Os biofilmes candida albicans como muitos espécimes biológicos são fortemente translúcidos para opacos em seu estado natal. Nesses protocolos, mostramos que, utilizando métodos de esclarecimento, a estrutura interna de biofilmes intactos fixos pode ser imagens por microscopia de secção óptica. Com etapas simples, baratas e relativamente rápidas de processamento, biofilmes intactos fixos podem ser transparentes para imagens 3D por microscopia de fluorescência de varredura confocal.
Demonstrando este procedimento hoje será Katie Lagree, uma pesquisadora de pós-doutorado aqui, e eu. Para iniciar o crescimento do biofilme em uma placa de 12 poços, prepare a placa conforme descrito no protocolo de texto. Coloque a placa em uma batedeira orbital de 60 RPM em uma incubadora de ar umidificada de 37 graus Celsius por 90 minutos para dar tempo para a adesão celular.
Após 90 minutos, remova as células médias e desapegadas e lave com meio estéril ou PBS. Transfira a substrata inoculada para outra placa multi-bem contendo meio de filamentação pré-aquecido. Retorne a placa para a incubadora de ar ambiente umidificado de 37 graus Celsius e cresça os biofilmes até 48 horas com mistura orbital de 60 RPM para aeração.
Recupere a placa de 48 horas da incubadora e remova o meio de cultura de cada espécime. Substitua o meio por PBS e incuba por vários minutos para diluir as proteínas do soro. Depois de remover o PBS, reabastecer os poços com fixação.
Volume fixativo suficiente deve ser adicionado a cada prato para imergir todo o crescimento do biofilme, incluindo qualquer no lado interno do prato. Coloque o prato coberto em uma batedeira orbital lenta por 20 minutos. Depois de remover o fixador conforme descrito no protocolo de texto, prepare-se para a coloração drenando o PBS e reabastecendo rapidamente os poços com uma solução contendo PBS e a mancha necessária.
Não permita que o biofilme escorra ou seque por mais de alguns segundos. Adicione a mancha ao prato. A quantidade necessária de mancha depende da massa do biofilme.
Em seguida, coloque o prato coberto em uma batedeira orbital lenta durante a noite e proteja da luz com papel alumínio ou um pedaço de papel preto. Usando pinças, transfira o biofilme fixo da PBS para cinco mililitros de 50/50 PBS-metanol em um frasco de vidro de 20 mililitros com o biofilme virado para cima. Misture manualmente com o movimento orbital em intervalos de um minuto por cinco minutos.
Remova o solvente para uma garrafa de resíduos sendo cauteloso para evitar o contato entre a pipeta e o biofilme ou o biofilme e o frasco. Reabastecer suavemente com três mililitros de metanol puro. Misture manualmente com o movimento orbital em intervalos de um minuto por três minutos.
Agora remova o solvente para uma garrafa de lixo e reabastete com cinco mililitros de metanol. Depois de misturar manualmente com movimento orbital em intervalos de um minuto por cinco a 10 minutos, remova o solvente para a garrafa de resíduo. Reabastecer imediatamente com três mililitros de metanol.
Biofilmes muitas vezes parecem mais opacos neste momento do que sua aparência inicial. Remova o solvente para a garrafa de resíduo e reabasteca imediatamente o frasco com cinco mililitros de 50/50 salicilato de metila de metanol. Misture manualmente com o movimento orbital em intervalos de um minuto por cinco a 10 minutos.
O biofilme deve ser semi-transparente neste solvente misto. Depois de remover o solvente para uma garrafa de resíduo, reabasteca suavemente o frasco com três mililitros de salicilato de metila puro. Misture manualmente com o movimento orbital em intervalos de um minuto por três minutos.
Repita o processo com cinco mililitros de salicilato de metila puro, misturando manualmente em intervalos de um minuto por cinco a 10 minutos. Neste ponto, o biofilme deve ser transparente. Remova o solvente para a garrafa de resíduo e reabasteca imediatamente o frasco com três mililitros de salicilato de metila puro.
O biofilme processado é estável neste solvente. Se usar um microscópio invertido, use um prato à prova de solventes que tenha um fundo de vidro e prepare os espaçadores para o suporte do espécime invertido. Aqui, os espaçadores são anéis de silicone de 13 milímetros que são pré-encharcados em salicilato de metila por uma hora para minimizar a deriva do foco devido ao inchaço.
Para um biofilme em um quadrado de silicone de grau médico, inverta o quadrado e coloque-o em um espaçador em uma piscina de salicílato de metila no prato. Certifique-se de evitar bolhas abaixo do espécime. Monte o prato firmemente no palco do microscópio e faça o óleo imerso em contato com o objetivo.
Ajuste a quantidade de salicílato de metila no prato para que o menisco mantenha o espécime firmemente para baixo sobre o espaçador por tensão superficial. Coloque uma gota de salicilato de metila em cima do substrato quadrado invertido para reduzir a dispersão de luz do acabamento fosco. Em seguida, cubra o prato com uma placa de vidro para limitar a evaporação.
Espere vários minutos para que o espécime se instale nos espaçadores antes da imagem. Agora, realize microscopia confocal para imagem do espécime conforme descrito no protocolo de texto. Para processar as imagens, abra ImageJ ou Fiji.
Verifique se o programa tem memória atribuída suficiente para que os dados sejam processados. Processar um conjunto de dados de dois gigabytes requer pelo menos oito gigabytes de RAM dedicado para uma operação suave. Abra o arquivo de imagem do avião serial a ser processado.
Se o computador tiver RAM insuficiente para processar toda a pilha, os subsares podem ser processados e, em seguida, remontados em uma única pilha. Converta os dados em formato de 32 bits para habilitar operações aritméticas de ponto flutuante usando menu de imagem, tipo, 32 bits. Isso dobrará o tamanho do arquivo.
Subtraia o fundo suave para aumentar o contraste dos recursos em foco. Processe toda a pilha navegando para processar menu, subtrair o fundo. Ajuste o raio da bola rolando, se necessário.
O raio da bola deve ser significativamente maior do que a maior dimensão das características em foco a serem preservadas. Para definir todos os pixels negativos a zero, adicione cada imagem ao seu valor absoluto. Primeiro, duplicar a pilha usando menu de imagem, duplicar, duplicar pilha.
Em seguida, pegue o valor absoluto dos dados duplicados usando menu de processo, matemática, valor absoluto. Adicione as duas pilhas navegando para processar menu, calculadora de imagem, adicionar. Para reslicenciar a pilha de imagens, use menu de imagem, pilhas, reslice.
Em seguida, selecione o espaçamento de saída 1.0, comece por cima e evite interpolação. O eixo de foco agora é o eixo vertical da pilha. A dimensão Y da pilha relíquia é igual ao número de planos de foco.
Para fazer uma projeção de visualização lateral de parte ou de toda a pilha, navegue até o menu de imagem, pilhas, projeto Z. Defina a fatia de partida e pare a fatia para incluir alguns ou todos os planos de visão lateral. Selecione a intensidade máxima para obter melhores resultados.
Corrija o dimensionamento axial da projeção de visão lateral navegando para o menu de imagem, dimensione. A projeção deve ser corrigida para a pixelação desigual do plano de imagem e o incremento do foco usando o fator escala axial. Defina a escala X para um e defina a escala Y para o fator de escala axial.
Selecione interpolação bicubica. Selecione criar nova janela. Ajuste o brilho e o contraste.
Em seguida, converta para formato de oito bits para exibição. Alternativamente, aplique uma tabela de pesquisa de cores e salve como cor RGB ou oito bits. Usando solventes serialmente miscíveis de aumento do índice de refração, o máximo em clareza pode ser rapidamente estimado.
Isso é refinado pela microscopia de contraste de fase convencional para encontrar o ponto de contraste mínimo. Um biofilme foi trocado em série entre xileno e um conjunto estreito de líquidos de referência nessa faixa. Após cada troca, o mesmo campo foi realocado e visto através de uma taça de cobertura.
Com o aumento do índice, a reversão do contraste é vista pela primeira vez quando n é igual a 1.530 para a parede celular, seguida pelo citoplasma quando n é igual a 1.535. Imagens profundas de biofilmes mutantes e selvagens do tipo C.albicans são mostrados aqui. O biofilme tipo selvagem cresceu para uma espessura de 502 mícrons, como visto na projeção de visão lateral da pilha de imagens confocal de plano 538.
Projeções axiais do ápice à base mostram a variação dos tipos celulares e dos diferentes estratos do biofilme. Este exemplo mostra estrutura característica do tipo selvagem. O biofilme mutante cresceu para uma espessura de 500 mícrons, como visto na projeção de visão lateral da pilha de imagens de 556 aviões.
Este mutante conhecido por sofrer um crescimento intencionalmente na ausência de estressores indutores produziu uma arquitetura dramaticamente diferente. Como visto tanto na visão lateral quanto nas projeções axiais, muitas células ramificantes dão origem a crescimentos radiais. Este é um alto protocolo de imagem profunda de índice de refração.
Idealmente, o índice refrativo da amostra e o índice refrativo do óleo de imersão devem coincidir. É por isso que, neste caso, usamos um objetivo de imersão em óleo. A maioria de nossos estudos tem sido imagens estruturais de biofilmes usando marcadores de parede celular, mas qualquer método de fluorescência que é usado com espécimes fixos deve funcionar incluindo imunofluorescência, fluorescência na hibridização situ e expressão genética repórter.
Este organismo em particular, Candida albicans, é commensal em humanos saudáveis, mas também é um patógeno oportunista que pode causar infecções mucosas ou sistêmicas de levedura. Em algumas instituições, são necessários métodos e protocolos de contenção BSL II. Além disso, os fixadores de formaldeído e glutaraldeído são voláteis e perigosos.
São cancerígenos conhecidos. Invente diluições de fixações em um capô de fumaça. Mantenha os pratos contendo fixativos diluídos cobertos e não coloque recipientes contendo esses fixativos em um armário de biossegurança ou em uma incubadora de cultura celular.
