Como o nome de nossa instituição, Instituto de Medicina Materno-Fetal sugere, nossa pesquisa se concentra principalmente na biologia reprodutiva feminina. Nosso objetivo é entender o mecanismo dos distúrbios reprodutivos e identificar alvos potenciais para tratá-los. Uma das principais vantagens dessa abordagem é a redução substancial de tempo e despesas em comparação com os sistemas de cocultura disponíveis comercialmente.
O andaime caseiro é construído com materiais prontamente disponíveis, reduzindo significativamente o custo da configuração. Esses modelos in vitro multicelulares representam melhor uma anatomia in vivo complexa da região de implantação. No futuro, nosso laboratório introduzirá outros tipos de células a este modelo in vitro multicelular de semeadura mista e investigará mais estudos de implantação e função uterina na patogênese de doenças como lesão endometrial e adesão intrauterina.
Para começar, obtenha o andaime impresso em 3D para a construção do modelo. Para cultura de células, coloque uma lamínula quadrada limpa e estéril de 18 milímetros no fundo de uma placa de 12 poços. Cubra a lamínula com 200 microlitros de matriz extracelular a uma concentração de 200 a 300 microgramas por mililitro.
Mantenha o prato a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, remova a matriz extracelular da placa. Em seguida, inspecione as células-tronco embrionárias humanas previamente cultivadas e as células de Ishikawa sob um microscópio para confirmar a confluência apropriada.
Em seguida, remova o meio gasto dos poços e lave as células duas vezes com três mililitros de PBS. Agora incube as células com dois mililitros de enzima de dissociação a 37 graus Celsius por dois minutos para separá-las. Neutralizar a reacção utilizando um meio de cultura completo.
Em seguida, crie uma suspensão de célula única pipetando para cima e para baixo. Agora misture 100 microlitros da suspensão celular com azul de tripano, mantendo um fator de diluição de dois. Em seguida, deslize a lamínula sobre a câmara do hemocitômetro.
Encha ambas as câmaras laterais com a suspensão celular misturada com azul de tripano. Conte o número de células em quadrados em ambos os lados sob um microscópio 20X e calcule a densidade celular com base nas contagens. Agora semeie as células-tronco embrionárias humanas em uma concentração de 10 elevado a cinco células por mililitro na placa preparada contendo meio fresco e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas.
Para a linha celular de Ishikawa, semeie as células no poço sem uma lamínula no dia seguinte. Mergulhe bem os andaimes com álcool etílico e água bidestilada por dois dias. Após a imersão, remova a água bidestilada e feche a lata de metal.
Em seguida, esterilize os andaimes usando uma autoclave a 121 graus Celsius. Depois disso, deixe-os secar. Adicione aproximadamente dois mililitros de meio complementar ao poço com as células de Ishikawa.
Transfira a lamínula com células-tronco embrionárias humanas anexadas para o andaime, posicionando o lado da célula para baixo. Conecte o andaime no poço contendo células de Ishikawa. Para a segunda configuração, coloque a lamínula com células de Ishikawa no andaime e conecte-a ao poço contendo células-tronco embrionárias.
Incube os sistemas de co-cultura a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Remova cuidadosamente o meio de cultura dos poços e enxágue suavemente as células com PBS estéril. Usando pinças ou pinças finas, remova as lamínulas com as células anexadas das placas de cultura.
Opcionalmente, coloque as lamínulas em um novo prato com PBS para mantê-las hidratadas durante o processo de transferência. Adicione uma gota de PBS em uma lâmina de microscópio limpa e transfira suavemente a lamínula contendo as células para a gota, garantindo que as células estejam voltadas para baixo na lâmina. Posicione a lâmina preparada no palco de um microscópio invertido.
Selecione a lente objetiva apropriada e use os botões de foco grosso e fino para ajustar o foco. Defina os parâmetros do microscópio, incluindo a intensidade da iluminação e as configurações da câmera. Use o software do microscópio para capturar imagens nas ampliações e campos de visão desejados.
A densidade de ambos os tipos de células permaneceu baixa na condição de co-cultura após 72 horas, enquanto as densidades de células cultivadas independentemente aumentaram significativamente. O comprimento das células-tronco embrionárias humanas co-cultivadas foi menor do que aquelas cultivadas independentemente.
