Questo lavoro è stato supportato da un premio strategico dal Wellcome Trust per il centro per l'immunità, infezione ed evoluzione (http://ciie.bio.ed.ac.uk; grant riferimento n ° 095831). PFV era sostenuto da una borsa di studio di Branco Weiss (https://brancoweissfellowship.org/) e Fellowship di un cancelliere (scuola di scienze biologiche, Università di Edimburgo); JASJ è stato sostenuto da un NERC E3 DTP PhD studentship.

1. mantenere le mosche
<ol><li>Mantenere le mosche in fiale di plastica 23 mL contenente 7 mL di mezzo di Lewis appena fatta (modificato dal riferimento31; Tripla 1 L acqua distillata H2O, 6,1 g di agar, 93,6 g zucchero di canna, 68 g di mais, lievito istantaneo 18,7 g, agente anti-fungine di 15 mL Tegosept) in incubatrice a 25 ± 1 ° C, in un h:12 12 h chiaro: scuro ciclo con ~ 60% di umidità. Collegare le fiale con non-assorbente di cotone idrofilo.</li>
	<li>Dopo ogni 14 giorni, trasferimento 20 – 30 adulti ad un nuovo flacone di cibo, con lievito istantaneo, asciutto, aggiunto alla superficie, per 2 – 3 giorni per consentire la deposizione delle uova per verificarsi. Dopo questo periodo di tempo, garantire che le uova sono visibili sulla superficie del cibo. Rimuovere le mosche adulte. Nota: In questo modo mosche nelle fiale come singola generazione, popolazioni di pari età.</li>
	<li>Lasciare le uova a sviluppare. Nota: A 25 ° C, mosche adulte iniziano a eclose da pupe il giorno 11 e continuano nei giorni 12 – 14.</li>
</ol>2. preparare mosche sperimentale
<ol><li>Raccogliere le uova della generazione dei genitori in una gabbia di popolazione/embrione insieme su una piastra di apple-agar 75 mL (1 L triplo distillata H2O, 30 g di agar, 33 g di saccarosio, 330 mL di succo di mela, agente anti-fungine di 7 mL Tegosept) con uno spread di pasta di lievito (lievito secco mix con acqua per ottenere una consistenza simile a burro di arachidi). Aggiungere ovatta impregnati d'acqua alla gabbia per fornire l'umidità. Nota: Per evitare di confondere gli effetti causati da differenze di densità di allevamento larvale, è importante che mosche sperimentale in diversi flaconcini sono allevati in densità simile. Il passo precedente viene eseguito per evitare di confondere gli effetti.</li>
	<li>Incubare per 24 h a 25 ° C in un h 12 h:12 ciclo di luce: buio fino alla deposizione delle uova si è verificato. Se ci sono troppo poche uova dopo 24 h, forniscono un periodo più lungo di assuefazione. Sostituire le piastre di agar a apple e consentire la deposizione delle uova per verificarsi per un ulteriore 24 h.</li>
	<li>Prendere i piatti carichi di uovo apple-agar dalla gabbia della popolazione. Rimuovere la restante pasta di lievito e qualsiasi mosche morte dalla superficie dell'agar.</li>
	<li>Immergere l'agar in 20 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x e staccare delicatamente le uova da apple-agar con un pennello fine. Mentre sospeso in PBS, trasferire le uova a un tubo di centrifuga da 50 mL e lasciare per 5 minuti in modo che depositano le uova sul fondo. Nota: La maggior parte delle uova si trovano sul bordo esterno dell'agar.</li>
	<li>Rimuovere tagliando il fondo 4 mm di un puntale filtrato p1000 e utilizzare la punta della pipetta per disegnare 1 mL di soluzione, prelevati dal fondo della provetta centrifugo 50ml. Questo trasferimento a un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL e permettono di riposare. Nota: Quando si pipetta uova, snap-liberare lo stantuffo è più efficiente di una versione dolce.</li>
	<li>Rimuovere tagliando il fondo 4 mm di un puntale filtrato p20. Impostare la pipetta un volume desiderato e disegnare dalla parte inferiore del tubo del microcentrifuge. Nota: Con la pratica, un volume di 5 µ l contiene circa 100 uova.</li>
	<li>Versare le uova raccolte sul cibo e lasciare loro di sviluppare per la quantità di tempo necessaria.</li>
</ol>3. coltura
<ol><li>Per crescere culture p. entomophila e p. aeruginosa , inoculare 10 mL di brodo di Luria-Bertani (LB) con 100 µ l di azione batterica congelate a 30 ° C (p. entomophila) e 37 ° C (p. aeruginosa), rispettivamente. Agitare a 150 giri/min durante la notte. Assicurare che la coltura batterica raggiunge la fase di saturazione.</li>
	<li>Affinché i batteri usati per vaccinare le mosche sono in fase esponenziale e rapidamente la replica, inoculare la cultura durante la notte in una nuova sottocultura, di un volume desiderato, la mattina seguente. Assicurarsi che pre-l'inoculo 10% del volume totale della cultura sottocultura. Nota: Infezione orale richiede alta. Pertanto è necessario crescere un cospicuo volume di coltura batterica, in modo che sufficiente cultura di inoculazione può essere prodotto per la dose desiderata e la dimensione sperimentale. Calcolare quanta sottocultura è necessaria per produrre dosi infettive richieste utilizzando l'equazione MsVs = MioVho, dove M rappresenta una cultura di densità ottica misurata a 600 nm (OD600) valore e V rappresenta la volume. Lettere in pedice si riferiscono se la cultura è usata come una sottocultura (s) o una dose infettiva (i).</li>
	<li>Crescere questa sottocultura in una beuta da 2 L in un volume tale che la superficie di sottocultura cade (al massimo) appena sopra l'inizio della pendenza di pallone. Non riempire oltre questo come esso sarà acrobazia la crescita dei batteri.</li>
	<li>Garantire che i batteri in questa sottocultura sono in fase di crescita esponenziale misurando il OD ogni 30 min. Nota: Ciò si verifica dopo 3 – 5 h, dove la sottocultura raggiunge un OD600 tra 0,6-0,8.</li>
	<li>Versare volumi uguali di questa sottocultura attraverso 50 mL provette da centrifuga e girare la sottocultura a 2.500 x g per 15 min a 4 ° C per appallottolare i batteri. Una volta pellettati, rimuovere e poi girare il surnatante nuovamente alle condizioni di cui sopra per confermare la rimozione della maggior parte dei batteri. Nota: Un pellet di dimensione trascurabile (inferiore a 1 mm in altezza) lo conferma.</li>
	<li>Combinare i pellet batterici dei tubi separati da ri-sospendendoli in 5 mL di surnatante sottocultura e ricombinando queste soluzioni in un tubo singolo 50 mL. Girare questa cultura concentrata a 2.500 x g per 15 min a 4 ° C per appallottolare i batteri.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet finale batteri in soluzione di acqua di saccarosio di 5%. Controllare il diametro esterno e regolare per la dose infettiva desiderata (OD600 = 100 per p. entomophila8 e OD600 = 25 per p. aeruginosa16,28), ri-sospendendo il pellet in 5% soluzione acquosa di saccarosio al volume richiesto. Nota: La quantità di soluzione di acqua di saccarosio di 5% da aggiungere può essere calcolata utilizzando l'equazione nel passaggio 3.2.1 (MsVs = MioVho).</li>
</ol>4. oralmente infettare mosche
<ol><li>Per garantire l'infezione orale, morire di fame le mosche per 2 – 4 h prima dell'esposizione ai batteri trasferendo le mosche per flaconi standard agar (Tripla 1 L acqua distillata H2O, 20 g di agar, 84 g zucchero di canna, 7ml Tegosept agente anti-fungine).</li>
	<li>Preparare i flaconcini di infezione mentre mosche sono essere affamati. Trasformare il coperchio di una provetta 7 mL una fiala di infezione di Pseudomonas di pipettaggio 500 µ l di agar standard zucchero e lasciarlo asciugare. Collocare un disco di carta da filtro nel coperchio e pipettare 100 µ l di coltura batterica direttamente sul disco filtro. Per le infezioni di controllo, è necessario sostituire la coltura batterica con lo stesso volume di soluzione di acqua 5% saccarosio su carta da filtro.</li>
	<li>Aggiungere mosche singole provetta del campione e lasciare per 18 – 24 h.</li>
	<li>Per confermare l'infezione orale, prima superficie-sterilizzare le mosche immediatamente dopo l'esposizione batterica, ponendoli in 100 µ l di etanolo al 70% per 20 – 30 s. rimuovere l'etanolo e aggiungere 100 µ l di triple distillata acqua per 20 – 30 secondi prima di rimuovere l'acqua. Aggiungere 100 µ l di PBS 1X e omogeneizzare al volo.</li>
	<li>Trasferire l'omogeneizzato alla riga superiore di una piastra a 96 pozzetti e aggiungere 90 µ l di 1X PBS ogni ben di sotto.</li>
	<li>Diluire in serie questo esempio per distinguere un valori di intervallo di CFU. Prendere 10 µ l di omogenato nel pozzo superiore e aggiungere questo ben di sotto. Ripetere questo passaggio con il secondo bene, trasferire 10 µ l per il terzo e così via, per diluizioni seriali come molti come richiesto. Nota: È importante che i nuovi puntali vengono utilizzati per ogni serie di diluizioni.</li>
	<li>Piastra le diluizioni seriali su una piastra di agar nutriente LB in 5 µ l gocce, affinché che tutte le goccioline rimangono discrete.</li>
	<li>Incubare le piastre di Agar LB durante la notte a 30 ° C e 37 ° C per p. entomophila e p. aeruginosa, rispettivamente e contare CFUs visibile. Nota: Mentre microbi dell'intestino della drosofila richiedono condizioni di crescita anaerobica distinti, terreno selettivo, ad esempio Pseudomonas isolamento medio (PIM), può essere utilizzato per assicurarsi che solo Pseudomonas CFUs sono contati.</li>
	<li>Calcolare il numero di CFU per volare contando il numero di colonie presenti alla diluizione seriale dove 10 – 60 CFUs sono chiaramente visibili. Quindi moltiplicare per il fattore di diluizione presente per calcolare il numero di batteri per volare.</li>
	<li>Effettuare analisi statistiche. Ove necessario, trasformare il CFUs per volare su una distribuzione normale. Fare questo registro-trasformazione. Una volta trasformato, è possibile utilizzare modelli lineari generalizzati (GLMs)30,31,32 per verificare come i gruppi di trattamento differiscono in CFUs al volo (utilizzando pacchetti comunemente disponibili software statistici come R33). Nota: Il restante omogeneato Vola può essere utilizzato per misurare l'espressione genica attraverso l'analisi di PCR (RT-qPCR) trascrizione d'inversione quantitativa. Difficoltà l'omogeneizzato in 50 µ l di reagente di isolamento del RNA, estrarre RNA e quantificare i titoli specifici geni immuni da RT-qPCR (Vedi ad es., Gupta e Vale16 per un protocollo dettagliato). L'espressione delle trascrizioni del gene immune specifico dovrebbe essere normalizzato per i livelli di trascrizione di un gene housekeeping (cioè, rp49) ed espresso come una piega cambia rispetto al controllo mosche utilizzando il metodo 2−ΔΔCt 31, 32,33,34.</li>
</ol>5. registrazione sopravvivenza dopo l'infezione
<ol><li>Infettare mosche oralmente come descritto al punto 4.2.</li>
	<li>Trasferire gli infetti o controllo mosche da loro fiale rispettivi infezione in standard Lewis fiale e mantenere in un incubatore a 25 ° C in un h 12 h:12 chiaro-scuro del ciclo (o desiderato condizioni). Tenere mosche finché siano morti.</li>
	<li>Contare il numero di mosche vivi o morti in ogni fiala ogni giorno, o come spesso come richiesto.</li>
	<li>Trasferire le mosche a new Fiale ogni 5 giorni per evitare le mosche conficcate nel cibo.</li>
	<li>Media ± SE sopravvivenza proporzionale plottaggi o presentare questi dati come curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier (KM). Per analizzare l'effetto di diversi fattori e/o i loro rispettivi interazioni uno con l'altro utilizzare un pacchetto statistico (ad esempio, il pacchetto "sopravvivenza" in R33) per eseguire un'analisi di sopravvivenza come il rischi proporzionali di Cox modello35.</li>
</ol>6. misurazione della carica batterica
<ol><li>Al punto di tempo desiderato, è possibile trasferire una singola Mosca infettata ad un tubo del microcentrifuge sterili da 1,5 mL.</li>
	<li>Superficie sterilizzare le mosche come descritto al punto 4.4.</li>
	<li>Omogeneizzare al volo e quantificare la carica batterica utilizzando il protocollo descritto nei passaggi 4.5 – 4,10.</li>
</ol>7. misurare spargimento batterico
<ol><li>Misurare lo spargimento a fianco del carico interno.</li>
	<li>Dopo l'infezione, trasferimento singoli mosche per microcentrifuga da 1,5 mL contenente ~ 50 µ l di terreno di Lewis per 24 h.</li>
	<li>Rimuovere le mosche per la misura di carico interno (Vedi punto 6) e lavare le provette con 100 µ l di PBS 1X nel Vortex pesantemente per 3 s.</li>
	<li>Misurare il CFUs in questo lavaggio di placcatura su agar nutriente LB usando lo stesso protocollo, come descritto nei passaggi 4.6 – 4.8.</li>
	<li>Dopo l'infezione, trasferimento singoli mosche per microcentrifuga da 1,5 mL contenente ~ 50 µ l di terreno di Lewis per 24 h.</li>
	<li>Trasferire le mosche in nuove provette microcentrifuga contenente ~ 50 µ l di terreno di Lewis per un ulteriore 24 h. lavare le provette contaminate con 100 µ l di PBS 1X nel Vortex pesantemente per 3 s.</li>
	<li>Misurare il CFUs in questo lavaggio di placcatura su agar nutriente LB usando lo stesso protocollo descritto nei passaggi 4.6 – 4.8.</li>
	<li>Ripetere i punti 7.2 e 7.3 e registrare la mortalità vola ogni trasferimento.</li>
</ol>

<ol>
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Vi presentiamo un protocollo per infettare in modo affidabile oralmente d. melanogaster con agenti patogeni batterici. Ci concentriamo su p. aeruginosa e p. entomophila, ma questo protocollo può essere facilmente adattato per consentire l'infezione di altre specie batteriche, per esempio, i marcescens del Serratia7. Gli aspetti chiave del presente protocollo varierà tra specie batteriche. Conseguenza, la dose infettiva più efficiente, virulenza corrispondente e suscettibilità genotipo dell'ospite dovrebbero tutti essere considerati e idealmente testati in studi pilota. Esponendo le mosche a colture batteriche di una gamma di densità ottica e misura loro dose infettiva e la sopravvivenza è un punto di partenza appropriato quando si lavora con nuove specie batteriche o fili di Mosca.
Procedura di protocollo come vola fame prima dell'alimentazione e pellet ri-sospensione batterica in soluzione di 5% di saccarosio sono comuni nell'infezione orale e aumentare l'affidabilità dell'infezione batterica durante l'esposizione7,8, 9 , 10. Tuttavia, è importante notare che durante l'esposizione, mosche vivono essenzialmente su una superficie di coltura batterica. Nel processo di camminare su questa cultura, batteri saranno diventato depositati sulla superficie della Mosca, soprattutto sulla cuticola o intorno le setole24. Questi batteri epicuticolari, non riflettono un infezione enterica successo ma sarebbe ancora rilevato dall'omogeneizzazione volare e placcatura. Per ridurre la possibilità di falsi positivi, è essenziale alla superficie sterilizzare mosche attraverso immersione in etanolo al 70% per fino a 1 min.
Quando considerando tassi di spargimento batterici, infezione orale è essenziale. Il numero di agenti patogeni che un host rilascia nell'ambiente è spesso difficile da misurare e il carico interno è preso spesso come un proxy per la severità dell'infezione e, pertanto, trasmissione26,27. Misurazione della carica batterica al fianco di spargimento batterico permette un esame del rapporto tra queste due componenti importanti della malattia gravità e diffusione38. Una limitazione del metodo presentato è che diluire la carica batterica interna di mosche richiede campionamento distruttivo. Questo rende difficile indagare la longitudinale tendenze di sviluppo del patogeno e sdoganamento all'interno dell'individuo stesso. Tuttavia, è possibile superare questa limitazione di coorti di campionamento in maniera distruttiva degli individui nelle diverse fasi dell'infezione, sotto l'ipotesi che il carico medio microbo in ogni gruppo riflette le dinamiche di agente patogeno longitudinale all'interno di qualsiasi dato individuali. Spargimento batterico non soffre le stesse limitazioni, e offriamo esempi di come lo spargimento può essere quantificato in un campione rappresentativo, o longitudinalmente per indagare come spargimento cambia all'interno di un individuo nel tempo.
Molti tratti di ospite e patogeno determinano congiuntamente la propensione di un individuo per trasmettere la malattia25,26,39. Mentre il significato di questi tratti probabili varia tra i sistemi ospite-patogeno, spargimento è probabilmente un elemento determinante della trasmissione fecale-orale. La capacità di misurare lo spargimento batterico si apre la possibilità di testare questa ipotesi. Avendo caratterizzato dinamiche di ospite-patogeno in un pannello desiderato di volare linee, sperimentatori potrebbero oralmente infettare gli individui e metterli insieme a padroni di casa non infetti, suscettibile durante i loro periodi infettivi. Queste mosche 'destinatari' potrebbero quindi essere analizzate per interno carico batterico a vari intervalli di tempo come un modo di misurare direttamente la trasmissione.

La Mosca della frutta (anche conosciuto come il fly di aceto), d. melanogaster, è stato ampiamente utilizzata come organismo modello per l'infezione e immunità contro una varietà di agenti patogeni1,2. Questo lavoro ha offerto intuizioni fondamentali le conseguenze fisiologiche di infezione e fu anche pioniere nel dipanare i meccanismi molecolari sottostanti la risposta immunitaria contro le infezioni batteriche, fungine e virali parassitoide. Questa conoscenza non è solo utile per capire la risposta immunitaria innata di insetti e altri invertebrati, ma perché molti dei meccanismi immuni sono evolutivamente conservate tra insetti e mammiferi, Drosophila ha anche stimolato la scoperta dei principali meccanismi immuni nei mammiferi, compreso gli esseri umani3.
Maggior parte del lavoro su Drosophila infezione e immunità ha incentrato sulle infezioni sistemiche, utilizzando metodi di inoculazione che consegno patogeni direttamente nel corpo dell'insetto di pizzicore o iniezione4,5,6. Il vantaggio di questi metodi nel permettere la consegna di una dose infettiva controllata è chiaro e supportato da un grande corpo di lavoro su infezioni sistemiche. Tuttavia, molti agenti patogeni batterici naturali di d. melanogaster sono stati acquisiti tramite alimentazione sulla decomposizione di materia organica dove l'immunocompetenza intestino svolge un ruolo significativo in host difesa7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. esperimenti che impiegano infezioni sistemiche ignorare queste difese e, pertanto, fornire un quadro del tutto diverso di come insetti montare le difese contro gli agenti patogeni naturali. Questo è particolarmente rilevante se lo scopo del lavoro è di testare le previsioni sull'ecologia e l'evoluzione dell'infezione, dove l'uso di agenti patogeni naturali e itinerari dell'infezione sono importante16,17. Lavoro recente ha evidenziato come il percorso intrapreso dai patogeni significativamente influenza malattia risultato18,19, suscita vie immuni distinte20,21, può determinare l'effetto protettivo di ereditato endosimbionti16e potrebbe anche giocare un ruolo importante nell'evoluzione dell'host difese17.
Un altro motivo per impiegare orale itinerari dell'infezione è che permette l'indagine della variazione nella trasmissione dell'agente patogeno misurando lo spargimento batterica durante l'escrezione fecale dopo infezione orale22,23, 24. comprendere le fonti di eterogeneità di ospite nella trasmissione della malattia è impegnativo in popolazioni naturali25,26, ma componenti di trasmissione, come agente patogeno spargimento, sotto controllati del laboratorio di misurazione condizioni offre un utile approccio alternativo27. Da nutrire mosche batteri e misura batterica spargimento sotto una varietà di contesti genetici ed ambientali in condizioni sperimentali controllate, è possibile identificare fonti di variazione della trasmissione tra padroni di casa.
Qui, descriviamo un protocollo per infettare oralmente d. melanogaster con batteri patogeni e per quantificare la crescita batterica e spargimento che segue (Figura 1). Descriviamo questo protocollo su due batteri Pseudomonas : un ceppo virulento di patogeno opportunista p. aeruginosa (PA14) e un ceppo meno virulento del naturale volare patogeno p. entomophila. Pseudomonas sono batteri gram-negativi comuni con una gamma ampia host, infettando gli insetti, nematodi, piante e vertebrati e si trovano nella maggior parte dei ambienti4,6. Infezione enterica di Drosophila da p. aeruginosa e p. entomophila risultati in patologia a epiteli intestinali12,13,14,15, 28. Mentre ci concentriamo su questi due batteri patogeni, i metodi descritti qui possono in linea di principio essere applicati a qualsiasi agente patogeno batterico di interesse con modifiche minori. A seguito di esposizione orale, misuriamo la sopravvivenza post-infettiva e misurare il carico di microbo all'interno di singoli mosche e i microbi vitali versato nell'ambiente, espressa in unità (CFUs) di formazione di colonie. Infine, perché l'immunocompetenza intestino deriva da una combinazione di barriera epiteliale e risposte umorali, misuriamo anche la sopravvivenza delle linee volare dove queste difese sono interrotti. In particolare, Drosocrystallin (Dcy) mutanti sono stati precedentemente indicati per essere più suscettibili all'infezione batterica orale a causa di una matrice peritrofica impoverito nel budello29. Misuriamo anche la sopravvivenza in un mutante di Relish (Rel), che è ostacolata dalla produzione di peptidi antimicrobici contro batteri gram-negativi tramite la IMD percorso30.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vials</td>
			<td>Sarstedt Ltd.</td>
			<td>58.490</td>
			<td>Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7002</td>
			<td>Agar, ash 2.0-4.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown sugar</td>
			<td>Bidvest</td>
			<td>66032</td>
			<td>Light brown soft sugar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize</td>
			<td>Dove&#39;s Farm</td>
			<td></td>
			<td>Organic maize flour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermipan yeast</td>
			<td>Bidvest</td>
			<td>96360</td>
			<td>Dry, instant yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-4-hydroxybenzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5501</td>
			<td>&#62;=99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td>Sucrose BioUltra, for molecular biology, &#62;=99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>15788517</td>
			<td>X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (50ml)</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>210261</td>
			<td>Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube (0.5ml)</td>
			<td>Sarstedt Ltd.</td>
			<td>72.699</td>
			<td>Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube (1.5ml)</td>
			<td>Sarstedt Ltd.</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td>Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR International Ltd.</td>
			<td>20821.33</td>
			<td>ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE - Analytical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Conical Flask</td>
			<td>VWR International Ltd.</td>
			<td>214-0038</td>
			<td>Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter paper</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>1001-020</td>
			<td>Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou sample container</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>129A</td>
			<td>7ml polystyrene sample container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17208</td>
			<td>Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>BP1426</td>
			<td>Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Embryo Collection Cages</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td>
			<td>59-101</td>
			<td>Flystuff- fits 100mm petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td>
			<td>353072</td>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>12649595</td>
			<td>Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td>
			<td>CHE2068</td>
			<td>Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool- non absorbent</td>
			<td>Cowens Ltd</td>
			<td>ABL</td>
			<td>Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool- absorbent</td>
			<td>Cowens Ltd</td>
			<td>ABS</td>
			<td>BP small quantity 20 bags x 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td></td>
			<td>Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital incubator</td>
			<td>Gallenkamp</td>
			<td>INR-200-010V</td>
			<td>220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70&#186;C. Shaking frequency: 0...400 rpm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbance Microplate Reader</td>
			<td>Biotek Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td>ELx808&#8482; Absorbance Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen 5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>Biotek Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td>For Absorbance Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392304</td>
			<td>Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Step One Plus Real Time qPCR System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Step One Software 2.3</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Statistical Software</td>
			<td>https://cran.r-project.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>741015</td>
			<td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>741065</td>
			<td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>741045</td>
			<td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>774288</td>
			<td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>739288</td>
			<td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>740288</td>
			<td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral bacterial infection and shedding in drosophila melanogaster

Moscerino della frutta Drosophila melanogaster è uno dei migliori sistemi di modello sviluppato di infezione e l'immunità innata. Mentre la maggior parte del lavoro si è concentrata su infezioni sistemiche, c'è stato un recente aumento di interesse nei meccanismi di immunocompetenza intestino ai patogeni, che richiedono metodi di infettare oralmente mosche. Qui presentiamo un protocollo per esporre oralmente individuali vola verso un patogeno opportunista batterico (Pseudomonas aeruginosa) e un agente patogeno batterico naturale di d. melanogaster (Pseudomonas entomophila). L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire un metodo affidabile per esporre mosche maschi e femminile a tali agenti patogeni. Forniamo risultati rappresentativi mostrano fenotipi di sopravvivenza, carichi di microbo e batterico spargimento, che è rilevante per lo studio dell'eterogeneità nella trasmissione dell'agente patogeno. Infine, confermiamo che Dcy mutanti (manca la matrice peritrofica protettiva nell'epitelio dell'intestino) e assaporare mutanti (manca una via di deficit immunitario funzionale (IMD)), mostrano una predisposizione aumentata all'infezione batterica orale. Questo protocollo, quindi, descrive un metodo affidabile per infettare mosche utilizzando la via di infezione, che può essere estesa allo studio di una fonti di varietà genetica e ambientale di variazione in esiti di infezione intestinale e trasmissione batterica orale.

Qui, presentiamo illustrativi risultati dagli esperimenti dove d. melanogaster oralmente è stato infettato con p. aeruginosa o p. entomophila. Nella figura 2 viene illustrato il successo infezione orale di mosche dopo un periodo di esposizione 12h o 24h per le colture batteriche di OD600 = 25 e 100 per p. aeruginosa (Figura 2A) e p. entomophila (Figura 2B C), rispettivamente. Figura 2B illustra l'importanza dell'utilizzo di una cultura più concentrata di p. entomophila, indicato tramite l'aumento in carica batterica quando mosche sono esposti a colture batteriche di maggiore densità ottica. Maschi e femminile Oregon R (OreR) mosche eliminare p. aeruginosa infezione allo stesso tasso (Figura 3) e versato lo stesso numero di p. aeruginosa CFUs (Figura 4A). Quando infettati con p. entomophila tuttavia, mosche OreR maschili e femminili differiscono nel numero di capannone di batteri, in modo che cambia nel tempo (Figura 4B). Maschi e femmine muoiono da p. aeruginosa (Figura 5A) e p. entomophila (figura 5B) ai tassi differenti. Vediamo anche che Dcy mutanti (che mancano la matrice peritrofica protettiva nell'epitelio dell'intestino) e mutanti di Relish (che mancano un percorso immune funzionale di IMD), mostrano la sopravvivenza in diminuzione dopo p. aeruginosa p. entomophila e infezione orale (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig1.jpg"> Figura 1: Panoramica schematica dei protocolli per la misurazione di sopravvivenza, spargimento e carica batterica interna dopo l'infezione orale in Drosophila melanogaster. Un'illustrazione di 3 esperimenti potenziale dopo l'infezione orale di d. melanogaster. Misurare la 'sopravvivenza' trasferimento singoli mosche per fiale e registrando la loro durata infetto. Misurare 'spargimento' trasferendo mosche singole provette per microcentrifuga da 1,5 mL con 50 µ l di terreno di Lewis nel tappo. Dopo 24 h nel tubo, rimuovere al volo e vortice il tubo con 100 µ l di 1X PBS. Rimuovere e questa soluzione su agar nutriente LB per calcolare lo spargimento batterico della lastra. Misurare lo spargimento al volo stesso longitudinalmente, trasferendo mosche ai tubi freschi con il mezzo di Lewis nel tappo dopo 24 h e lavatrice e placcatura tubo ora contaminato. 'Carico interno' della Mosca può essere misurato prendendo un infetto fly, superficie di sterilizzazione, e d'omogeneizzazione prima infine placcatura omogenato su agar nutriente LB. Questo può essere eseguito dopo spargimento è stato misurato per calcolare come il 'carico interno' e correlare spargimento. L'illustrazione utilizzata in questa figura è stata originariamente disegnata da B. Nuhanen36. Gli autori lo hanno modificato per accompagnare la curva di Kaplan-Meier di esempio che è presa da Wikimedia Commons37. Tutte le altre illustrazioni sono originali. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig2.jpg"> Figura 2: dose infettante dei batteri dopo l'infezione orale. (A) dose infettiva di maschio e femmina Oregon-R Vola a seguito dell'esposizione ad una cultura di p. aeruginosa (OD600 = 25) per 12 h. La media e SE sono stati calcolati da 3 maschi e 3 femmine. (B) dose infettiva di femmine di selvaggio-tipo esogamico dopo l'esposizione ad una delle quattro p. entomophila culture (OD600 = 100, 25, 50 e 75) o controllare 5% soluzione di saccarosio per 24 h. La differenza statistica di (F3,76 = 18.567, p < 0,001) nella dose infettiva fra i trattamenti di esposizione è denotato da diverse lettere sopra bar. I mezzi sono stati calcolati da 5 mosche per il OD600 = 0 dose e 18-20 per tutte le altre dosi. (C) la dose infettiva di maschio e femmina Oregon-R Vola a seguito di esposizione alla cultura di p. entomophila (OD600 = 100) per 24 h. La media e SE sono stati calcolati da 20 maschi e 20 femmine. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig3.jpg"> Figura 3: Carico interno p. aeruginosa in mosche dopo infezione orale. Il carico batterico media ± SE di sesso maschile e femminile Oregon-R vola dopo l'infezione orale con p. aeruginosa (OD600 = 25) fino a post-infezione 168 h. La media e SE di ogni punto di tempo sono calcolati da 3 individui. Carica batterica interna della Mosca cambia in modo significativo nel tempo (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig4.jpg"> Figura 4: batterica spargimento dopo l'infezione orale. (A) p. aeruginosa capannone dalle mosche stessi utilizzati nella Figura 3, fino post-all'infezione 120 h. La media e SE sono stati calcolati da 3 maschi e 3 femmine. (B) p. entomophila capannone da maschio e femmina Oregon-R vola dopo l'infezione orale con p. entomophila (OD600 = 100) fino a post-infezione 120 h. La media e SE sono stati calcolati da 34 maschi e 38 femmine. Sia p. aeruginosa di p. entomophila, il numero di CFUs capannone da un Mosca cambia in modo significativo nel tempo (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig5.jpg"> Figura 5: sopravvivenza di mosche dopo infezione batterica orale. Curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier (KM) di (A) Oregon-R maschio e femmina vola dopo l'infezione orale con p. aeruginosa (OD600 = 25) o controllare 5% soluzione di saccarosio. La curva di sopravvivenza di KM è stata calcolata da 4 flaconcini di 20 mosche per gruppo di trattamento. (B) OreR maschio e femmina vola dopo infezione orale con p. entomophila (OD600 = 100). La curva di sopravvivenza di KM è stata calcolata da 4 singolo controllo mosche e 34 mosche infette per sia i maschi che le femmine. (C) Immune mutanti: Dcy (mutante di matrice Drosocrystallin-peritrofica) e Rel (mutante Relish-IMD), esposti a p. entomophila (Pe), p. aeruginosa (Pa14) o una soluzione di saccarosio di 5% di controllo. Tutti i gruppi infetti muoiono significativamente più velocemente che il controllo di mosche (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Questo protocollo descrive metodi per esporre oralmente e di infettare il moscerino della frutta Drosophila melanogaster con batteri patogeni e per misurare il numero di batteri infettivi capannone dopo l'infezione dell'intestino. Descriviamo ulteriormente l'effetto di mutanti immuni sulla sopravvivenza vola dopo l'infezione batterica orale.

Infezione batterica orale e spargimento in Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

oral-bacterial-infection-and-shedding-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

11.5K Views.  University of Edinburgh. Questo protocollo descrive metodi per esporre oralmente e di infettare il moscerino della frutta Drosophila melanogaster con batteri patogeni e per misurare il numero di batteri infettivi capannone dopo l'infezione dell'intestino. Descriviamo ulteriormente l'effetto di mutanti immuni sulla sopravvivenza vola dopo l'infezione batterica orale.

Video: Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissezione del sistema nervoso centrale larvali in Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Ricerca

Biologia

Wolbachia Bacterial Infection in Drosophila

My name is Voia Friedman. I am associate researcher at Princeton University. And today I'm going to tell you about a few protocols that I developed to trans infect, to I initially to isolate, to go back from the heli of infected flies, and later on help to inject the heli feed to unaffected flights.So basically, this is a very simple protocol to isolate him oly for basics. And you will use this device from, from mepo that contains a filter that goes on top of an E.So you basically needs to put you, we start from around a hundred flies. You anize the flies, you put them into the filter device, you can just use a funnel and that will add our other fit very easily on this device and wash it with 70%ethanol.You just take the, take the future away, you can throw away the ethanol, and then after three times your last wash you do with molecule water because you don't want have the bacteria from the, with traces of ethanol. Well, and then you just go to a new weapon door and, and then you spin down on a micro, real micro for two minutes And later on how you can inject that. He only feed do unaffected flies.So basically take a double stick tape and usually these double stick tapes have two side, one side is a sticker than the other. So leave the sticker side up because that's the side that you're gonna glue that flies on top of it. And basically you'll, the gas apparatus, if you have this light on top of it, you'll be no gas flow and the flies you wake up if they're on top of the slide.So you can just direct the flow, making a little hood, a little chamber using tape. Then you direct the gas over the flies. So then you put your, this light here with the tape and you, you have your flies.Stick the flies on the top of the tape, all of them the same orientation, and put their head towards the direction that you'll be bringing the needle from. Because then you can just over the, the wing, you make sure since they fly, you don't want to fly. If they woke up during the procedure, don't want them to go away.So make sure that you take a little tip and pressure against the, the, the wings of the fly on the tail. And it's okay if they wings get damaged. And when you get rid, when you take the flies up the injection, most likely they'll lose their wings anyway, so they'll survive.That can, that can be useful because you're not gonna lose the flies that, so he puts a mineral oil on the micrometer for the back of the needle, then the needle injection polar, and then the, you can just adjust the pressure to bring the material up to the tip of the needle. I, I did to inject Somewhere between 10 to 15 nanoliters, but as, as long, as long as I'm consistents. Okay, so one important detail there is a cushion of this experiment is that the, the fly, once the apply is being injected when you saw the needle needs to come as far as you can through the upper part of the abdomen.Because here, basically when the needle penetrates, you have a, a, a, a, a bigger space to go up and down. And basically if it's close, closer to the cuticle, it's less likely they're gonna penetrate vital organs in the flight. You, it is very likely unlikely that you're gonna punch a hole in your gut, for instance, if that is gonna kill the flight that you are performing the surgery.My name is Voia Friedman. I am associate researcher at Princeton University in the lab of Eric Hels. And today I would like to tell you about this protocol that you just saw, the demonstration.So this protocol was done because we wanted to prove that UBA is capable of crossing tissues. So UBA is one of the most successful intracellular paras on the face of the earth. Infects from 20 to 70%of insects and many particles.And also is, is very important in terms of human diseases because also infect nematodes that transmit diseases like river blindness or s and ssis. And so, and CCA is our obligatory endo in, in these worms. And there's a great, a very big interest in using CCA also as means to control parasitic diseases transmitter by mosquito and Danny and this and by mosquito such as malaria and dengue.So this, this, this protocol basically was developed to show that once CCA inside the abdominal cavity of a fly, they can cross tissues and reach the germ. So basically what you can see here is the oph of the drosophila ovary and go back once present in the he leaf it, it can cross a pink peronial. She that is around the ovary.And then they cross a muscle layer. And actually one of the first places that they, they go inside the ovary is the somatic stem cell image. And then they can reach the germline.And this bacteria is transmitted the same way that mitochondria is transmitted is through, is through the mother transmitted, through the mother cyop plants present in the egg. So of course they needs to be present into the germline. So that's why this protocol is developed.And this protocol is, can be very useful to basically traditionally the way that people would try to trans infect wbaa basically take wbaa and introduce a new insect species. It would be through doing micro injections into the, into the embryo. But those are much more complicated.And basically here we are just taking advantage of the o biology since they are capable to cross tissues and moving into the stem cell tissues from, they can pass to the, through to the germline. So that's make easier taking UBA from certain, from, from certain species of insects that are infected and they can be transmitted to uninfected species. Prob I think it's the injection itself.Basically you need to be careful to mobilize the fly as well as you can. We are using double sided stick tape and you need to penetrate the needle basically as close to the, as parallel to the fly as possible so you don't go to deep. And it's less likely that we're gonna kill the fly after they're performing the surgery.

Wolbachia infezione batterica in Drosophila

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be infected with polyhedra by droplet feeding and diet plug-based bioassays. This accompanying Springer Protocols section provides an overview of the baculovirus lifecycle and use of baculoviruses as insecticidal agents, including discussion of the pros and cons for use of baculoviruses as insecticides, and progress made in genetic enhancement of baculoviruses for improved insecticidal efficacy.

In this video, we demonstrate oral infection techniques of lepidopteran larvae with baculovirus in order to determine insecticidal efficiency.

Protocolli per infezione orale delle larve di lepidotteri con Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Tecniche di microiniezione per Studiare Mitosi in Drosophila melanogaster Embryo sinciziale

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissezione di Oenocytes da adulti Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Misura della durata della vita in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Mantenimento di un<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Cage Popolazione

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Infezione batterica orale e spargimento in Drosophila melanogaster

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Dissezione del sistema nervoso centrale larvali in Drosophila melanogaster

Wolbachia infezione batterica in Drosophila

Protocolli per infezione orale delle larve di lepidotteri con Baculovirus

Tecniche di microiniezione per Studiare Mitosi in Drosophila melanogaster Embryo sinciziale

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Dissezione di Oenocytes da adulti Drosophila melanogaster

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

Misura della durata della vita in

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da

Mantenimento di un