Os autores não têm nada para divulgar.

Todas as biópsias de endométrio humano coletadas para este estudo foram alcançadas na Universidade de Washington em St. Louis, departamento de obstetrícia e Ginecologia usando um institucional Review Board (IRB) aprovou o formulário de consentimento por escrito.
1. preparação
<ol><li>Prepare 500 mL de 1 x do Hank equilibrado sal solução (HBSS) adicionando 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL para o frasco contendo mídia (mais referenciado como meio HBSS +).</li>
	<li>Preparar 500 mL de meio de águia de Dulbecco modificado: F-12 mistura de nutrientes (DMEM/F12) com vermelho de fenol, L-glutamina e 15mm 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) adicionando 1% solução de antibiótico antimicótico (a concentração final é de 0,25 µ g/mL, 100 µ g/mL Estreptomicina e 100 U/mL penicilina Fungizone) para a mídia contendo o frasco (ainda mais referenciado como meios de isolamento HESC).</li>
	<li>Preparar 500 mL de DMEM/F12 com vermelho de fenol, L-glutamina e 15 mM HEPES, adicionando 10% de soro Fetal bovino (FBS), 1 x at2HCO3e 1% penicilina (10.000 U/mL) e estreptomicina (10.000 µ g/mL) (caneta Strep) à mídia contendo frasco (mais referenciado como HESC Media).</li>
	<li>Preparar 500 mL de meio de soro reduzido com L-glutamina, bicarbonato de sódio 2,4 g/L e HEPES com 2% carvão despojado Fetal soro bovino (csFBS) e 1% Strep caneta à mídia contendo frasco (mais referenciado como Decidualization Media).</li>
	<li>Prepare 500 mL de vermelho de fenol livre DMEM/F12, adicionando 2% carvão despojado de soro fetal bovino (csFBS) na mídia contendo frasco (mais referenciado como mídia de mudança).</li>
	<li>Prepare-se 10 nM estradiol (E2), acetato de medroxiprogesterona 1 µM (MPA) e 50 µM adenosina monofosfato cíclica (cAMP) em um tubo cónico polipropileno de 15 mL e adicionar a 2 mL por alíquota bem de mídia previamente preparado decidualization para in vitro ensaio de decidualization (mais referenciado como EPC Media).</li>
	<li>Prepare 50 mL de congelação mídia com 90% FBS e 10% dimetilsulfóxido (DMSO) 50 mL polipropileno cónica (mais referenciada como meios de congelamento).</li>
	<li>Pre-pesar 25 mg de colagenase e 5 mg de DNase I em um tubo de polipropileno cônico de 50 mL e loja a-20 ° C.</li>
</ol>2. aquisição de biópsia de endométrio humana
<ol><li>Obter amostras de biópsia de endométrio humano coletadas na fase proliferativa (dia 9 - dia 12) do ciclo menstrual da clínica em HBSS IRB aprovado.</li>
	<li>Lavar as amostras de biópsia com 1 mL de escaldadas 37 ° C HBSS + médio e agite suavemente para remover o excesso de sangue e muco.</li>
</ol>3. isolamento de células do estroma Endometrial humanas (HESC)
Nota: Este procedimento de isolamento é realizado em um ambiente estéril sob uma câmara de segurança biológica.
<ol><li>Transferir a biópsia com Pinças esterilizadas em um tubo de centrifuga conico de polipropileno de 50 mL contendo 10 mL HBSS fresco.</li>
	<li>Centrifugue a biópsia à temperatura ambiente a 500 x g, durante 90 s.<ol>
<li>Se as rupturas de pellet celular, re-spin a biópsia a 2.000 x g, durante 90 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova a mídia usando uma pipeta de 1 mL e lavar com 10 mL de 37 ° C pré-aquecido HESC isolamento Media seguido por centrifugação a 500 x g durante 90 s.</li>
	<li>Remova a mídia usando uma pipeta de 1 mL e vigorosamente, adicionar 3 mL de mídia de isolamento HESC fresco para desalojar a biópsia.</li>
	<li>Decante a biópsia para uma placa de Petri contendo 5 mL de HESC isolamento Media.</li>
	<li>Picar a biópsia em como pequenas peças possível usando #5 pinças e tesouras de costura reta bem por cerca de 20 minutos.</li>
	<li>Preparar a DNase I e enzimas colagenase, adicionando 10 mL de HESC isolamento Media para pré-pesados DNase I (0,5 mg/mL) e colagenase (2,5 mg/mL). Misture com pipeta.</li>
	<li>Pipeta de corta amostras de tecido usando uma pipeta de 1 mL para um tubo de polipropileno cônico de novo 50 mL. Lavar com 7 mL de meios de isolamento HESC e adicionar ao tubo de polipropileno para adquirir a amostra completa.</li>
	<li>Centrifugar a amostra à temperatura ambiente a 800 x g por 2 min. Retire com cuidado o sobrenadante com uma pipeta.</li>
	<li>Filtre o DNase I e solução de colagenase através de filtro de 0,2 µm anexados a seringa de 10 mL diretamente na pelota.</li>
	<li>Vórtice de 10 s para resuspenda o pellet.</li>
	<li>Digest em banho de água a 37 ° C por 1,5 h, num Vortex para 10 s minuciosamente cada 10 min, até tecido é digerido.</li>
	<li>Filtre a amostra através de um filtro de célula 40 µm empilhados sobre um tubo de polipropileno cônico de 50 mL para remover as células epiteliais e restos de tecido. Nota: As células estromais são no tubo de polipropileno cônico de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar o tubo polipropileno cônico de 50 mL a 800 x g, durante 2,5 min à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 10 mL de HESC isolamento Media.</li>
	<li>Centrifugar a 800 x g, durante 2,5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e depois Ressuspender as células em 6 mL de mídia HESC e pipeta para diante e reversa para misturar.</li>
	<li>Lentamente a camada em 3 mL de mídia gradiente de densidade para as células ressuspensa separar restantes células do sangue das células do estroma, tomando cuidado para não misturar as camadas.</li>
	<li>Centrifugar o tubo de polipropileno de 15 mL a 400 x g durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coletar 5 mL do sobrenadante em um novo tubo de polipropileno de 50 mL e adicionar um adicionais 5 mL HESC mídia para Ressuspender as células.</li>
	<li>Centrifugar a 800 x g durante 2,5 min à temperatura ambiente, seguida pela remoção do líquido sobrenadante e adição de 6 mL HESC Media. Vórtice da amostra durante 10 segundos e mistura pipetando para a frente e reverter 5 vezes.</li>
	<li>Alíquota de 10 µ l de células re-suspensas para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL para contagem de células.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de 0,4% de azul de Trypan manchar a alíquota de pilha e misture com pipeta. Carregar 10 µ l da alíquota e contar as células usando um hemocytometer.</li>
	<li>As células em um frasco apropriado dependente contagem celular total em 15 mL HESC Media da placa.<ol>
<li>Se o número total de células é menor que 1 milhão, placa todas as células em balão de 25 cm com 6 mL de HESC Media. Se o número total de células é mais de 1 milhão, placa todas as células de 75cm frasco com 15 mL de HESC Media.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultura de células em uma 5% CO2 incubadora a 37 ° C por um período mínimo de 6 h para assegurar a aderência de célula apropriada e alterar os meios de comunicação para mídia HESC.</li>
	<li>Cultura a HESC isolado numa incubadora 5% CO2 a 37 ° C por um período de 3-5 dias até que as células formam uma monocamada alcançar confluência de 80-90% em um balão chapeado.</li>
	<li>Alterar HESC Media em dois dias.<ol>
<li>Mídia de HESC quente em banho-maria 37 ° C por 15-20 min.</li>
		<li>Aspirar a mídia do recipiente e adicionar fresco HESC Media no balão (volume de trabalho: 8 mL ou 16 mL por frasco de 25 cm ou 75 cm respectivamente).</li>
		<li>Colocar o balão volta para 5% CO2 incubadora a 37 ° C, até alcançar a confluência de 80-90%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez HESC se tornar confluente de 80-90%, as células de transferência de 25 cm para balão de 75 cm ou de um balão de 75 cm para três frascos de 75 cm. Nota: HESC pode ser congelado e armazenado para uso posterior neste momento para experiências futuras.</li>
</ol>4. congelamento e descongelamento HESCs
<ol><li>Mídia de balão de 75 cm, Aspire e adicionar 2 mL de EDTA-tripsina.</li>
	<li>Incube numa incubadora 5% CO2 para 2-3 min a 37 ° C até que as células desalojar do recipiente.</li>
	<li>Adicione 7 mL de mídia HESC e misture bem por pipetagem, frente e verso.</li>
	<li>Centrifugar a 800 x g, durante 2,5 min e aspirar o sobrenadante.</li>
	<li>Etiqueta congelamento tubos com linha celular, data e número de passagem.</li>
	<li>Ressuspender o centrifugado em 5 mL de congelamento de mídia.</li>
	<li>Alíquotas de 1ml da HESC re-suspenso a cada tubo e transferência tubos de freezer-80 ° C.</li>
	<li>Transferi os tubos para nitrogênio líquido dentro de 24 horas. Nota: Se pretende descongelar células no futuro imediato, armazene células congeladas em-80 ° C durante um mês.</li>
	<li>Para descongelar os HESCs pré-aquecer HESC Media por 20 min.</li>
	<li>Adicione 8 mL de pré-aquecido HESC Media 25cm balão.</li>
	<li>Recuperar o tubo congelante do tanque de nitrogênio líquido ou -80 ° C e mergulhe o tubo em banho de água a 37 ° C durante 1-2 minutos descongelar as células.</li>
	<li>Transferir HESC descongelado para um balão de 25 cm com HESC mídia e incubá-los numa incubadora 5% CO2 durante a noite a 37 ° C.</li>
	<li>No dia seguinte, mudar a mídia HESC e esperar 2-3 dias até HESC se tornar confluente e transferir células para balão de 75 cm, conforme detalhado abaixo no protocolo 5.<ol>
<li>Mídia de HESC quente em banho-maria 37 ° C por 15-20 min.</li>
		<li>Aspirar a mídia do recipiente e adicionar fresco HESC Media no balão (volume de trabalho: 8 mL ou 16 mL por frasco de 25 cm ou 75 cm respectivamente).</li>
		<li>Colocar o balão volta para 5% CO2 incubadora a 37 ° C, até alcançar a confluência de 80-90%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. cultivo de células do estroma Endometrial humanas (HESC)
Nota: Este procedimento de Culturing é realizado em um ambiente estéril sob uma câmara de segurança biológica.
<ol><li>Pré-aquece o HESC Media a 37 ° C em banho-maria por 20-30 min.</li>
	<li>Aspirar a mídia do recipiente e adicionar o ácido de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) do tripsina 0,25% (1 mL para o frasco de 25 cm ou 2 mL para o frasco de 75 cm).</li>
	<li>Incube em uma 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante 2-3 min até desalojar as células.</li>
	<li>Bata levemente as paredes de balão para desalojar as células restantes. Adicione 7 mL de mídia HESC e misture bem por pipetagem, frente e verso.</li>
	<li>Pipetar a mistura de células em um tubo de polipropileno cônico de 50 mL e centrifugar 800 x g por 2,5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em Media HESC.<ol>
<li>Adicione 15 mL para o frasco de 25 cm ou 45mL para o frasco de 75 cm (15 mL cada).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 5 mL ou 15 mL de suspensão de células para cada balão de 25 cm ou 75 cm, respectivamente.</li>
	<li>Cultura a HESC isolado numa incubadora 5% CO2 a 37 ° C por um período de 3-5 dias até que as células formam uma monocamada alcançar confluência de 80-90% em um balão chapeado.</li>
	<li>Alterar HESC Media em dois dias.<ol>
<li>Mídia de HESC quente em banho-maria 37 ° C por 15-20 min.</li>
		<li>Aspirar a mídia do recipiente e adicionar fresco HESC Media no balão (volume de trabalho: 8 mL ou 16 mL por frasco de 25 cm ou 75 cm respectivamente).</li>
		<li>Colocar o balão volta para 5% CO2 incubadora a 37 ° C, até alcançar a confluência de 80-90%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. humano chapeamento de célula (HESC) do estroma Endometrial e siRNA Transfection
Nota: Este procedimento de transfeccao é realizado em um ambiente estéril sob uma câmara de segurança biológica.
<ol><li>Aspire HESC Media de balão de 75 cm e adicionar 2 mL de solução de EDTA-tripsina 0,25%.</li>
	<li>Incube em 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante 2-3 min até desalojar as células.</li>
	<li>Uma vez que as células são desalojadas do recipiente, adicionar 7 mL de mídia HESC e misture suavemente pipetando para diante e reversa 5 vezes.</li>
	<li>Pipetar a mistura de células em um tubo de polipropileno cônico de 50 mL e centrifugar 800 x g por 2,5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 mL de HESC Media. Nota: Se chapear pilhas de mais de um balão, simplesmente aumente o volume de mídia HESC.</li>
	<li>Contar as células usando um Hemocytometer.<ol>
<li>Alíquota de 10 µ l de células re-suspensas em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 10 µ l de 0,4% azul Trypan manchar a célula alíquota e misturar pipetando para frente e reversa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placa de 0,8 x 105 células por poço em placas 6-boas. Depois de dois dias, as células devem ser 60-70% de confluencia para transfeccao ideal.</li>
	<li>Para cada amostra de transfeccao siRNA, prepare complexos usando siRNA (60 nanomoles) de reagente de transfeccao.</li>
	<li>Diluir 5 µ l de reagente de Transfeccao de 150 µ l de meios livres de soro reduzida e incubar durante 5 min.</li>
	<li>Diluir 60 nanomoles de siRNA em 100 µ l de meios livres de soro reduzida e incubar durante 5 min.</li>
	<li>Após 5 minutos, combinar siRNA diluído com solução de reagente de transfeccao diluídos e misture suavemente pipetando para a frente e reverter 5 vezes. Nota: Se transfecting um ou mais siRNA em vários poços, mestre mix em 10 mL prepare tubos de poliestireno.</li>
	<li>Incube a complexos de reagente de transfeccao siRNA por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Durante esta incubação, adicione 1 mL de meios de comunicação de mudança a cada poço.</li>
	<li>Depois de 5 min. de incubação, centrifuga tubos a 500 x g por 2 min coletar a solução e adicionar a 250 µ l de complexos de reagente de transfeccao siRNA a bem, contendo células e mídia.</li>
	<li>Misture suavemente agite e incube as celulas a 37° C numa incubadora 5% CO2 por 5 h.</li>
	<li>Após 5h, mude os meios de comunicação de mídia HESC.</li>
	<li>Incube as células a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 2 dias em preparação para um ensaio de decidualization em vitro .</li>
</ol>7. ensaio de Decidualization in Vitro
Nota: Este ensaio é realizado em um ambiente estéril sob uma câmara de segurança biológica.
<ol><li>Preparar a mídia EPC antes de iniciar o tratamento decidualization em vitro , conforme descrito em Camden et al 3 (ver 1.6).</li>
	<li>Aspire a mídia da hora post-48 transfectada linha de HESC incubada da etapa 6.16.</li>
	<li>Adicione 2 mL de EPC Media em cada poço. Nota: como um controle, deixar um conjunto de células não tratado com Media de EPC. Em vez disso, adicione 2 mL de mídia HESC para os poços de controle.</li>
	<li>Incube as celulas em 5% CO2 incubadora a 37 ° C por 6 dias.<ol>
<li>Altere a mídia de EPC em 48 horas.<ol>
<li>Aquecer e preparar a mídia de EPC em banho maria a 37 ° C por 15-20 min.</li>
			<li>Aspirar a mídia do poço e adicionar mídia fresco do EPC.</li>
			<li>Coloque a placa de volta para a 5% CO2 incubadora a 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após o sexto dia, analise o grau de decidualization de células do estroma através de ELISA e qRT-PCR (conforme descrito abaixo).</li>
</ol>8. validação de Decidualization In Vitro utilizando PCR em tempo Real quantitativo (qRT-PCR)
Nota: qRT-PCR é completada conforme descrito em Kommagani et al.10.
<ol><li>Isole o RNA total de HESC utilizando o protocolo de um kit de isolamento de RNA comercialmente disponível.<ol>
<li>Analise a quantidade de RNA e pureza (um260/A280) usando um NanoDrop ou metodologia similar, conforme descrito em Garcia-Elias et al.15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sintetiza o cDNA de 1 µ g de RNA total através de um protocolo do kit de transcrição reversa comercialmente disponível.</li>
	<li>Execute uma reação de qRT-PCR, conforme descrito em um protocolo do kit de qRT-PCR comercialmente disponível.<ol>
<li>Gene específico testes junto com controles do sistema interno (18s, PRLe IGFBP1) e realizar a reação usando uma mistura de mestre de PCR em tempo real disponível comercialmente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. validação de Decidualization In Vitro utilizando ELISA
<ol><li>Quantificar os níveis de prolactina secretados dos meios de cultura de tecidos utilizando um kit de prolactina ELISA comercialmente disponível.</li>
</ol>10. validação de Decidualization In Vitro utilizando faloidina coloração.
<ol><li>Introduza cada poço de uma placa bem 12 lamínulas estéreis.</li>
	<li>Repita as etapas de 6.1-6.5.</li>
	<li>Placa de 0,8 x 105 células por poço de um prato bem 12.</li>
	<li>Incube as celulas em 5% CO2 incubadora a 37 ° C por 2 dias.</li>
	<li>Aspire os meios de comunicação.</li>
	<li>Repita as etapas 7.3-7.4.</li>
	<li>Consertar as células em paraformaldeído 4% (PFA) em solução salina tamponada fosfato (PBS) à temperatura ambiente por 30 min.</li>
	<li>Aspirar a solução de fixação e lavar 3 vezes com 1 mL de PBS durante 5 min cada.</li>
	<li>Adicione 0,1% de éter de fenil tensoativo não-iônico polietilenoglicol tert-octil em PBS por 5 min para as células fixas para aumentar a permeabilidade.</li>
	<li>Lavar 3 vezes com 1 mL de PBS durante 5 min cada.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de solução faloidina por lamela e incubar a temperatura ambiente por 90 min.<ol>
<li>Prepare a diluição de 1: 100 em PBS de usar uma solução estoque faloidina em 1 unidade por 5 µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar 3 vezes com 1 mL de PBS durante 5 min cada.</li>
	<li>Monte as lâminas com meio de montagem contendo 4' 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).</li>
	<li>Observe as células utilizando um microscópio confocal.</li>
</ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endometrial+fibroblasts+immortalized+by+simian+virus+40+large+T+antigen+differentiate+in+response+to+a+decidualization+stimulus.">Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus.</a> Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).</li><li>Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+induces+rapid+actin+assembly+in+human+endometrial+cells+without+affecting+its+synthesis.">Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).</li></ol>

Este trabalho é apoiado por financiamento de institutos nacionais de saúde (NIH) / Instituto Nacional de saúde infantil e desenvolvimento humano (FORMULADORES) grant (R00 HD080742) e start-up Washington University School of Medicine fundos para R.K. Gostaríamos de agradecer a clínica de fertilidade de Universidade de Washington para fornecer as amostras de biópsia endometrial.

O ciclo menstrual reprodutivo feminino é caracterizado por um aumento nos níveis de progesterona durante a fase lútea, induzindo assim a decidualization de ESC em redondo, epitelial, como as células secretoras de3,8. A iniciação de decidualization é dependente de espécies. Em humanos, decidualization ocorre espontaneamente sobre o aumento da concentração de progesterona, enquanto ratos requerem blastocisto presença10,...

Entre os estágios da menarca e menopausa, as mulheres em idade reprodutiva sofrem ciclos mensais de proliferação endometrial hormônio-regulada, diferenciação e subsequente derramamento em preparação para a gravidez em um processo conhecido como menstruação1 ,2. Tais modificações físicas do endométrio humano são necessárias para a implantação do embrião adequado para a parede uterina1. Alterações do endométrio, incluindo adaptações morfológicas e bioquímicas, são mediadas por todo o ciclo menstrual através de hormônios esteroides ovarianos estrógeno e progesterona (P4)3,4,5. No âmbito da fase proliferativa (ou folicular), os níveis de estrogênio preovulatory aumento, iniciando o espessamento do endométrio. Após a ovulação, a fase secretora (ou lútea) promove um aumento significativo nas concentrações de P4, induzindo a transformação morfológica das células do estroma endometriais (ESC) da aparência de fibroblasto arredondados, células epiteliais-decidual em um processo conhecido como decidualization4,6. Decidualization impróprio foi estabelecida como das causas para o fracasso do implante e posterior início embrião aborto espontâneo de4,de7,8. Portanto, compreender os mecanismos moleculares subjacentes decidualization é vantajoso para o diagnóstico e o tratamento de perda de gravidez precoce.
Atualmente, várias metodologias são utilizadas para explorar os efeitos subjacentes de decidualization em células do estroma endometriais. In vivo, o útero de rato pode ser induzida artificialmente para decidualization através de estimulação mecânica (i.e.,coçar) ou injeção em um útero hormonalmente condicionadas9de óleo. Distintos dos humanos, esta estimulação sintética promove a diferenciação do lúmen uterino, fornecendo a aparência da presença de blastocisto, um passo que é necessário para a iniciação de decidualization em roedores10,11. Nesse sentido, devido as complicações translacionais associadas com modelos animais e os dilemas éticos que cercam na vivo com base em estudos em seres humanos, modelos de decidualization com base são estudados com mais êxito in vitro.
Neste estudo, os sujeitos são recrutados através da colocação de anúncios em dois jornais locais, inglês e espanhol. Indivíduos identificados como candidatos adequados para este estudo são trazidos para se reunir com o coordenador da pesquisa, em que uma divulgação completa dos riscos potenciais são discutidos. Após a confirmação de uma compreensão completa dos riscos potenciais envolvidos, consentimento dos sujeitos é atingido nas formas verbais e escritas. Consentimento do sujeito inclui permissão para (1) submetido a armazenagem (2) a longo prazo de flebotomia de seus tecidos para fins de pesquisa futura e (3) concordar com a criação de culturas primárias de amostras de tecido coletadas. Após consentimento, indivíduos recebem um formulário para preencher no qual auto-identificação permitida de raça/etnia e/ou o direito de não-divulgação. Uma visita subsequente é programada para atingir a biópsia de endométrio com base no ciclo menstrual do sujeito. Voluntários recrutados para este estudo, refletem a demografia étnica e racial da região metropolitana de St. Louis, como documentado pelo censo de 2012 e que não envolvem a participação de qualquer população vulnerável, incluindo mulheres grávidas, fetos, embriões, crianças menores de 18 anos de idade, ou de outros grupos vulneráveis. Requisitos de elegibilidade para participação na coleção de amostra de biópsia incluem (1) estar entre as idades de 18-45 anos (2) ter ciclos menstruais regulares (25-32 dias) (3) não ter nenhuma gravidez atual ou uso de dispositivo intra-uterino hormonal/contraceptivos por 30 dias antes da inscrição (4) sem qualquer infecção vaginal atual ou doenças sexualmente transmissíveis (5) tendo nenhum atuais tratamentos com antibióticos e (6) não tendo nenhum atual de Papanicolau anormais.
Dentro deste estudo, células do estroma endometriais humanas (HESC) são cultivadas e induzidas artificialmente a submeter-se decidualization em vitro através da suplementação de hormônios (estradiol (E2), acetato de medroxiprogesterona (MPA) e adenosina cíclica monofosfato (cAMP)) ao meio. Neste método, o grau de decidualization é alterado com base no número total de dias de tratamento hormonal. Em conjunto com o rearranjo do citoesqueleto, suplementação hormonal induz adaptações bioquímicas em que as células decidual experimentam de qualidades secretoras2,4. A expressão de genes de marca, tais como a prolactina (PRL) e proteína fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGFBP1), pode ser utilizada para confirmar e quantificar o grau de HESC decidualization5,12, 13 , 14. importante, a viabilidade do presente protocolo realizar knockdown específicos do gene também é demonstrada.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:935px;" width="934">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">31985-070</td>
			<td style="width:271px;">For decidualization media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DMEM / F12 (1:1) (1X)</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">15250-061</td>
			<td>For cell count</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">12183018A</td>
			<td>For RNA Isolation/Purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">TaqMan 2X Universal PCR Master Mix</td>
			<td style="width:167px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:131px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:167px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:131px;">4374967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">4319413E</td>
			<td>For qPCR internal control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe</td>
			<td style="width:167px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:131px;">4331182</td>
			<td>For qPCR internal control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe</td>
			<td style="width:167px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:131px;">4331182</td>
			<td>For qPCR internal control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter</td>
			<td style="width:167px;">Abcam</td>
			<td style="width:131px;">ab176753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Human Prolactin ELISA Kit</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">EHIAPRL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:167px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:131px;">30525-89-4</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">13778150</td>
			<td>Transfection Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">P36935</td>
			<td>For mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:131px;">F6765-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Sodium Bicarbonate (7.5%)</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">25080-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ficoll-Paque PLUS Reagent</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">45001749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:131px;">C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:131px;">DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Medroxyprogesterone 17-acetate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:131px;">M1629-1G</td>
			<td>For EPC Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Estradiol</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:131px;">E1024-1G</td>
			<td>For EPC Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">cAMP</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:131px;">A6885-100MG</td>
			<td>For EPC Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fine straight stitch scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">15396-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe</td>
			<td style="width:167px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:131px;">4351372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">10-082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic-antimycotic</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:131px;">15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">21-021-cv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL conical polypropylene Falcon tube</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">100 x 15 mm Glass Petri dish</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td style="width:131px;">75845-546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">40 micron cell strainer</td>
			<td style="width:167px;">Midsci</td>
			<td style="width:131px;">229481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Isotemp 215 Water bath</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">FS-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">LSE Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">6755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Human NCOA2 siRNA&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:131px;">L-020159-00</td>
			<td>Gene specific qPCR probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Steri-cycle i160 CO2 Incubator&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:131px;">51030301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:131px;">ND-2000</td>
			<td>For RNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">50146771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">75 cm Canted Neck Cell Culture flask</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Pipet Controller Ultra</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">4099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Photoshop</td>
			<td style="width:167px;">Adobe</td>
			<td style="width:131px;">19.0.1.334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">25 cm Canted Neck Cell Culture flask</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">7200876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:131px;">X100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">15 mL conical polypropylene Falcon tube</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">10 mL Syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:131px;">302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1300 Series A2 Biological Safety Hood</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:131px;">1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">accuspin Micro17 centrifuge</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">13100675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">7500 Fast real time PCR system</td>
			<td style="width:167px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:131px;">3052632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">EVOS FL Immunofluorescence Microscope</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">01414-155G-291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Leica Inverted Light Microscope</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:131px;">DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Illrustrator</td>
			<td style="width:167px;">Adobe</td>
			<td style="width:131px;">22.0.1.253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Excel Spreadsheets</td>
			<td style="width:167px;">Microsoft</td>
			<td style="width:131px;">2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Deckglaser 18 mm cover glasses</td>
			<td style="width:167px;">NeuVitro</td>
			<td style="width:131px;">GG-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Reichert Bright-Line Hemacytometer</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:131px;">Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:131px;">BP176-100</td>
			<td>For RNA lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">430658</td>
			<td>For freezing HESC cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:131px;">D2650-100mL</td>
			<td>For freezing media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human endometrial stromal cells for in vitro decidualization

A diferenciação das células do estroma endometriais humanas (HESC) da aparência de um fibroblasto em secretora decidua é uma transformação necessária para a implantação do embrião no revestimento do útero do ventre materno. Decidualization impróprio foi estabelecida como das causas para a falha de implantação e subsequente aborto precoce do embrião. Portanto, compreender os mecanismos moleculares subjacentes decidualization é vantajoso melhorar a taxa de nascimentos bem sucedidos. In vivo com base em estudos de decidualization artificial estão limitando muitas vezes devido a dilemas éticos associadas à investigação humana, bem como complicações translacionais em modelos animais. Como resultado, em vitro ensaios através de cultura de células primárias são frequentemente utilizados para explorar a modulação de decidualization através de hormônios. Este estudo fornece um protocolo detalhado para o isolamento de HESC e subsequente decidualization artificial através da suplementação de hormônios para o meio de cultivo. Ainda mais, este estudo fornece um método bem projetado para nocaute qualquer gene de interesse utilizando transfections de siRNA baseadas em lipídios. Este protocolo permite a otimização da pureza da cultura, bem como rendimento de produto, maximizando assim a capacidade de utilizar este modelo como um método confiável para compreender os mecanismos moleculares subjacentes à decidualization e a posterior quantificação dos agentes secretados pelas células do estroma endometriais decidualized.

Decidualization em cultura HESC
Após isolamento, células do estroma endometriais humanas foram cultivadas a uma formação de monocamada com confluência de 80-90% e induzido para decidualization em vitro , tratando com 10 nM E2, 1 µM MPA e acampamento de 50 µM (EPC). Mudanças morfológicas associadas em vitro decidualization foram visualizadas na figura 1A. S...

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Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Este estudo apresenta um processo otimizado e validado para o isolamento e a cultura de células do estroma endometriais humanas para realizar o ensaio de decidualization em vitro . Além disso, este estudo fornece um método detalhado para eficientemente "knockdown" um gene específico usando siRNAs em células do estroma endometriais humanas.

Isolamento de células do estroma Endometrial humanas para In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

isolation-human-endometrial-stromal-cells-for-vitro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

10.1K visualizações.  Washington University School of Medicine. Este estudo apresenta um processo otimizado e validado para o isolamento e a cultura de células do estroma endometriais humanas para realizar o ensaio de decidualization em vitro . Além disso, este estudo fornece um método detalhado para eficientemente "knockdown" um gene específico usando siRNAs em células do estroma endometriais humanas.

Vídeo: Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

Isolamento e expansão de CTM / células estromais derivadas de placenta humana Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own body. The ability to grow bone de novo using a patient's own cells would allow bony defects to be filled with adequate tissue without the morbidity of harvesting native bone. There is interest in the use of adipose-derived stromal cells (ASCs) as a source for tissue engineering because these are obtained from an abundant source: the patient's own adipose tissue. However, ASCs are a heterogeneous population and some subpopulations may be more effective in this application than others. Isolation of the most osteogenic population of ASCs could improve the efficiency and effectiveness of a bone engineering process. In this protocol, ASCs are obtained from subcutaneous fat tissue from a human donor. The subpopulation of ASCs expressing the marker BMPR-IB is isolated using FACS. These cells are then applied to an in vivo calvarial defect healing assay and are found to have improved osteogenic regenerative potential compared with unsorted cells.

Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient's own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.

Isolamento rápido de BMPR-IB + adiposo-derivados de células estromais para uso em um Defeito Modelo Cura calota craniana

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Isolamento de rato Endometrial epiteliais e estromais para células<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolamento e Caracterização de células mesenquimais do estroma a partir de cordão umbilical humano e Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide suffering from corneal vision loss1. To address the demand for viable human corneas, significant progress in three-dimensional (3D) tissue engineering has been made2,3,4. These cornea models range from simple monolayer systems to multilayered models, leading to 3D full-thickness corneal equivalents2.
However, the use of a 3D tissue-engineered cornea in the context of in vitro disease models studied to date lacks resemblance to the multilayered 3D corneal tissue structure, function, and the networking of different cell types (i.e., nerve, epithelium, stroma, and endothelium)2,3. In addition, the demand for in vitro cornea tissue models has increased in an attempt to reduce animal testing for pharmaceutical products. Thus, more sophisticated models are required to better match systems to human physiological requirements, and the development of a model that is more relevant to the patient population is absolutely necessary. Given that multiple cell types in the cornea are affected by diseases and dystrophies, such as Keratoconus, Diabetic Keratopathy, and Fuchs, this model includes a 3D co-culture model of primary human corneal fibroblasts (HCFs) from healthy donors and neurons from the SH-SY5Y cell line. This allows us for the first time to investigate the interactions between the two cell types within the human corneal tissue. We believe that this model could potentially dissect the underlying mechanisms associated with the stromal-nerve interactions of corneal diseases that exhibit nerve damages. This 3D model mirrors the basic anatomical and physiological nature of the corneal tissue in vivo and can be used in the future as a tool for investigating corneal defects as well as screening the efficacy of various agents before animal testing.

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

This protocol describes a novel three-dimensional in vitro model, where corneal stromal cells and differentiated neuronal cells are cultured together to assist in the examination and understanding of the interactions of the two cell types.

Engenharia de tecido corneal: Um em Vitro modelo das interações nervo-estromal da córnea humana

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

Geração de organóides endometriais primários humanos multicelulares

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized synapse that transmits action potentials from the motor neuron to skeletal muscle for mechanical movement. The architecture of the NMJ structure influences the functions of the neuron, the muscle and the mutual interaction. Previous studies have reported many strategies by co-culturing the motor neurons and myotubes to generate NMJ in vitro with complex induction process and long culture period but have struggled to recapitulate mature NMJ morphology and function. Our in vitro NMJ induction system is constructed by differentiating human iPSC in a single culture dish. By switching the myogenic and neurogenic induction medium for induction, the resulting NMJ contained pre- and post- synaptic components, including motor neurons, skeletal muscle and Schwann cells in the one month culture. The functional assay of NMJ also showed that the myotubes contraction can be triggered by Ca++ then inhibited by curare, an acetylcholine receptor (AChR) inhibitor, in which the stimulating signal is transmitted through NMJ. This simple and robust approach successfully derived the complex structure of NMJ with functional connectivity. This in vitro human NMJ, with its integrated structures and function, has promising potential for studying pathological mechanisms and compound screening.

Here we provide a protocol to generate in vitro NMJs from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). This method can induce NMJs with mature morphology and function in 1 month in a single well. The resulting NMJs could potentially be used to model related diseases, to study pathological mechanisms or to screen drug compounds for therapy.