Capillary Networks.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).</li><li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device.">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li><li>Huang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+microscale+cellular+niches+for+three-dimensional+multicellular+co-cultures.">Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures.</a> Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).</li><li>Newman, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Stromal+Cell+Secretomes+Reveals+a+Critical+Role+for+Stromal+Cell-Derived+Hepatocyte+Growth+Factor+and+Fibronectin+in+Angiogenesis.">Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).</li><li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis:+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+lumen+formation.">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li><li>Griffith, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+limits+of+an+in+vitro+thick+prevascularized+tissue.">Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue.</a> Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+Liquid+Tumors:+An+In+Vitro+Assay+for+Leukemic-Cell-Induced+Bone+Marrow+Angiogenesis.">Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).</li><li>Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+developing+vasculature+and+optogenetically+engineered+skeletal+muscle+improves+muscle+contraction+and+angiogenesis.">Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis.</a> Biomaterials. 156, 65-76 (2018).</li></ol>

O autor declara que eles não têm nenhum concorrentes interesses financeiros.

Relatórios anteriores mostram que hLFs secretam um coquetel de fatores angiogênico múltiplos, tais como angiopoietina-1, angiogenin, fator de crescimento de hepatócito, transformando o fator de crescimento-α, fator de necrose tumoral e algumas proteínas da matriz extracelular29, 30. Este ensaio baseia-se na secreção de hLFs em um esferoide coculture, que é a limitação da técnica angiogênico. Portanto, é fundamental para uma formação vascular est?...

Mudando de uma cultura de monocamada (bidimensional) para uma cultura tridimensional é motivada pela necessidade de trabalhar com modelos de cultura que imitam as funções celulares de vida tecidos1,2,3. Substratos de plástico lisos e duro comumente utilizados na cultura de pilha não se assemelham a maioria dos ambientes extracelulares no corpo humano. Na verdade, muitos estudos demonstram que arquitetura de tecido-específica de recriar de cultura tridimensional, pistas mecânicas e bioquímicas e comunicação célula-célula, que não tenham sido observados na cultura bidimensional convencional4, 5,6,7,8.
Um agregado multicelular ou esferoide, é uma das técnicas mais promissoras para perceber esta cultura tridimensional9,10. As células secretam a matriz extracelular (ECM) e podem interagir com os outros no spheroid. Embora alguns outra bioengenharia aproxima-se13,11,12,14, tais como célula de empilhamento, replicar com sucesso a complexidade espacial do corpo humano, essas abordagens têm apenas dois ou três tipos de células para a facilidade de análise e focada em apenas uma função de órgãos-alvo. Em contraste, as células em esferoides são expostas a ambientes de cultura diferente, dependendo de suas posições no spheroid devido à oferta heterogênea de nutrientes, oxigênio e parácrina e autócrina sinalização moléculas no spheroid. Esse recurso de esferoides imita parcialmente na vivo condição de cultura e ativar as células em esferoides para criar tecido muito mais complexo, organizado estruturam em vitro do que aquelas cultivadas em empilhamento tecido9, 15 , 16. note que se um esferoide é composto por um único tipo de células, a função das células o spheroid não é uniforme, devido ao ambiente heterogêneo no spheroid. Nos últimos anos, as culturas de esferoide permitido células-tronco pluripotentes células-tronco embrionárias (CES), induzidas (iPSCs) ou células-tronco tecido-residente para imitar na vivo do desenvolvimento sequências e recriar miniórgãos como o cérebro de17, fígado18e rim19,20.
Apesar dos progressos significativos nas técnicas de cultura de esferoide, cultivo esferoides grandes por muito tempo ainda é problemático. Em um tecido tridimensional, células precisam ser localizado dentro de 150-200 µm de um vaso sanguíneo devido a quantidade limitada de oxigênio e nutrientes21. Redes vasculares dentro o spheroid são necessárias para recapitular a troca de substâncias entre o sangue e os tecidos em vivo. Para conseguir isso, outros grupos têm co culto células endoteliais com alvo células22,23,24 ou induziu a diferenciação de células pluripotentes em células de CD31 positivo20. No entanto, as estruturas de embarcação-como relatadas não têm as extremidades abertas da lumina para fornecer oxigênio e nutrientes para o centro do spheroid. Para simular a função vascular para nutrir as células na cultura tridimensional, em aberto e perfusable rede vascular deve ser desenvolvida no spheroid.
Durante os últimos anos, alguns grupos de pesquisa no campo microengineering relataram métodos para construir uma rede vascular perfusable, formada espontaneamente em um dispositivo microfluidic utilizando factores angiogênico das células de fibroblastos cocultured25 ,26. Estas redes vasculares têm uma morfologia semelhante às suas contrapartes na vivo e podem ser remodelados por fatores ambientais, tornando-os adequados para imitar funções vasculares em uma cultura de esferoide. O propósito do presente protocolo é construir uma rede vascular perfusable em um esferoide usando uma plataforma de microfluidic27. O dispositivo microfluidic é modificado o dispositivo anteriormente relatados25 para que um esferoide pode ser incorporado. Direcionando a secreção angiogênico das células de fibroblastos em um esferoide de células endoteliais em microcanais, angiogênico brotos dos microcanais anastomosadas com o spheroid e formou uma rede vascular perfusable. Este método permite uma entrega direta de uma vasta gama de substâncias, tais como moléculas fluorescentes e grânulos de micrômetro-escala para o interior de um esferoide, que fornece o quadro para uma cultura de tecidos de longo prazo com redes vasculares.

<table><tbody><tr><td>AutoCAD 2017</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2017</td><td></td></tr><tr><td>A chromium mask coated with AZP 1350.</td><td>CLEAN SURFACE TECHNOLOGY</td><td>CBL2506Bu-AZP</td><td></td></tr><tr><td>Micro pattern generator</td><td>Heidelberg</td><td>uPG101</td><td></td></tr><tr><td>MF CD-26 developer</td><td>Rohm and haas electronic materials</td><td>-</td><td>Developer in protocol 1.4</td></tr><tr><td>S-Clean</td><td>Sasaki Chemical</td><td>S-24</td><td>Chromium etchant in protocol 1.5</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Wako</td><td>012-00343</td><td></td></tr><tr><td>Silicon Wafer</td><td>Canosis</td><td>SiJ-4</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>MIKASA</td><td>1H-D7</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td><td>Tokyo Ohka Kogyo</td><td>H0089</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>MicroChem</td><td>-</td><td>Negative photoresist in protocol 1.9</td></tr><tr><td>UV Exposure</td><td>Nanometric Technology Inc</td><td>LA310s</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td>Developer for the negative photoresist in protocol 1.13</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Wako</td><td>163-04841</td><td></td></tr><tr><td>Surface profiler</td><td>Veeco</td><td>Veeco Dektak XT-S</td><td></td></tr><tr><td>(Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane</td><td>Sigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Toray</td><td>184W/C</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Punch (1.0mm)&amp;nbsp;</td><td>Kai Industries</td><td>BP-10F</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Punch (2.0mm)&amp;nbsp;</td><td>Kai Industries</td><td>BP-20F</td><td></td></tr><tr><td>Plasma System</td><td>Femto Science</td><td>COVANCE</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>MATSUNAMI GLASS</td><td>C024241</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dishes</td><td>Iwaki</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell</td><td>Angio Proteomie</td><td>cAP-0001RFP</td><td></td></tr><tr><td>Normal Human Lung Fibroblasts</td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Media Kits</td><td>Lonza</td><td>CC-3132</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA&amp;bull; 4Na Solution with Phenol Red</td><td>Wako</td><td>204-16935</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Phosphate Buffered Salts)</td><td>Takara bio</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Sumitomo bakelite</td><td>631-21031</td><td></td></tr><tr><td>1000ul Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-402</td><td></td></tr><tr><td>200ul&amp;nbsp; Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-301</td><td></td></tr><tr><td>10ul Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>37650</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Model 370</td><td></td></tr><tr><td>GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell</td><td>Angio Proteomie</td><td>cAP-0001GFP</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin from bovine lung</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H21492</td><td>Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution</td><td>Wako</td><td>163-25983</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Fluorescence Microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Degital CCD Camera</td><td>OLYMPUS</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Biological Microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Fluorescence Microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>IX-83</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma</td><td>FD70S</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusable vascular network with a tissue model in a microfluidic device

Um esferoide (um agregado multicelular) é considerado como um bom modelo de tecidos vivos no corpo humano. Apesar do avanço significativo nas culturas esferoide, uma rede vascular perfusable nos esferoides permanece um desafio crítico para a cultura a longo prazo, necessário para manter e desenvolver as suas funções, tais como expressões de proteína e morfogênese. O protocolo apresenta um novo método para integrar uma rede vascular perfusable dentro o spheroid em um dispositivo microfluidic. Para induzir uma rede vascular perfusable no spheroid, brotos de angiogênico ligados ao microcanais foram guiados para o spheroid utilizando angiogênico fatores de fibroblastos de pulmão humano cultivados no spheroid. Os brotos angiogênico alcançou o spheroid, fundiu-se com as células endoteliais co cultivadas no spheroid e formaram uma rede vascular contínua. A rede vascular poderia perfundir o interior o spheroid sem quaisquer fugas. A rede vascular construída pode ser mais usada como uma rota para o fornecimento de nutrientes e remoção de resíduos de produtos, imitando a circulação de sangue vivo em. O método fornece uma plataforma nova em cultura de esferoide em direção a melhor recapitulação dos tecidos vivos.

A Figura 1 mostra um design e fotografia do dispositivo microfluidic. Tem três canais paralelos, no qual o canal 2 contém o spheroid bem. Canais 1 e 3 são usados para a cultura HUVEC e canal 2 é para o spheroid. Cada canal é separado por microposts trapezoidal projetado para padrão de PDMS. Os microposts impedir o hidrogel no canal 2 de vazamento nos canais 1 e 3 por tensão superficial e permitir a troca de substâncias entre o esferoide e HX em microc...

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Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

Perfusable rede Vascular com um modelo de tecido em um dispositivo Microfluidic

O protocolo descreve como engenheiro uma rede vascular perfusable em um esferoide. Microambiente ao redor do spheroid é concebido para induzir a angiogênese e conectar o spheroid para os microcanais em um dispositivo microfluidic. O método permite a perfusão do spheroid, que é uma técnica muito aguardada em culturas tridimensionais.

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

perfusable-vascular-network-with-tissue-model-microfluidic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.9K visualizações.  Kyoto University. O protocolo descreve como engenheiro uma rede vascular perfusable em um esferoide. Microambiente ao redor do spheroid é concebido para induzir a angiogênese e conectar o spheroid para os microcanais em um dispositivo microfluidic. O método permite a perfusão do spheroid, que é uma técnica muito aguardada em culturas tridimensionais.

Vídeo: Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

A microfluídica Endothelialized para estudo das interacções microvasculares em Doenças Hematológicas

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Bioengenharia

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Técnica microfluídico genipina Deposição de Cultura Extensão da micropatterned vasculares musculares Filmes Finos

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Preparando um modelo de microtumor humano vascularizado baseado em microfluídica

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

Autor em destaque: Criando microtumores vascularizados humanos como modelos para pesquisa translacional do câncer 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

Estabelecendo um Modelo Fisiológico de Microtumor Vascularizado Humano para Pesquisa em Câncer

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

Pesquisa do câncer

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

guiado por imagem, fabricação à base de laser de Redes microfluídicos Vascular derivadas

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the initial stage varies dramatically from the following process of neovascularization. Although there are plenty of models to simulate different stages of neovascularization, an in vitro 3D model that capitulates the initial process of neovascularization under the corresponding stimulations of normal vasculature microenvironments is still lacking. Here, we reconstructed an in vitro 3D model that mimics the initial event of neovascularization (MIEN). The MIEN model contains a microfluidic sprouting chip and an automatic control, highly efficient circulation system. A functional, perfusable microchannel coated with endothelium was formed and the process of sprouting was simulated in the microfluidic sprouting chip. The initially physiological microenvironment of neovascularization was recapitulated with the microfluidic control system, by which ECs would be exposed to high luminal shear stress, physiological transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distributions simultaneously. The MIEN model can be readily applied to the study of neovascularization mechanism and holds a potential promise as a low-cost platform for drug screening and toxicology applications.

Here, we provide a microfluidic chip and an automatically controlled, highly efficient circulation microfluidic system that recapitulates the initial microenvironment of neovascularization, allowing endothelial cells (ECs) to be stimulated by high luminal shear stress, physiological level of transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distribution simultaneously.

Modelo microfluido para imitar evento inicial de neovascularização

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Desenvolvimento de tecido cardíaco humano organizado 3D dentro de uma plataforma microfluida

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