Este trabalho foi apoiado por um prêmio estratégica do Wellcome Trust para o centro para a imunidade, infecção e evolução (http://ciie.bio.ed.ac.uk; concessão referência n º 095831). PFV foi apoiado por uma bolsa Branco Weiss (https://brancoweissfellowship.org/) e Fellowship de um Chanceler (Faculdade de ciências biológicas, Universidade de Edimburgo); JASJ foi apoiado por uma bolsa de estudo do NERC E3 DTP PhD.

1. manter moscas
<ol><li>Manter as moscas em frascos de plástico de 23 mL contendo 7 mL do meio de Lewis recém-feitos (modificado da referência31; triplo 1L destilada H2O, ágar 6,1 g, 93,6 g de açúcar mascavado, 68g de milho, fermento instantâneo g 18,7, agente anti-fúngico de Tegosept de 15 mL) em incubadoras a 25 ± 1 ° C, em um h:12 12 h luz: escuro ciclo com ~ 60% de umidade. Conecte os frascos com algodão não-absorvente.</li>
	<li>Depois de 14 em 14 dias, transferi adultos de 20 a 30 para um frasco novo de comida, com levedura instantânea, seca, adicionada à superfície, por 2-3 dias permitir que a postura ocorrer. Após este período de tempo, certifique-se de que os ovos são visíveis na superfície do alimento. Remova moscas adultas. Nota: Isso mantém moscas em frascos como única geração, populações de idade correspondente.</li>
	<li>Deixe os ovos para desenvolver. Nota: A 25 ° C, moscas adultas começam a eclose de pupas no dia 11 e continuam nos dias 12 a 14.</li>
</ol>2. prepare moscas Experimental
<ol><li>Recolher os ovos da geração do pai em uma gaiola de coleção de população/embrião num prato de apple-ágar de 75 mL (1 L triplo destilada H2O, ágar de 30g, 33 g de sacarose, 330 mL de sumo de maçã, agente anti-fúngico de 7 mL Tegosept), com um spread de colar de levedura (mistura de fermento seco com água para uma consistência de manteiga de amendoim). Adicione lã de algodão embebido de água para a gaiola para fornecer a umidade. Nota: Para evitar confusão causados por diferenças na densidade larval de criação de efeitos, é importante que moscas experimentais em frascos diferentes são criadas em densidades semelhantes. O passo acima é realizado para evitar a confusão de efeitos.</li>
	<li>Incubar por 24 h a 25 ° C em um 12 h:12 h ciclo de luz: escuro até postura ocorreu. Se houver demasiado poucos ovos após 24 h, fornece um longo período de habituação. Substituir placas de ágar-apple e permitir a postura ocorrer por um mais 24 h.</li>
	<li>Leve pratos ovo-carregado apple-ágar da jaula de população. Remova a pasta de fermento restante e qualquer moscas mortas da superfície do agar.</li>
	<li>Submergir o ágar-ágar em 20 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x e desalojar delicadamente os ovos da apple-agar com um pincel fino. Enquanto suspenso em PBS, transferir os ovos para um tubo de centrífuga de 50 mL e deixar por 5 min para que os ovos afundam até o fundo. Nota: a maioria dos ovos são encontrados na borda externa do ágar.</li>
	<li>Remover cortando o fundo de 4 mm de uma ponta da pipeta filtrada p1000 e usar a ponta da pipeta para desenhar 1 mL de solução, tirada do fundo do tubo de centrífuga de 50 mL. Transferir isso para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e deixe repousar. Nota: Quando a pipetagem ovos, snap-liberando o êmbolo é mais eficiente do que uma versão suave.</li>
	<li>Remova cortando o fundo de 4 mm de uma ponta da pipeta filtrada p20. Definir a pipeta com um volume desejado e tirar do fundo do tubo do microcentrifuge. Nota: Com a prática, um volume de 5 µ l contém cerca de 100 ovos.</li>
	<li>Dispense os ovos coletados sobre os alimentos e deixá-los a desenvolver para a quantidade de tempo necessária.</li>
</ol>3. bacteriana cultura
<ol><li>Para o cultivo de culturas de entomophila p. e p. aeruginosa , inocular 10 mL de caldo de Luria-Bertani (LB) com 100 µ l de um estoque congelado bacteriano a 30 ° C (p. entomophila) e 37 ° C (p. aeruginosa), respectivamente. Agite a 150 rpm, durante a noite. Certifique-se de que a cultura bacteriana atinja a fase de saturação.</li>
	<li>Para garantir as bactérias usadas para inocular as moscas estão na fase exponencial e rapidamente replicando, inocular a cultura durante a noite em uma subcultura de nova, de um volume desejado, na manhã seguinte. Certifique-se de que o pre-inóculo é 10% do volume total da cultura subcultura. Nota: A infecção Oral requer alta. Portanto, é necessário crescer um volume substancial de cultura bacteriana para que suficiente cultura de inoculação pode ser produzida para a dose desejada e tamanho experimental. Calcular quanto subcultura é necessário para produzir as doses infecciosas necessárias usando a equação MsVs = MeuVeu, onde M representa uma cultura de densidade óptica medida em 600 nm (OD600) valor e V representa a sua volume. Subscritos letras referem-se a cultura é usada como uma subcultura (s) ou uma dose infecciosa (i).</li>
	<li>Cresce essa subcultura em um Erlenmeyer de 2 L, em um volume tal que a superfície da subcultura cai (no máximo) logo acima o início declive no balão. Não encha acima esta marca como ele será stunt o crescimento de bactérias.</li>
	<li>Certifique-se de que bactérias dessa subcultura estão em fase de crescimento exponencial medindo-se a cada 30 min de OD. Nota: Isto ocorre após 3-5 h, onde a subcultura atinge uma OD600 entre 0,6-0,8.</li>
	<li>Despeje volumes iguais dessa subcultura em 50 mL de tubos de centrífuga e girar a subcultura a 2.500 x g, durante 15 min a 4 ° C para as bactérias de Pelotas. Uma vez peletizado, remover e em seguida girar o sobrenadante novamente às condições acima para confirmar a remoção da maioria das bactérias. Nota: Uma pastilha de tamanho desprezível (menor que 1 mm de altura) confirma isso.</li>
	<li>Combine as pelotas bacterianas dos tubos separados por re-suspensão-los em 5 mL de subcultura sobrenadante e recombinar destas soluções em um tubo único de 50 mL. Gire esta cultura concentrada a 2.500 x g, durante 15 min a 4 ° C para as bactérias de Pelotas.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet final de bactérias na solução de 5% de sacarose em água. Verifique o OD e ajustar a dose infecciosa desejada (OD600 = 100 para entomophila p.8 e OD600 = 25 para p. aeruginosa16,28), suspendendo novamente as pelotas em 5% solução aquosa de sacarose para o volume necessário. Nota: A quantidade de solução a 5% de sacarose água a ser adicionado pode ser calculada usando a equação na etapa 3.2.1 (MsVs = MeuVeu).</li>
</ol>4. por via oral, infectando moscas
<ol><li>Para garantir a infecção oral, morrer de fome as moscas para 2 – 4 h antes da exposição às bactérias, transferindo as moscas para frascos de ágar padrão (triple 1L destilada H2O ágar de 20 g, 84 g de açúcar mascavado, agente anti-fúngico de Tegosept de 7 mL).</li>
	<li>Prepare frascos de infecção enquanto moscas são estarmos esfomeadas. Fazer um frasco de infecção de Pseudomonas por pipetagem 500 µ l de ágar padrão de açúcar para a tampa de um tubo de amostra de 7 mL e deixe-o secar. Coloque um disco de papel de filtro na tampa e pipetar 100 µ l de cultura bacteriana diretamente sobre o disco de filtro. Para infecções de controle, substitua a cultura bacteriana com o mesmo volume de solução a 5% de sacarose água no filtro de papel.</li>
	<li>Adicionar moscas única para o tubo de amostra e deixar durante 18-24 h.</li>
	<li>Para confirmar a infecção oral, primeiro superfície-esterilize as moscas imediatamente após a exposição bacteriana, colocando-os em 100 µ l de etanol 70% por 20 a 30 s. remover o etanol e adicionar 100 µ l de triplo destilada água para 20-30 s antes de retirar a água. Adicione 100 µ l de PBS 1x e homogeneizar a mosca.</li>
	<li>O homogeneizado de transferência para a linha superior de uma placa de 96 poços e adicione 90 µ l de 1X PBS a cada poço abaixo.</li>
	<li>Serialmente dilua este exemplo para distinguir um valores de intervalo de UFC. Leve 10 µ l do homogeneizado no poço superior e adicione isto ao poço abaixo. Repita essa etapa com o segundo, a transferência de 10 µ l para o terceiro e assim por diante, para tantos diluições em série conforme necessário. Nota: É importante que novas pontas de pipetas são usadas para cada conjunto de diluições.</li>
	<li>As diluições de série em uma placa de ágar LB em gotas de 5 µ l, para garantir que todas as gotas permanecem discretas da placa.</li>
	<li>Incubar as placas de ágar LB durante a noite em 30 ° C e 37 ° C para p. entomophila e p. aeruginosa, respectivamente e contam CFUs visíveis. Nota: Enquanto micróbios do intestino de Drosophila exigem condições distintas de crescimento anaeróbico, meio seletivo, por exemplo Pseudomonas isolamento médio (PIM), pode ser usado para certificar-se que apenas de Pseudomonas CFUs são contados.</li>
	<li>Calcule o número de CFUs por voar pela contagem do número de colônias presentes na diluição serial onde 10 – 60 CFUs são claramente visíveis. Em seguida multiplica pelo fator de diluição presente para calcular o número de bactérias por mosca.</li>
	<li>Realizar análise estatística. Sempre que necessário, transforme os CFUs por mosca a uma distribuição normal. Fazer este registro-transformação. Uma vez transformado, use modelos lineares generalizados (MLG)30,31,32 para testar como grupos de tratamento diferem em CFUs por mosca (usando pacotes de software estatísticos comumente disponível como R33). Nota: O restante homogenate mosca pode ser usado para medir a expressão gênica, através da análise quantitativa de transcrição reversa PCR (RT-qPCR). Corrigir o homogeneizado em 50 µ l de reagente de isolamento de RNA, extrair o RNA e quantificar a concentração de gene imune específico por RT-qPCR (ver , por exemplo, Gupta e Vale16 para um protocolo detalhado). A expressão de transcritos do gene imune específica deve ser normalizada para os níveis de transcrição de um gene de limpeza (ou seja, rp49) e expressa como uma dobra de mudança em relação ao controle de moscas usando o método 2−ΔΔCt 31, 32,33,34.</li>
</ol>5. gravação sobrevivência após infecção
<ol><li>Infectar moscas por via oral conforme descrito na etapa 4.2.</li>
	<li>Transferir os infectados ou controle de moscas de seus frascos de infecção respectivos em norma Lewis frascos e manter em uma incubadora a 25 ° C em um 12 h:12 h claro-escuro do ciclo (ou desejado condições). Espantar moscas até que eles estão mortos.</li>
	<li>Conte o número de moscas vivos ou mortos em cada frasco todos os dias, ou tão frequentemente quanto necessário.</li>
	<li>Transferi as moscas para novos frascos cada 5 dias para evitar as moscas, ficando pressas na comida.</li>
	<li>Apresentar estes dados como curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier (KM) ou média ± SE sobrevivência proporcional parcelas. Para analisar o efeito de diversos fatores e/ou suas respectivas interações com o outro usar um pacote estatístico (por exemplo, o pacote de "sobrevivência" em R33) para executar uma análise de sobrevivência, tais como o modelo de riscos proporcionais de Cox35.</li>
</ol>6. medir a carga bacteriana
<ol><li>No ponto de tempo desejado, transferi uma única mosca infectada para um tubo de microcentrifugadora estéril 1,5 mL.</li>
	<li>Superfície esterilizar as moscas, conforme descrito na etapa 4.4.</li>
	<li>Homogeneizar a mosca e quantificar a carga bacteriana usando o protocolo descrito nos passos 4.5 – 4.10.</li>
</ol>7. Meça o derramamento bacteriana
<ol><li>Medir o derramamento juntamente com a carga interna.</li>
	<li>Após a infecção, transferi única moscas para tubos de microcentrifuga de 1,5 mL contendo ~ 50 µ l de meio de Lewis para 24 h.</li>
	<li>Remover as moscas para a medição de carga interno (consulte a etapa 6) e lavar os tubos com 100 µ l de PBS 1x vortexing pesadamente por 3 s.</li>
	<li>Medir os CFUs em deste lavagem por chapeamento na LB ágar usando o mesmo protocolo, conforme descrito nas etapas 4.6 – 4.8.</li>
	<li>Após a infecção, transferi única moscas para tubos de microcentrifuga de 1,5 mL contendo ~ 50 µ l de meio de Lewis para 24 h.</li>
	<li>Transferir as moscas para novos microcentrifuga tubos contendo ~ 50 µ l de meio de Lewis para uma mais 24 h. lavagem dos tubos contaminados com 100 µ l de PBS 1x vortexing pesadamente por 3 s.</li>
	<li>Medir os CFUs em deste lavagem por chapeamento na LB ágar usando o mesmo protocolo descrito nos passos 4.6 – 4.8.</li>
	<li>Repita os passos 7.2 e 7.3 e registro de mortalidade voar em cada transferência.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoffmann, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Genotype+and+Coinfection+Modify+the+Relationship+of+within+and+between+Host+Transmission.">Host Genotype and Coinfection Modify the Relationship of within and between Host Transmission.</a> Am Nat. 186 (2), 252-263 (2015).</li><li>Fellous, S., Duncan, A. B., Quillery, E., Vale, P. F., Kaltz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+influence+on+disease+spread+following+arrival+of+infected+carriers.">Genetic influence on disease spread following arrival of infected carriers.</a> Ecol Lett. 15 (3), 186-192 (2012).</li></ol>

Apresentamos um protocolo para confiantemente oralmente, infectando d. melanogaster com patógenos bacterianos. Focamos em p. aeruginosa e p. entomophila, mas este protocolo pode ser facilmente adaptado para permitir a infecção de outras espécies bacterianas, por exemplo, Serratia marcescens7. Aspectos-chave deste protocolo irão variar entre espécies bacterianas. Por conseguinte, a dose infecciosa mais eficiente, correspondente de virulência e suscetibilidade de genótipo do hospedeiro devem tudo ser consideradas e idealmente testadas em estudos-piloto. Expondo as moscas para culturas bacterianas de uma gama de densidades ópticas e medir a sua dose infecciosa e sobrevivência é um ponto de partida adequado quando trabalhar com novas espécies bacterianas ou linhas de voar.
Etapas do protocolo como voam fome antes da alimentação e re-suspensão bacterianas pelotas em solução de sacarose 5% são comuns na infecção oral e aumentam a confiabilidade da infecção bacteriana durante a exposição7,8, 9 , 10. no entanto, é importante notar que, durante a exposição, moscas essencialmente vivem sobre uma superfície de cultura bacteriana. No processo de andar sobre esta cultura, bactérias irão tornar-se alojou na superfície da mosca, especialmente a cutícula ou em torno das cerdas24. Estas bactérias epicuticulares, não refletem uma infecção entérica bem sucedida, mas ainda seria detectado pela mosca homogeneização e chapeamento. Para reduzir o potencial de falsos positivos, é essencial a superfície esterilizar moscas através de imersão em etanol a 70% para até 1 min.
Quando considerando taxas derramamento bacterianas, infecção oral é essencial. O número de agentes patogénicos que um host libera no ambiente é muitas vezes difícil de medir e a carga interna é muitas vezes tomada como um proxy para a gravidade da infecção e, consequentemente, transmissão26,27. Medição de carga bacteriana ao lado de derramamento bacteriana permite uma análise da relação entre esses dois componentes importantes da doença de gravidade e propagação38. Uma limitação do método apresentado é que a carga bacteriana interno de moscas de análise requer amostragem destrutiva. Isso torna difícil investigar tendências longitudinais do crescimento do patógeno e desembaraço no mesmo indivíduo. No entanto, é possível superar esta limitação por coortes de amostragem destrutiva de indivíduos em diferentes fases da infecção, sob a suposição de que a carga média micróbio em cada coorte reflete a dinâmica longitudinal do patógeno dentro de qualquer dado individuais. Vertendo a bacteriana não sofre as mesmas limitações, e oferecemos exemplos de como derramamento pode ser quantificada em uma amostra transversal ou longitudinalmente para investigar como derramamento muda dentro de um indivíduo ao longo do tempo.
Muitos traços de hospedeiro e patógeno em conjunto determinam a propensão do indivíduo para transmitir a doença25,26,39. Enquanto o significado desses traços provavelmente varia entre sistemas de patógeno-hospedeiro, vertendo provavelmente é um determinante importante da transmissão fecal-oral. A capacidade de medir o derramamento bacteriana abre a oportunidade de testar esta hipótese. Tendo caracterizado dinâmica hospedeiro-patógeno em um painel desejado de linhas voar, experimentadores poderiam oralmente infectar indivíduos e colocá-los ao lado de hosts não infectados e suscetíveis durante seus períodos infecciosos. Estas moscas 'destinatários' poderiam então ser analisadas para carga bacteriana interno em vários pontos de tempo como uma forma de medir diretamente a transmissão.

Mosca da fruta (também conhecida como a mosca do vinagre), d. melanogaster, tem sido usada extensivamente como um organismo modelo para infecção e imunidade contra uma variedade de patógenos1,2. Este trabalho tem oferecido fundamentais insights sobre as consequências fisiológicas da infecção e também foi pioneiro em desvendar as vias moleculares subjacentes a resposta imune do hospedeiro contra infecções bacterianas, fúngicas e virais de parasitoide. Este conhecimento não é apenas útil para entender a resposta imune inata de insetos e outros invertebrados, mas porque muitos dos mecanismos imunes são evolutivamente conservados entre os insetos e mamíferos, Drosophila também tem estimulado a descoberta dos principais mecanismos imunes em mamíferos, incluindo seres humanos3.
A maioria dos trabalhos sobre Drosophila infecção e imunidade centrou-se em infecções sistêmicas, usando métodos de inoculação que entregam patógenos diretamente no corpo do inseto por picada ou injeção4,5,6. A vantagem destes métodos em permitindo a entrega de uma dose infecciosa controlada é claro e apoiado por um vasto corpo de trabalho sobre infecções sistêmicas. No entanto, muitos patógenos bacterianos naturais de d. melanogaster são adquiridos através de alimentação onde a imunocompetência de intestino desempenha um papel significativo no acolhimento da defesa7,8, de matéria orgânica em decomposição 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. experiências que empregam infecções sistêmicas contornar essas defesas e, portanto, fornecer um quadro completamente diferente do como insetos montagem defesas contra patógenos naturais. Isto é especialmente relevante se o objetivo do trabalho é testar predições sobre a ecologia e evolução da infecção, onde o uso de agentes patogénicos naturais e rotas de infecção são importante16,17. Trabalho recente destacou-se como a rota tomada por patógenos significativamente afeta a doença resultado18,19, provoca distintas vias imune20,21, pode determinar o efeito protetor da Herdado de endossimbiontes16e podem mesmo jogar um papel importante na evolução do anfitrião defesas17.
Outro motivo para empregar orais rotas de infecção é que permite a investigação da variação na transmissão de patógeno medindo derramamento bacteriana durante a excreção fecal após infecção oral22,23, 24. compreender as fontes de heterogeneidade de acolhimento na transmissão da doença é desafiador em populações naturais de25,26, mas componentes de transmissão, tais como patógeno derramamento, sob laboratório controlado de medição condições oferece uma abordagem alternativa útil27. Por alimentação de moscas de bactéria e medição bacteriano derramamento sob uma variedade de contextos de fatores genéticos e ambientais, em condições experimentais controladas, é possível identificar fontes de variação na transmissão entre hospedeiros.
Aqui, descrevemos um protocolo para infectar oralmente d. melanogaster com patógenos bacterianos, e para quantificar o crescimento bacteriano e derramamento que segue (Figura 1). Nós descrevemos este protocolo em duas bactérias Pseudomonas : uma cepa virulenta do patógeno oportunista p. aeruginosa (PA14) e uma menos virulenta do natural voar patógeno p. entomophila. Pseudomonads são bactérias Gram-negativas comuns com uma gama ampla de anfitrião, infectando insetos, nematoides, plantas e animais vertebrados e são encontrados na maioria dos ambientes4,6. Infecção entérica de drosófila por p. aeruginosa e p. entomophila resulta em patologia para epitélios intestinal12,13,14,15, 28. Enquanto focamos estes dois patógenos bacterianos, os métodos descritos aqui podem em princípio ser aplicados a qualquer agente patogénico bacteriano de interesse com pequenas modificações. Após exposição oral, medimos a sobrevivência pós infecção e medir a carga de micróbio dentro moscas individuais e os micróbios viáveis derramado no ambiente, expressado em unidades (CFUs) formadoras. Finalmente, porque o intestino imunocompetência resulta de uma combinação da barreira epitelial e respostas humorais, medimos também a sobrevivência da moscas linhas onde essas defesas são rompidas. Especificamente, Drosocrystallin (Dcy) mutantes foram mostrados anteriormente para ser mais suscetível à infecção bacteriana oral devido a uma matriz de peritrophic empobrecido no intestino29. Também medimos a sobrevivência em um mutante Relish (Rel), que é impedida de produzir peptídeos antimicrobianos contra bactérias Gram-negativas através do IMD caminho30.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vials</td>
			<td>Sarstedt Ltd.</td>
			<td>58.490</td>
			<td>Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7002</td>
			<td>Agar, ash 2.0-4.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown sugar</td>
			<td>Bidvest</td>
			<td>66032</td>
			<td>Light brown soft sugar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize</td>
			<td>Dove&#39;s Farm</td>
			<td></td>
			<td>Organic maize flour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermipan yeast</td>
			<td>Bidvest</td>
			<td>96360</td>
			<td>Dry, instant yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-4-hydroxybenzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5501</td>
			<td>&#62;=99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td>Sucrose BioUltra, for molecular biology, &#62;=99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>15788517</td>
			<td>X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (50ml)</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>210261</td>
			<td>Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube (0.5ml)</td>
			<td>Sarstedt Ltd.</td>
			<td>72.699</td>
			<td>Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube (1.5ml)</td>
			<td>Sarstedt Ltd.</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td>Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR International Ltd.</td>
			<td>20821.33</td>
			<td>ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE - Analytical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Conical Flask</td>
			<td>VWR International Ltd.</td>
			<td>214-0038</td>
			<td>Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter paper</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>1001-020</td>
			<td>Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou sample container</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>129A</td>
			<td>7ml polystyrene sample container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17208</td>
			<td>Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>BP1426</td>
			<td>Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Embryo Collection Cages</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td>
			<td>59-101</td>
			<td>Flystuff- fits 100mm petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td>
			<td>353072</td>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>12649595</td>
			<td>Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td>
			<td>CHE2068</td>
			<td>Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool- non absorbent</td>
			<td>Cowens Ltd</td>
			<td>ABL</td>
			<td>Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool- absorbent</td>
			<td>Cowens Ltd</td>
			<td>ABS</td>
			<td>BP small quantity 20 bags x 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td></td>
			<td>Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital incubator</td>
			<td>Gallenkamp</td>
			<td>INR-200-010V</td>
			<td>220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70&#186;C. Shaking frequency: 0...400 rpm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbance Microplate Reader</td>
			<td>Biotek Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td>ELx808&#8482; Absorbance Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen 5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>Biotek Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td>For Absorbance Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392304</td>
			<td>Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Step One Plus Real Time qPCR System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Step One Software 2.3</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Statistical Software</td>
			<td>https://cran.r-project.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>741015</td>
			<td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>741065</td>
			<td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>741045</td>
			<td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>774288</td>
			<td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>739288</td>
			<td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>740288</td>
			<td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral bacterial infection and shedding in drosophila melanogaster

Mosca da fruta Drosophila melanogaster é um dos melhores sistemas de modelo desenvolvido de infecção e imunidade inata. Enquanto a maior parte do trabalho centrou-se em infecções sistêmicas, tem havido um aumento de interesse nos mecanismos de imunocompetência do intestino aos agentes patogénicos, que exigem métodos oralmente infectar moscas. Aqui nós apresentamos um protocolo para expor oralmente moscas individuais para um patógeno oportunista de bactérias (Pseudomonas aeruginosa) e um patógeno bacteriano natural de d. melanogaster (Pseudomonas entomophila). O objetivo do presente protocolo é fornecer um método robusto para expor moscas masculinas e femininas para esses patógenos. Nós fornecemos resultados representativos mostrando fenótipos de sobrevivência e cargas de micróbio bacteriano derramamento, que é relevante para o estudo da heterogeneidade na transmissão do patógeno. Finalmente, podemos confirmar que os mutantes Dcy (falta a matriz peritrophic protetora no epitélio do intestino) e Relish mutantes (falta um caminho de deficiência imunológica funcional (IMD)), mostra o aumento da susceptibilidade à infecção bacteriana oral. Este protocolo, portanto, descreve um método robusto para infectar moscas usando via oral, de infecção, que pode ser estendida para o estudo das fontes de fatores genéticos e ambientais variedade de variação nos resultados de infecção do intestino e transmissão bacteriana.

Aqui, apresentamos resultados ilustrativos de experimentos onde d. melanogaster oralmente foi infectado com p. aeruginosa ou p. entomophila. A Figura 2 demonstra a infecção oral bem sucedida de moscas após um período de exposição de 12h ou 24h para culturas bacterianas de OD600 = 25 e 100 para p. aeruginosa (Figura 2A) e p. entomophila (Figura 2B C), respectivamente. Figura 2B ilustra a importância do uso de uma cultura mais concentrada de p. entomophila, mostrado pelo aumento na carga bacteriana quando moscas são expostas a culturas bacterianas de maior densidade óptica. Moscas de Oregon R (OreR) masculinas e femininas claro infecção p. aeruginosa na mesma taxa (Figura 3) e lançar o mesmo número de p. aeruginosa CFUs (Figura 4A). Quando infectados com p. entomophila , no entanto, moscas de OreR masculinas e femininas diferem no número de galpão de bactérias, de forma que muda ao longo do tempo (Figura 4B). Machos e fêmeas morrem de p. aeruginosa (Figura 5A) e p. entomophila (Figura 5B) em taxas diferentes. Vemos também que Dcy mutantes (que faltam a matriz peritrophic protetora no epitélio do intestino) e Relish mutantes (que não possuem uma linha imune funcional do IMD), mostram a diminuição da sobrevivência após p. entomophila e de p. aeruginosa infecção oral (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig1.jpg"> Figura 1: Visão geral esquemática dos protocolos para a medição de sobrevivência, derramamento e interna carga bacteriana após infecção oral em Drosophila melanogaster. Uma ilustração de 3 experiências potenciais após a infecção oral de d. melanogaster. Medir a 'sobrevivência' transferência única moscas para frascos e registrando sua expectativa de vida infectada. Medir o 'desprendimento' Transferindo única moscas para tubos de microcentrifuga 1,5 mL com 50 µ l de meio de Lewis na tampa. Após 24 h no tubo, remova a mosca e vortex o tubo com 100 µ l de 1X PBS. Remover e esta solução na LB ágar para calcular o derramamento bacteriana da placa. Medir o derramamento na mosca da mesma no sentido longitudinal, transferência de moscas para frescos tubos com meio de Lewis no tampão após 24 h e lavando e chapeamento do tubo agora contaminado. Carga de uma mosca' interno' pode ser medida por tomar um infectado uma mosca, superfície esterilização-e homogeneizando-lo antes de finalmente chapeamento do homogeneizado em ágar LB. Isto pode ser executado após o derramamento foi medido para calcular como a 'carga interno' e correlacionar derramamento. A ilustração mosca usada nesta figura foi originalmente desenhada por B. Nuhanen36. Os autores têm modificado para acompanhar a curva de exemplo Kaplan-Meier, que provém do Wikimedia Commons37. Todas as outras ilustrações são originais. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig2.jpg"> Figura 2: dose infecciosa de bactérias após a infecção oral. (A) dose infecciosa de masculino e feminino Oregon-R voa após exposição a uma cultura de p. aeruginosa (OD600 = 25) para 12 h. A média e SE foram calculados de 3 machos e 3 fêmeas. (B) a dose infecciosa de outcrossed fêmeas tipo selvagem, após a exposição a uma das quatro culturas p. entomophila (OD600 = 25, 75, 50 e 100) ou controlar a solução de sacarose 5% por 24 h. A diferença estatística de (F3,76 = 18.567, p < 0,001) na dose infecciosa entre tratamentos de exposição é indicado por letras diferentes acima de bares. Os meios foram calculados a partir 5 moscas para o OD600 = 0 a dose e 18-20, para todas as outras doses. (C) a dose infecciosa de masculino e feminino Oregon-R voa após exposição à cultura de p. entomophila (OD600 = 100) por 24 h. A média e SE foram calculados de 20 machos e 20 fêmeas. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig3.jpg"> Figura 3: Carga de interno p. aeruginosa em moscas após infecção oral. Média ± SE carga bacteriana de masculino e feminino Oregon-R voa após infecção oral com p. aeruginosa (OD600 = 25) até pós-infecção 168 h. A média e SE de cada ponto de tempo são calculados a partir de 3 indivíduos. Carga bacteriana interno de uma mosca muda significativamente ao longo do tempo (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig4.jpg"> Figura 4: bacteriana derramamento após infecção oral. (A) p. aeruginosa derramadas por moscas mesmas usadas na Figura 3, até a pós-infecção 120 h. A média e SE foram calculados de 3 machos e 3 fêmeas. (B) entomophila p. derramado por masculino e feminino Oregon-R voa após infecção oral com p. entomophila (OD600 = 100) até pós-infecção 120 h. A média e SE foram calculados de 34 homens e 38 mulheres. Para p. aeruginosa e p. entomophila, o número de galpão de CFUs por uma mosca muda significativamente ao longo do tempo (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig5.jpg"> Figura 5: sobrevivência das moscas após infecção bacteriana oral. Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier (KM) de (A) Oregon-R macho e fêmea voa após infecção oral com p. aeruginosa (OD600 = 25) ou solução de sacarose 5% de controle. A curva de sobrevivência KM foi calculada a partir de 4 frascos de 20 moscas por grupo de tratamento. (B) OreR macho e fêmea voa após infecção oral com p. entomophila (OD600 = 100). A curva de sobrevivência KM foi calculada a partir de 4 único controle de moscas e 34 moscas infectadas para machos e fêmeas. (C) imunes mutantes: Dcy (Drosocrystallin-peritrophic mutante de matriz) e Rel (mutante Relish-IMD), expostos a p. entomophila (Pe), p. aeruginosa (Pa14) ou uma solução de sacarose 5% controle. Todos os grupos infectados morrem significativamente mais rápido do que o controle de moscas (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Este protocolo descreve métodos para oralmente expor e infectar a mosca de fruta Drosophila melanogaster com patógenos bacterianos e para medir o número de bactérias infecciosas galpão após infecção do intestino. Ainda mais, descrevemos o efeito de mutantes imunes na mosca sobrevivência após infecção bacteriana oral.

Infecção bacteriana e oral Shedding em Drosophila melanogaster.

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

oral-bacterial-infection-and-shedding-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

11.5K visualizações.  University of Edinburgh. Este protocolo descreve métodos para oralmente expor e infectar a mosca de fruta Drosophila melanogaster com patógenos bacterianos e para medir o número de bactérias infecciosas galpão após infecção do intestino. Ainda mais, descrevemos o efeito de mutantes imunes na mosca sobrevivência após infecção bacteriana oral.

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissecção do CNS Larval em Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biologia

Wolbachia Bacterial Infection in Drosophila

My name is Voia Friedman. I am associate researcher at Princeton University. And today I'm going to tell you about a few protocols that I developed to trans infect, to I initially to isolate, to go back from the heli of infected flies, and later on help to inject the heli feed to unaffected flights.So basically, this is a very simple protocol to isolate him oly for basics. And you will use this device from, from mepo that contains a filter that goes on top of an E.So you basically needs to put you, we start from around a hundred flies. You anize the flies, you put them into the filter device, you can just use a funnel and that will add our other fit very easily on this device and wash it with 70%ethanol.You just take the, take the future away, you can throw away the ethanol, and then after three times your last wash you do with molecule water because you don't want have the bacteria from the, with traces of ethanol. Well, and then you just go to a new weapon door and, and then you spin down on a micro, real micro for two minutes And later on how you can inject that. He only feed do unaffected flies.So basically take a double stick tape and usually these double stick tapes have two side, one side is a sticker than the other. So leave the sticker side up because that's the side that you're gonna glue that flies on top of it. And basically you'll, the gas apparatus, if you have this light on top of it, you'll be no gas flow and the flies you wake up if they're on top of the slide.So you can just direct the flow, making a little hood, a little chamber using tape. Then you direct the gas over the flies. So then you put your, this light here with the tape and you, you have your flies.Stick the flies on the top of the tape, all of them the same orientation, and put their head towards the direction that you'll be bringing the needle from. Because then you can just over the, the wing, you make sure since they fly, you don't want to fly. If they woke up during the procedure, don't want them to go away.So make sure that you take a little tip and pressure against the, the, the wings of the fly on the tail. And it's okay if they wings get damaged. And when you get rid, when you take the flies up the injection, most likely they'll lose their wings anyway, so they'll survive.That can, that can be useful because you're not gonna lose the flies that, so he puts a mineral oil on the micrometer for the back of the needle, then the needle injection polar, and then the, you can just adjust the pressure to bring the material up to the tip of the needle. I, I did to inject Somewhere between 10 to 15 nanoliters, but as, as long, as long as I'm consistents. Okay, so one important detail there is a cushion of this experiment is that the, the fly, once the apply is being injected when you saw the needle needs to come as far as you can through the upper part of the abdomen.Because here, basically when the needle penetrates, you have a, a, a, a, a bigger space to go up and down. And basically if it's close, closer to the cuticle, it's less likely they're gonna penetrate vital organs in the flight. You, it is very likely unlikely that you're gonna punch a hole in your gut, for instance, if that is gonna kill the flight that you are performing the surgery.My name is Voia Friedman. I am associate researcher at Princeton University in the lab of Eric Hels. And today I would like to tell you about this protocol that you just saw, the demonstration.So this protocol was done because we wanted to prove that UBA is capable of crossing tissues. So UBA is one of the most successful intracellular paras on the face of the earth. Infects from 20 to 70%of insects and many particles.And also is, is very important in terms of human diseases because also infect nematodes that transmit diseases like river blindness or s and ssis. And so, and CCA is our obligatory endo in, in these worms. And there's a great, a very big interest in using CCA also as means to control parasitic diseases transmitter by mosquito and Danny and this and by mosquito such as malaria and dengue.So this, this, this protocol basically was developed to show that once CCA inside the abdominal cavity of a fly, they can cross tissues and reach the germ. So basically what you can see here is the oph of the drosophila ovary and go back once present in the he leaf it, it can cross a pink peronial. She that is around the ovary.And then they cross a muscle layer. And actually one of the first places that they, they go inside the ovary is the somatic stem cell image. And then they can reach the germline.And this bacteria is transmitted the same way that mitochondria is transmitted is through, is through the mother transmitted, through the mother cyop plants present in the egg. So of course they needs to be present into the germline. So that's why this protocol is developed.And this protocol is, can be very useful to basically traditionally the way that people would try to trans infect wbaa basically take wbaa and introduce a new insect species. It would be through doing micro injections into the, into the embryo. But those are much more complicated.And basically here we are just taking advantage of the o biology since they are capable to cross tissues and moving into the stem cell tissues from, they can pass to the, through to the germline. So that's make easier taking UBA from certain, from, from certain species of insects that are infected and they can be transmitted to uninfected species. Prob I think it's the injection itself.Basically you need to be careful to mobilize the fly as well as you can. We are using double sided stick tape and you need to penetrate the needle basically as close to the, as parallel to the fly as possible so you don't go to deep. And it's less likely that we're gonna kill the fly after they're performing the surgery.

Wolbachia em Drosophila infecção bacteriana

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be infected with polyhedra by droplet feeding and diet plug-based bioassays. This accompanying Springer Protocols section provides an overview of the baculovirus lifecycle and use of baculoviruses as insecticidal agents, including discussion of the pros and cons for use of baculoviruses as insecticides, and progress made in genetic enhancement of baculoviruses for improved insecticidal efficacy.

In this video, we demonstrate oral infection techniques of lepidopteran larvae with baculovirus in order to determine insecticidal efficiency.

Protocolos para a Infecção Oral de lagartas de Lepidoptera com Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissecção da Oenocytes de Adultos Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento de Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Medição do Tempo de vida em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Dissecção e Imunocoloração do Imaginário discos de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Manutenção de um<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Gaiola População

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Infecção bacteriana e oral Shedding em Drosophila melanogaster.

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Dissecção do CNS Larval em Drosophila melanogaster

Wolbachia em Drosophila infecção bacteriana

Protocolos para a Infecção Oral de lagartas de Lepidoptera com Baculovirus

Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Dissecção da Oenocytes de Adultos Drosophila melanogaster

Isolamento de Drosophila melanogaster Testes

Medição do Tempo de vida em

Dissecção e Imunocoloração do Imaginário discos de

Manutenção de um