Name: perfusable vascular network with a tissue model in a microfluidic device
Uploaded: 2018-04-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device at JoVE.com

Bu eser CREST JST (grant sayı JPMJCR14W4), toplum için promosyon, bilim (JSP'ler) KAKENHI (grant sayı 25600060, 16 K 16386), MEXT ve JST, proje anahtar değerlendirme teknoloji geliştirme odaklı yenilik Program Merkezi tarafından desteklenmiştir Tıbbi araştırma ve geliştirme, AMED, Mizuho temel bilimler tanıtımı için Japonya Ajansı. Microfabrication Kyoto Üniversitesi Nano teknoloji Hub tarafından desteklenmiştir.

1. mikrosıvısal aygıt kalıp imalatı
<ol><li>Piyasada bulunan yazılım kullanarak mikrosıvısal aygıt desen tasarım (Clewin5 veya AutoCAD 2016, vs.). Clewin5 işlevi için (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual) kullanım kılavuzuna başvurun. Not: Tasarım dosyası ek dosya 1' de kullanılabilir.</li>
	<li>Bir mikro desen jeneratör için tasarım dosya transferi ve olumlu fotorezist ile kaplı bir krom maske aracı yükleyin.</li>
	<li>Bir mikro Desen Oluşturucu'yu kullanmamanızı desen alanında pozitif fotorezist maruz.</li>
	<li>Geliştirici (Tablo reçetesi) kullanarak pozitif fotorezist geliştirmek ve maskeyi deiyonize (DI) su ile durulayın.</li>
	<li>Krom etchant (Malzeme tablo) kullanarak, nerede olumlu fotorezist kaldırıldı açık alan içinde krom etch. Maskeyi DI su ile durulayın.</li>
	<li>Fotorezist aseton kullanarak maske üzerinde kalan kaldırın. Not: Saydamlık maskesi Cr maskesi için bir alternatif olabilir.</li>
	<li>Temiz silikon gofret hazırlamak (4 inç, P(100)) ve spin kat hexamethyldisilazane (HMDS) 3000 devirde 30 s.</li>
	<li>120 ° C ve serin gofret oda sıcaklığında 5 min için 5 min için Softbake HMDS.</li>
	<li>Spincoat negatif fotorezist (tablo malzemelerin) 10 s 500 devir/dakika ve 30 için 1200 devir/dakika, s. Not: Spin kaplama koşulu fotorezist katmanları gofret üzerinde yaklaşık 100 µm kalınlığında fotolitografi sonra verim.</li>
	<li>95 ° C'de 45 dk için negatif fotorezist ppost ve gofret için oda sıcaklığında 60 dk serin.</li>
	<li>Her denemede UV ışık yoğunluğunu kontrol edin ve toplam pozlama enerji dozu 250 mW/cm2çekim hızı hesaplamak. Photomask (Adım 1.1-1.6) üzerinde gofret yerleştirin ve UV ışığına karşılaşmazlar.</li>
	<li>1 dk. 65 ° c ve 95 ° C'de 5 min için negatif fotorezist postbake Oda sıcaklığında 1 dakika soğumasını gofret ver.</li>
	<li>Negatif fotorezist katmanı 15dk ilk geliştirici (Tablo reçetesi) banyoda ve ikinci banyoda 2 min için geliştirmek. 10 için ilk isopropanol (IPA) banyoda gofret durulama s ve 10 ikinci IPA banyoda s.</li>
	<li>Hardbake negatif fotorezist 200 ° C ve serin gofret için oda sıcaklığında 5 dk, 30 dk için.</li>
	<li>Bir yüzey profiler kullanarak negatif fotorezist katman kalınlığını ölçmek.</li>
	<li>Bir vakum pompası bağlı bir desiccator gofret yerleştirin ve silane (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane)., 200 µL ekleyin 10 dk için pompa açmak sonra kapatmak ve gofret 4 h için desiccator unutmayın.</li>
</ol>2. üretim adımları ve PDMS katmanları montajı
<ol><li>Polydimethylsiloxane (PDMS) ön polimer döküm (PDMS Bankası: Ajan kür 10:1 (w/w) =) ve 2 h için bir vakum odasında degas.</li>
	<li>Bir hava Bacalı fırın gecede 80° C'de PDMS kesin çözüm.</li>
	<li>Silikon gofret üzerinden PDMS akasındaki.</li>
	<li>Delik 1A - 3B yumruk (şekil 1) ve küresel kültür iyi. 3B ve 1 mm çapında küresel için de yumruk - 2 mm çapında yumruk delikleri 1A için kullanın.</li>
	<li>PDMS levha ve cam kapak kayma (24 mm × 24 mm) yapışkan bant ile tekrar tekrar yapışmasını ve bandı peeling temizleyin. Hava plazma 40 ile PDMS levha tedavi s (40 mW, 50 sccm).</li>
	<li>PDMS levha üzerine herhangi bir hava kabarcıkları PDMS levha ve kapak astarlı ve tedavi için en az 12 h 80 ° c arasında yüzeyinden çıkarmak için cam kapak Not bağ.</li>
</ol>3. küresel hazırlık
Not: kırmızı floresan protein insan göbek ifade çalışmada, damar endotel hücreleri (RFP-HUVECs) ve yeşil flüoresan protein ifade HUVECs (GFP-HUVECs) küresel ve mikro, sırasıyla, kökeni ayırt etmek için kullanılır HUVECs sonra perfusable vasküler ağ. HUVECs kökeni gerekmiyorsa, etiketlenmemiş HUVECs deney için yeterlidir.
<ol><li>RFP-HUVECs (3.0 × 105 hücreleri/flakon) ve insan akciğer fibroblast (hLF) (1,0 × 106 hücreler/flakon) çözülme ve endotel hücreleri ve fibroblast hücreleri, orta 10 mL içine sırasıyla ekleyin (Malzemeler tablo). Onları CO2 37 ° C ve %5 100-mm tabak içinde 2-3 gün boyunca alt Konfluent RFP-HUVECs ve hLFs için kültür. Bu hazırlık ~ 200 pulcuklarının ortaya çıkarır.</li>
	<li>RFP-HUVECs ve hLFs yemeklerin 2 mL % 0.05 tripsin-EDTA ile bağlantısını kesin ve DMEM % 10 (v/v) fetal sığır serum (FBS) ve %1 (v/v) penisilin/streptomisin içeren tripsin tepki 4 mL ile durdurmak.</li>
	<li>Santrifüjü vasıl 220 x g 3 dk sonra süpernatant kaldırmak ve RFP-HUVECs ve hLFs sırasıyla son hücre konsantrasyonları 2.5 × 104 ve 1,0 × 105 hücre/mL, endotel orta resuspend.</li>
	<li>Yavaşça iyi başına hücre süspansiyon (RFP HUVECs için 5000 hücreleri) ve hLFs için 20.000 hücreleri 200 µL Ultra düşük bağlama yüzeyli bir 96-şey plaka ekleyin.</li>
	<li>96-şey plaka CO2 37 ° C ve %5 2-4 günlük bir süre için kuluçkaya. Not: Kültür süresi ve ilk cep numarasını 96-şey plaka üzerinde küresel çapı bağlı olduğundan, bu iki parametre tarafından denetlenebilir.</li>
</ol>4. hücre mikrosıvısal cihazda tohumlama
Not: Delikleri, kanalları ve küresel için adlandırma kuralı de gösterdi şekil 1' de. Biz gün 0 zaman mikrosıvısal cihazın içine hücre hasat bitmiş gün tanımlar. Deneysel zaman çizelgeleri şeması Şekil 2' de gösterilmiştir.
<ol><li>Gün – 1) küresel yükleme Not: Aşağıdaki adımı buza jelleşme kollajen ve fibrin önlemek için yapılmalıdır.<ol>
<li>Fibrinojen fosfat tamponlu tuz (PBS) 2.80 mg/mL nihai bir konsantrasyon için geçiyoruz.</li>
		<li>Etkisiz kollajen (3.0 mg/mL PBS) üreticinin protokolüne göre hazırlayın.</li>
		<li>107.2 µL fibrinojen çözüm (2.80 mg/mL), 8.0 µL etkisiz kollajen (3.0 mg/mL) ve aprotinin tepki bir tüp (5 U/mL) 3.6 µL birleştirir. Bu çözüm "ana mix çözüm" etiketli (MS). Not: Bir küresel yükleme için yeterli birimdir. Birden fazla küresel ise, her birim pulcuklarının sayısı ile çarpın.</li>
		<li>50 U/mL nihai bir konsantrasyon için PBS içinde Trombin geçiyoruz. Not: 50 U/mL Trombin (20 µL/tüp) Aliquots −30 ° C saklanır ve her deneme önce çözdürülen.</li>
		<li>Biyogüvenlik kabini içinde pulcuklarının içeren 96-şey tabak koyun.</li>
		<li>Biyogüvenlik dolap, bir tabak üzerinde buz (çanak 1) ve benchtop (dish 2) üzerinde diğer çanak içinde iki 35-mm Petri yemekler hazırlamak. Damlalıklı 99 µL of MS çanak 1 (bir damlacık oluşturmak içinşekil 3a) ortasına.</li>
		<li>İpuçları (10-100 µL) 2 sarı trim ve 3 pulcuklarının pulcuklarının cihazın içine enjekte ve medya cihazın içine enjekte MS, hassas pulcuklarının topluluğu ile Trombin karıştırma 96-şey plaka topluluğu için pipet İpuçları (1-100 µL) temizleyin , sırasıyla. İpucu gözenek boyutu biraz delik 1A - 3B Kanal 1 ve 3 çapından daha büyük olmalıdır veya küresel su kuyusu içinde Kanal 2 bir rahat için uygun. Not: Bundan sonra aksi belirtilmediği sürece, bu adımda kesmek pipet ipuçlarını kullanın. Kesme ipuçları fotoğraf şekil 4' te kullanılabilir.</li>
		<li>Bir küresel orta 100 µL ile 96-şey plaka toplayabilir ve çanak 2 (şekil 3a) ekleyebilir.</li>
		<li>Küresel medya dish 2 üzerinden en küçük birim ile almak. Pipettor dik tutarak, küresel yerçekimi tarafından damlalıklı ipucu dibe doğru hareket etmeliyiz. Küresel damlalıklı ipucu tabak 1 (şekil 3a) MS damlacık Menisküs üzerine dokunarak dışarı atmak. Not: Aşağıdaki adımları 4.1.10 & 4.1.11 hızlı bir şekilde yapılmalıdır.</li>
		<li>Trombin (50 U/mL) 1 µL ekleyin ve karışımı yavaşça sarı damlalıklı ucu ile.</li>
		<li>7 µL ayarla pipet ile küresel kadar almak ve yavaş yavaş küresel kuyuya (şekil 3b) yerleştirin.</li>
		<li>Fibrin jelleşme için 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.</li>
		<li>Yavaş yavaş delik 1A ve 3A ve dolgu Kanal 1 ve 3 endotel ortamından medya ile enjekte (20 ~ 30 µL/kanal).</li>
		<li>Aygıtın aygıt (şekil 3 c) ortamdan buharlaşma önlemek için ıslak bir Kimwipe ile 100 mm çanak yerleştirin.</li>
		<li>Aygıt için medya ve fibrin arasında arayüz kabarcıklar kaldırmak 24 h 37 ° C ve % 5 CO2 yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0 gün) HUVECs yükleme<ol>
<li>GFP-HUVECs (3.0 x 105 hücreleri/şişe) çözülme ve endotel orta 10 mL ekleyin. Onları 100-mm bulaşık 37 ° C ve % 5 CO2 alt-confluency ulaşmak 2-3 gün içinde kültür. Bir tabak alt Konfluent GFP-HUVECs 8-10 cihazların hazırlama için yeterli.</li>
		<li>GFP-HUVECs 2 mL % 0.05 tripsin-EDTA ile yemeklerin bağlantısını kesin ve DMEM % 10 (v/v) fetal sığır serum (FBS) ve %1 (v/v) penisilin/streptomisin içeren tripsin tepki 4 mL ile durdurmak.</li>
		<li>220 x g 3 dk de aralıklarla sonra GFP HUVECs 5.0 x 106 hücre/mL, endotel ortamda resuspend.</li>
		<li>HUVECs hücre süspansiyon Kanal 1 delik 1B aracılığıyla içine enjekte (20 µL/kanal).</li>
		<li>Mikrosıvısal aygıt 90 ° yatırmayı, yanına koyun ve HUVECs Kanal 2 fibrin uymasını sağlamak 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.<ol>
<li>HUVECs eki fibrin üzerinde onaylayın. Jel ve orta arasında arayüz, bağlı HUVECs sayısı yeterli olmadığı zaman damarlara vasküler kökündeki aygıt kültür (şekil 5) bir kaç gün sonra bağlantısı kesilmiş olabilir. İletişim kuralında, perfüzyon başarı oranı olduğunu > % 50.</li>
		</ol>
</li>
		<li>4.2.4 4.2.5 kanal 3 aygıtlarından.</li>
		<li>37 ° C ve % 5 CO2 7-14 gün boyunca nemli bir Kimwipe ile 100 mm çanak kültür hücreleri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gün 1 ~) ortam değişimi<ol>
<li>Kanal 1 ve 3 medyada yarısı her gün değişimi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. çekirdek boyama
<ol><li>%4 paraformaldehyde (PFA) PBS hazırlayın.</li>
	<li>Kanal 1 ve 3 medyayı çıkarın ve 20 µL % 4'lük eklemek PFA kanal başına. %4 çözümde değiştirmek için İngiltere'de yılın, tekrar çözüm aygıtınızdan kaldırdığınızda ve % 4 ekleyerek PFA üç kez.</li>
	<li>Cihazın 4 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
	<li>% 4 kaldırma aygıt ve yıkama PFA kanalları üç kez PBS ile.</li>
	<li>10 µg/ml floresan boyalar (Tablo reçetesi) 20 µL hücresel çekirdeği leke kanal başına ekleyin. Cihazın çözümde değişimi için çözüm aygıtınızdan kaldırdığınızda ve 10 µg/mL ekleyerek floresan boya üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>4 ° C'de 24 h için aygıt depolar.</li>
</ol>6. sıvı perfüzyon bir küresel
<ol><li>Küresel fazla 7 gün içinde belgili tanımlık aygıt 37 ° C ve % 5 CO2 sürekli bir damar yolu tamamlanması için kültür sonra hazırlayın.</li>
	<li>Orta delik 1A, 1B, 3A ve 3B kaldırın.</li>
	<li>Floresein isothiocyanate (FITC) 10 µM çözüm 10 µL tanıtmak-PBS içinde dextran delik 1A ve 1B.</li>
	<li>Lastikteki veya ters bir mikroskop altında FITC boya akışını izlemek.</li>
</ol>7. Filiz uzunluğu miktar
Not: ImageJ ver 1.49 yazılım tüm bu çalışmada görüntü analizi için kullanılır.
<ol><li>GFP-HUVECs gün 0, 1, 3, 5 ve 7 görüntülerin üst üste geliyor.</li>
	<li>Damarlara Günün İpucu'nu 0, 1, 3, 5 ve 7 gün çekilen görüntüleri aynı konumdan konumunu çıkarma.</li>
	<li>Kök konumu (şekil 6) vasküler ucundan büyüme belirlemek. Vasküler ipucu ve kök arasındaki mesafe (şekil 7b) Bu çalışmada Filiz uzunluğu olarak tanımlanmıştır.</li>
</ol>8. miktar vasküler açıların
Not: damar Açı açı oluşuyordu damar açı, kök ve küresel (Şekil 7 c) merkezi olarak tanımlanmıştır.
<ol><li>RFP-HUVECs içeren coculture küresel floresan görüntülerini binarize ve ImageJ analiz fonksiyonu tarafından "centroid" konum ölçmek. Bu çalışmada, ölçülen "centroid" konumu (şekil 6) küresel merkezi olarak tanımlanır.</li>
	<li>7. adımda aynı şekilde vasküler ipuçları ve kökleri konumunu belirleyin.</li>
	<li>ImageJ yazılımında analiz işlevini kullanarak vasküler açıları ölçmek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+Biology's+new+dimension.">Cell culture: Biology's new dimension.</a> Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+polarity+and+functional+bile+canaliculi+in+rat+hepatocyte+spheroids.">Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids.</a> Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).</li><li>Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organizing+principle:+microenvironmental+influences+in+the+normal+and+malignant+breast.">The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast.</a> Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+for+netrins+in+regulating+epithelial+behavior+during+lung+branching+morphogenesis.">Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis.</a> Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).</li><li>Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+assay+on+a+silicon+chip+applicable+for+tumors+extirpated+from+mammalians.">Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians.</a> International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+And+Environment+Interactions+In+Tumor+Microregions+-+The+Multicell+Spheroid+Model.">Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions - The Multicell Spheroid Model.</a> Science. 240 (4849), 177-184 (1988).</li><li>Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+microfluidic+technologies+for+cell-to-cell+interaction+studies.">Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies.</a> Lab on a Chip. , (2017).</li><li>Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sheet+approach+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).</li><li>Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips+at+the+frontiers+of+drug+discovery.">Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), (2014).</li><li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373 (2013).</li><li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant.">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481 (2013).</li><li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+In+Vivo+Origin+of+Metanephric+Nephron+Progenitors+Enables+Generation+of+Complex+Kidney+Structures+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 15, 177-200 (2013).</li><li>Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Approach+for+Formation+of+Vascularized+Liver+Tissue+by+Endothelial+Cell-Covered+Hepatocyte+Spheroid+Integration.">An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+fibroblasts+to+regulate+the+formation+of+three-dimensional+vessel-like+structures+from+endothelial+cells+in+vitro.">Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).</li><li>Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+assemble+into+a+3-dimensional+prevascular+network+in+a+bone+tissue+engineering+construct.">Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct.</a> Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).</li><li>Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+functional,+perfusable+3D+microvascular+networks+on+a+chip.">Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip.</a> Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).</li><li>Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Perfused+Human+Capillary+Networks.">In Vitro Perfused Human Capillary Networks.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).</li><li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device.">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li><li>Huang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+microscale+cellular+niches+for+three-dimensional+multicellular+co-cultures.">Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures.</a> Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).</li><li>Newman, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Stromal+Cell+Secretomes+Reveals+a+Critical+Role+for+Stromal+Cell-Derived+Hepatocyte+Growth+Factor+and+Fibronectin+in+Angiogenesis.">Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).</li><li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis:+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+lumen+formation.">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li><li>Griffith, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+limits+of+an+in+vitro+thick+prevascularized+tissue.">Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue.</a> Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+Liquid+Tumors:+An+In+Vitro+Assay+for+Leukemic-Cell-Induced+Bone+Marrow+Angiogenesis.">Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).</li><li>Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+developing+vasculature+and+optogenetically+engineered+skeletal+muscle+improves+muscle+contraction+and+angiogenesis.">Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis.</a> Biomaterials. 156, 65-76 (2018).</li></ol>

Yazar ilan hiçbir rakip mali çıkarlarının zorundalar.

Önceki raporları hLFs angiopoietin-1, angiogenin, hepatosit büyüme faktörü, büyüme faktör-α, tümör nekrozis faktör ve bazı hücre dışı matriks proteinleri29dönüşüm gibi birden çok anjiogenik faktörlerin bir kokteyl salgılar göstermek, 30. Bu tahlil anjiogenik salgı ilgili kısıtlama tekniği, coculture küresel hLFs üzerinden kullanır. Bu nedenle, coculture küresel ve Kanal 1 ve 3 HUVECs arasındaki mesafe kısaltılmış bir kuyunu...

Üç boyutlu bir kültüre monolayer (iki boyutlu) kültüründen değişen motive yaşayan hücresel işlevlerini taklit kültür modelleri ile çalışması gerektiğinden dokular1,2,3. Düz ve sert plastik yüzeylerde yaygın olarak kullanılan hücre kültüründe insan vücudu hücre dışı ortamlarda çoğu benzer değil. Aslında, birçok çalışma o üç boyutlu kültür yeniden doku özgü mimari, mekanik ve biyokimyasal ipuçları ve hücre-hücre iletişim, geleneksel iki boyutlu kültür4' tegözlenen değil göstermek, 5,6,7,8.
Bir çok hücreli agrega veya küresel, bir bu üç boyutlu kültür9,10gerçekleştirmek için en umut verici teknikleri biridir. Hücreleri hücre dışı Matriks (ECM) salgılar ve diğerleri ile küresel etkileşim kurabilir. Her ne kadar bazı diğer Biyomühendislik gibi hücre istifleme,11,12,13,14, yaklaşımlar başarıyla insan vücudunun kayma karmaşıklık çoğaltmak, yalnızca iki veya üç bu yaklaşımlar var hücreler analiz kolaylığı ve hedef organlar üzerinde duruldu yalnızca bir işlev için türlü. Buna ek olarak, pulcuklarının hücrelerde besinler, oksijen ve parakrin ve küresel olarak sinyal otokrin heterojen temini nedeniyle küresel konumlarına bağlı olarak farklı kültür ortamlara maruz kalır. Bu özelliği pulcuklarının, kısmen vivo içinde kültür durumu ve olanaklı kılmak çok daha karmaşık, organize doku oluşturmak için pulcuklarının hücrelerde vitro bu yığın doku9', kültürlü yapısı taklit eder 15 , 16. bir küresel tek bir hücre oluşur, küresel hücrelerde işlevi nedeniyle küresel türdeş olmayan ortamda tek tip olmadığını unutmayın. Son birkaç yıl içinde küresel kültürler embriyonik kök hücreleri (ESCs), indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) veya doku yerleşik kök hücre içinde vivo gelişimsel dizileri taklit ve mini-organ beyin17gibi yeniden girebilir, karaciğer18ve böbrek19,20.
Küresel kültür teknikleri önemli ilerlemeye rağmen hala uzun bir süre için büyük pulcuklarının kültür problemlidir. Üç boyutlu bir doku hücreleri oksijen ve besin21sınırlı kaynağı nedeniyle bir kan damarı 150-200 µm içinde bulunduğu gerekir. Küresel içinde damar ağları arasında kan ve doku içinde vivoalışverişi maddeler özetlemek gereklidir. Bunu başarmak için diğer gruplar endotel hücreleri hedef hücre22,23,24 ile birlikte kültürlü veya pluripotent hücreler farklılaşma CD31 pozitif hücreler20içine indüklenen. Yine de, bildirilen gemi benzeri yapıları lumina oksijen ve besin küresel ortasına sağlamak için açık uçları var mı. Üç boyutlu kültür hücrelerde besleyen damar rol taklit etmek için açık uçlu ve perfusable damar ağı içinde küresel geliştirilmelidir.
Son birkaç yıl içinde bazı araştırma grupları microengineering alanındaki kendiliğinden bir mikrosıvısal cihazda anjiogenik faktörler cocultured fibroblast hücreleri25 kullanarak oluşturduğu bir perfusable vasküler ağ oluşturmak için yöntemleri bildirdi. ,26. Vasküler bu şebekeler için in vivo meslektaşlarına benzer görünümdeki ve vasküler fonksiyonlar bir küresel kültür taklit için uygundur çevresel faktörler tarafından yenilenmiş. Bu iletişim kuralının amacı bir mikrosıvısal platformu27kullanarak bir küresel perfusable vasküler ağlarda oluşturmaktır. Böylece bir küresel dahil edilebilir mikrosıvısal aygıt daha önce bildirilen aygıt25 değiştirilir. Bir küresel fibroblast hücrelerinde üzerinden anjiogenik salgı mikro endotel hücreleri yönlendirerek tarafından anjiogenik ile küresel anastomosed mikro üzerinden lahanası ve perfusable bir damar ağı kurdu. Bu yöntem, floresan molekülleri ve damar ağları ile uzun vadeli bir doku kültürü için çerçeve sağlar bir küresel iç içine mikrometre ölçekli boncuk gibi maddeleri geniş bir doğrudan teslim sağlar.

<table><tbody><tr><td>AutoCAD 2017</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2017</td><td></td></tr><tr><td>A chromium mask coated with AZP 1350.</td><td>CLEAN SURFACE TECHNOLOGY</td><td>CBL2506Bu-AZP</td><td></td></tr><tr><td>Micro pattern generator</td><td>Heidelberg</td><td>uPG101</td><td></td></tr><tr><td>MF CD-26 developer</td><td>Rohm and haas electronic materials</td><td>-</td><td>Developer in protocol 1.4</td></tr><tr><td>S-Clean</td><td>Sasaki Chemical</td><td>S-24</td><td>Chromium etchant in protocol 1.5</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Wako</td><td>012-00343</td><td></td></tr><tr><td>Silicon Wafer</td><td>Canosis</td><td>SiJ-4</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>MIKASA</td><td>1H-D7</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td><td>Tokyo Ohka Kogyo</td><td>H0089</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>MicroChem</td><td>-</td><td>Negative photoresist in protocol 1.9</td></tr><tr><td>UV Exposure</td><td>Nanometric Technology Inc</td><td>LA310s</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td>Developer for the negative photoresist in protocol 1.13</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Wako</td><td>163-04841</td><td></td></tr><tr><td>Surface profiler</td><td>Veeco</td><td>Veeco Dektak XT-S</td><td></td></tr><tr><td>(Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane</td><td>Sigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Toray</td><td>184W/C</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Punch (1.0mm)&amp;nbsp;</td><td>Kai Industries</td><td>BP-10F</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Punch (2.0mm)&amp;nbsp;</td><td>Kai Industries</td><td>BP-20F</td><td></td></tr><tr><td>Plasma System</td><td>Femto Science</td><td>COVANCE</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>MATSUNAMI GLASS</td><td>C024241</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dishes</td><td>Iwaki</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell</td><td>Angio Proteomie</td><td>cAP-0001RFP</td><td></td></tr><tr><td>Normal Human Lung Fibroblasts</td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Media Kits</td><td>Lonza</td><td>CC-3132</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA&amp;bull; 4Na Solution with Phenol Red</td><td>Wako</td><td>204-16935</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Phosphate Buffered Salts)</td><td>Takara bio</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Sumitomo bakelite</td><td>631-21031</td><td></td></tr><tr><td>1000ul Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-402</td><td></td></tr><tr><td>200ul&amp;nbsp; Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-301</td><td></td></tr><tr><td>10ul Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>37650</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Model 370</td><td></td></tr><tr><td>GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell</td><td>Angio Proteomie</td><td>cAP-0001GFP</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin from bovine lung</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H21492</td><td>Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution</td><td>Wako</td><td>163-25983</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Fluorescence Microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Degital CCD Camera</td><td>OLYMPUS</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Biological Microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Fluorescence Microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>IX-83</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma</td><td>FD70S</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusable vascular network with a tissue model in a microfluidic device

Bir küresel (çok hücreli agrega) insan vücudunun içinde yaşayan doku iyi bir model olarak kabul edilir. Küresel kültürler içinde önemli ilerleme rağmen pulcuklarının perfusable vasküler ağlarda korumak ve protein ifadeler ve morfogenetik gibi işlevlerini geliştirmek için gerekli uzun vadeli kültür için kritik bir meydan okuma kalır. Protokol perfusable bir damar ağı içinde küresel bir mikrosıvısal cihazın entegre etmek için yeni bir yöntem sunuyor. Küresel perfusable vasküler ağlarda ikna etmek için mikro için bağlı anjiogenik lahanası için küresel anjiogenik faktörler küresel kültürlü insan akciğer fibroblastlar üzerinden kullanarak destekli. Anjiogenik lahanası küresel işbirliği kültürlü endotel hücreleri ile birleştirilmiş küresel ulaştı ve sürekli bir damar ağı kurdu. Vasküler ağ olmadan herhangi bir küresel iç sıvı. İnşa vasküler ağ daha fazla besin temini ve atık ürünlerin, kan dolaşımını içinde vivotaklit kaldırılması için bir yol olarak kullanılabilir. Yöntemi küresel kültür yaşam dokuların daha iyi Rekapitülasyon doğru yeni bir platform sağlar.

Şekil 1 bir tasarım ve fotoğraf mikrosıvısal cihazın gösterir. Hangi kanalda 2 küresel de içeren üç paralel kanal içerir. Kanal 1 ve 3 HUVEC kültürü için kullanılan ve 2 için küresel kanalıdır. Her kanal trapez microposts desen PDMS tasarlanmış ayrılır. Microposts Kanal 2 hidrojel yüzey gerilimi tarafından kanallarına 1 ve 3 sızıntı önlemek ve mikro28arasında küresel ve HUVECs maddelerin değişimi sa?...

Watch this Scientific Journal Video about Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device at JoVE.com

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

Protokol bir küresel perfusable vasküler ağlarda mühendisi açıklar. Küresel'ın çevresindeki microenvironment angiogenez teşvik ve küresel bir mikrosıvısal cihazın mikro bağlanmak için planlanmaktadır. Yöntemi uzun zamandır beklenen tekniktir üç boyutlu kültürlerde küresel perfüzyon sağlar.

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

perfusable-vascular-network-with-tissue-model-microfluidic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.9K Görüntüleme.  Kyoto University. Protokol bir küresel perfusable vasküler ağlarda mühendisi açıklar. Küresel'ın çevresindeki microenvironment angiogenez teşvik ve küresel bir mikrosıvısal cihazın mikro bağlanmak için planlanmaktadır. Yöntemi uzun zamandır beklenen tekniktir üç boyutlu kültürlerde küresel perfüzyon sağlar.

Video: Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Biyomühendislik

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Micropatterned Vasküler Musküler İnce Filmlerin Genişletilmiş Kültür mikroakışkan Genipin Biriktirme Tekniği

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Mikroakışkan Tabanlı Vaskülarize İnsan Mikro Tümör Modelinin Hazırlanması

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

Yazar Spotlight: Translasyonel Kanser Araştırmaları için Model Olarak İnsan Vaskülarize Mikro Tümörleri Oluşturma 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

Kanser Araştırmaları

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

Vasküler kaynaklı mikroakışkan Ağların görüntü kılavuzluğunda, Lazer tabanlı Fabrikasyon

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the initial stage varies dramatically from the following process of neovascularization. Although there are plenty of models to simulate different stages of neovascularization, an in vitro 3D model that capitulates the initial process of neovascularization under the corresponding stimulations of normal vasculature microenvironments is still lacking. Here, we reconstructed an in vitro 3D model that mimics the initial event of neovascularization (MIEN). The MIEN model contains a microfluidic sprouting chip and an automatic control, highly efficient circulation system. A functional, perfusable microchannel coated with endothelium was formed and the process of sprouting was simulated in the microfluidic sprouting chip. The initially physiological microenvironment of neovascularization was recapitulated with the microfluidic control system, by which ECs would be exposed to high luminal shear stress, physiological transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distributions simultaneously. The MIEN model can be readily applied to the study of neovascularization mechanism and holds a potential promise as a low-cost platform for drug screening and toxicology applications.

Here, we provide a microfluidic chip and an automatically controlled, highly efficient circulation microfluidic system that recapitulates the initial microenvironment of neovascularization, allowing endothelial cells (ECs) to be stimulated by high luminal shear stress, physiological level of transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distribution simultaneously.

Neovaskülarizasyonun İlk Olayını Taklit Etmek için Mikroakışkan Model

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Mikroakışkan Bir Platformda 3D Organize İnsan Kardiyak Dokusu Geliştirme

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Micropatterned Vasküler Musküler İnce Filmlerin Genişletilmiş Kültür mikroakışkan Genipin Biriktirme Tekniği

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

Vasküler kaynaklı mikroakışkan Ağların görüntü kılavuzluğunda, Lazer tabanlı Fabrikasyon

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Neovaskülarizasyonun İlk Olayını Taklit Etmek için Mikroakışkan Model

Mikroakışkan Bir Platformda 3D Organize İnsan Kardiyak Dokusu Geliştirme