A neovascularização, a geração de novos vasos sanguíneos é um processo altamente regulado em eventos normais e patológicos. Para entender melhor a neovascularização, é importante reconstruir o processo no microambiente celular natural in vitro. Desenvolvemos um chip microfluido e controle automático.
Circulações altamente eficientes são feitas para formar micro-tubos de perfusão e simular o uso da proteína para recapitular ao evento inicial de nova vascularização. O chip de brotação microfluida era composto por três canais. Um canal de cultura celular endotelial e um canal líquido foram separados por um amplo canal de hidrogel central.
O sistema de controle microfluido consistia em uma bomba de microsiringe e válvula de beliscão eletromagnética. Um chip de armadilha de bolhas, um chip de brotação microfluido, uma bomba micro-peristáltica, e um reservatório de cultura média. Com um sistema microfluido, as células endoteliais poderiam ser estimuladas por alto estresse luminal, nível fisiológico de fluxo transendotelial e várias distribuições de fatores de crescimento endotelial vascular simultaneamente.
Pipeta 20 microliter de 125 microgramas por mililitro de fibronectina em uma porta de injeção de mídia do canal de cultura celular. Corte uma ponta de pipeta para caber no canal de cultura de células com uma tesoura. Insira a ponta pipeta no outro porta de injeção de mídia do canal de cultura celular.
Em seguida, pipeta fora ar do canal de cultura celular para preenchê-lo com fibronectina. Incubar os chips a 37 graus Celsius por uma hora. Antes da semeadura celular, pipeta 20 microliter de meio celular endotelial em cada porta de injeção de mídia e incubar os chips a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Então, pipeta toda a mídia em todas as portas de injeção de mídia. Em seguida, pipeta cinco microliter de suspensão celular em uma porta de injeção de mídia do canal de cultura celular. Em seguida, as células endoteliais rapidamente se espalham por todo o canal sob pressão hidrostática diferencial.
Adicione cerca de quatro a seis microliter de mídia ECM à outra porta para ajustar a pressão hidrostática e parar o movimento da célula. Controle os chips para a incubadora de células. Em seguida, vire os chips a cada 30 minutos até que as células endoteliais se vestem ao redor da superfície interna do canal de cultura celular, duas horas depois.
Use a ponta pipeta para remover as células anexadas nas portas de injeção com muito cuidado. Em seguida, insira quatro adaptadores Luer femininos farpados nas portas de injeção de mídia e encha com mídia ECM. Remova os chips para a incubadora celular, troque a mídia ECM e os adaptadores Luer a cada 12 horas.
Para montar o sistema de controle microfluido, prepare dois tubos de politetrafluoroetileno, dois tubos curtos de silicone, três tubos de silicone longos, um adaptador luer feminino farpado, um conector tipo Y e, em seguida, três conectores tipo L. Encha a seringa com 10 mililitros de meio ECM pré-aquecido. Conecte um tubo de politetrafluoroetileno à seringa por um adaptador luer fêmea farpado.
Em seguida, conecte a outra extremidade do tubo de politetrafluoroetileno a um conector do tipo Y. Em seguida, conecte dois tubos de silicone longos às outras duas extremidades do conector tipo Y. Usamos um tubo para conectar ao reservatório e ao outro tubo para conectar ao chip de armadilha de bolhas.
Conecte outro tubo de silicone longo ao reservatório. Em seguida, use dois tubos curtos de silicone para conectar todos os orifícios de entrada e saída na camada superior do chip de armadilha de bolhas. Conecte um tubo de politetrafluoroetileno ao backend do chip.
Em seguida, conserte uma seringa na bomba de microsinga. Corte dois tubos de silicone longos na válvula de beliscão eletromagnética. Em seguida, troque a válvula de beliscão eletromagnética para abrir o gasoduto entre a seringa e o reservatório.
Injete mídia no reservatório usando a bomba de microsiringe para esgotar o ar no tubo. Em seguida, troque a válvula novamente para abrir o gasoduto entre a seringa e o chip de armadilha de bolhas. Injete mídia para encher a câmara líquida e o tubo de retroescadidade do chip de armadilha de bolhas.
Retire chips de broto endotelial da incubadora celular e remova os adaptadores luer no lado da cultura celular. Insira dois plugues de tubo nas portas de injeção de hidrogel do chip de brotação microfluida. Conecte o tubo back-end do chip bubble trap a uma porta de canal de cultura celular.
Insira um conector tipo T na outra porta e conecte-o ao tubo de silício longo conectado ao reservatório. Corte o tubo de silicone longo na bomba micro peristáltica. Em seguida, insira um filtro de ar no reservatório.
Em seguida, monte o chip de brotação microfluidic para a incubadora de topo do palco. Em seguida, conecte a bomba de vácuo aos orifícios na camada inferior do chip de armadilha de bolhas por um tubo TPU. Defina o volume de circulação oposto e uma taxa de fluxo no programa personalizado que controla a bomba de microsinga e a válvula de beliscão eletromagnética simultaneamente.
Em seguida, configure a taxa de fluxo da bomba micro peristáltica. Ligue a bomba de microsiringe. Em seguida, o sistema de controle de circulação é estabelecido.
Testamos a função de barreira de alguns micro-vasos em nosso modelo medindo o coeficiente de permeabilidade difuso de 40 kDa F-I-T-C dextrina. Como é mostrado na figura, o coeficiente de permeabilidade difuso de chip de cultura estática com revestimento celular é de 0,1 mais ou menos 0,3 micrômetro por segundo. E o coeficiente de permeabilidade difusional do canal vazio sem forro celular é de 5,4 mais ou menos 0,7 micrômetros por segundo.
O ensaio de broto endotelial mostrou que as células endoteliais brotaram no hidrogel central em grande parte após 24 horas de cultivo estático, enquanto o grau de broto diminuiu significativamente com o aumento do estresse luminal da tesoura. Quantitativamente, o estresse da tesoura luminal diminuiu significativamente o broto endotelial em termos de área de broto, comprimento médio de broto e o maior comprimento de broto. Com nosso sistema, o estresse de cisalhamento nas células endoteliais pode ser alterado opcionalmente a qualquer momento durante o experimento, enquanto o fluxo transendotelial permaneceu em nível fisiológico.
Este modelo biomimético 3D in vitro pode ser diretamente aplicado ao estudo do mecanismo de neovasularização, e mantém a promessa potencial como uma plataforma de baixo custo para aplicações de triagem de medicamentos e toxicologia.
