Este protocolo é significativo, pois mostra uma metodologia passo-a-passo para isolar o epitélio uterino altamente puro do útero de camundongo para a cultura de organoides endometriais. Este método utiliza eficientemente dissociação enzimática e mecânica para isolar o epitélio uterino. As técnicas foram simplificadas para estabelecer, tratar e analisar organoides do epitélio endometrial derivados do epitélio isolado.
Comece descongelando a matriz de gel no gelo por aproximadamente uma a duas horas antes do uso. Em seguida, disseque o rato eutanasiado fazendo uma incisão na linha média no abdômen usando uma tesoura e descascando suavemente a pele para expor a camada peritoneal subjacente. Localize os chifres uterinos movendo suavemente as almofadas de gordura abdominal para o lado e segure os chifres uterinos na junção cervical antes de cortá-los ao longo da gordura mesentérica.
Após a dissecção do útero do rato, remova completamente o tecido adiposo do chifre uterino com uma pequena tesoura. Uma vez feito, corte cada chifre uterino em pequenos fragmentos, cada um medindo aproximadamente quatro a cinco milímetros. Coloque todos os fragmentos uterinos de um útero em um poço de uma placa de 24 poços contendo 0,5 mililitros de 1% de tripsina.
Em seguida, incubar a placa de 24 poços em uma incubadora de cultura de tecido umidificada de 37 graus Celsius por aproximadamente uma hora para separação enzimática do epitélio endometrial do estroma subjacente. Após a incubação, transfira os fragmentos uterinos para uma placa de cultura de tecido de 35 milímetros contendo um mililitro de solução tamponada com fosfato de Dulbecco ou DPBS. Em seguida, separe o epitélio uterino do tubo uterino sob um microscópio de dissecação, segurando uma extremidade de um fragmento uterino com a pinça e passando suavemente a ponta da pipeta longitudinalmente através do fragmento, espremendo o epitélio para fora da outra extremidade do tubo uterino.
Em seguida, observe as folhas epiteliais separadas do fragmento uterino sob o microscópio de dissecção. Em seguida, transfira suavemente todas as folhas epiteliais para o mesmo tubo de 1,5 mililitro usando a pipeta de um mililitro. E pelotar as folhas epiteliais dissociadas por centrifugação a 375 x g por cinco minutos.
Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular e ressuspenda o pellet celular em 0,5 mililitros de 2,5 miligramas por mililitro de colagenase mais dois miligramas por mililitro de solução de DNA. Pipetar para cima e para baixo aproximadamente 10 vezes ou até que uma única suspensão celular seja alcançada. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de DMEM F/12 mais 10% de soro fetal bovino ou FBS mais antibióticos e centrifugar as células por cinco minutos a 375 x g.
Remova o sobrenadante, ressuspenda as células em um mililitro de DMEM / F12 mais 10% FBS mais antibióticos e centrifugar as células. Coloque a matriz de gel no gelo até que esteja pronta. Em seguida, remova o sobrenadante das células centrífugas e ressuspenda o pellet celular usando 20 vezes o volume da matriz de gel sem introduzir as bolhas.
Deixe a suspensão da célula da matriz de gel assentar à temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. Uma vez que a suspensão de células da matriz de gel se torne um gel semissólido, use uma micropipeta P200 com uma ponta larga de 200 microlitros e aspire suavemente 25 microlitros da suspensão celular da matriz de gel. Dispense três cúpulas separadas de 25 microlitros por poço de uma placa de 12 poços e permita que a matriz de gel cure por 15 minutos e uma incubadora de cultura de tecidos umidificada de 37 graus Celsius.
Depois que a matriz de gel for curada, adicione 750 microlitros de meio organoide a cada bem contendo cúpula de matriz de gel e incubadora a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada. Imagens de contraste de fase de organoides endometriais de camundongos mostraram que a separação epitelial e de células estromais produziu amostras com não mais de 10% a 15% de contaminação do tipo celular oposto. As células epiteliais endometriais foram montadas em organoides dentro de três a quatro dias.
Os organoides endometriais embebidos em parafina fixa em formalina seccionados foram visualizados por coloração de hematoxilina e eosina, que exibiam a camada única de epitélio e os centros ocos, os lúmens dos organoides. A imagem do microscópio de fluorescência mostrou que todas as células dos organoides eram positivas para citoqueratina 8 e continham DAPI, indicando que a fixação, incorporação e processamento dos organoides endometriais é compatível com a imunocoloração baseada em anticorpos. A PCR quantitativa em tempo real mostrou que a estimulação com 10 nanomolares de estradiol aumentou a expressão de lipocalina 2, lactoferrina e receptor de progesterona nos organoides epiteliais, indicando que os organoides epiteliais endometriais podem ser usados com sucesso para medir as alterações na expressão gênica em resposta ao estradiol.
É importante garantir que a separação clara do epitélio endometrial seja obtida durante a etapa de dissociação mecânica. Deve-se ser capaz de observar o epitélio emergindo do tubo uterino. Outros métodos incluem o estabelecimento dos organoides epiteliais por encapsulamento em uma matriz de gel.
Se desejado, o compartimento estromal pode ser digerido para criar coculturas epiteliais estromais 3D. O método pode ajudar a responder a perguntas sobre os sinais que controlam a renovação do endométrio. Pode ajudar a tratar doenças em mulheres, como endometriose, perda de gravidez e câncer.
