Graças aos membros do centro de espectroscopia de massa Indiana universidade e a Universidade de Utah Metabolomics facilidade do núcleo de assistência em otimizando este protocolo. JMT é suportado pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências, do institutos nacionais da saúde sob prêmio número R35GM119557.

1. ovo coleção
<ol><li>Colete os adultos machos e fêmeas virgens de genótipos desejados. Idade individualmente esses animais em um frasco de alimento com mídia de Bloomington padrão para 3-5 dias.</li>
	<li>Configurar os acasalamentos adequados ao transferir 50 fêmeas virgens e 25 machos para um novo frasco de comida. Nota: Um mínimo de seis acasalamentos independentes deve ser configurado para cada genótipo. Será coletada apenas uma amostra de cada acasalamento (ou seja, seis amostras colhidas seis acasalamentos independentes).</li>
	<li>
Prepare-se tampas de postura de melaço.
	<ol>
<li>Misture 115 mL de melaço e 29 g de ágar com 700 mL de H2O em um frasco de 2 L.</li>
		<li>Ferva o melaço mistura de ágar-ágar em um prato quente.</li>
		<li>Arrefecer a 70 ° C.</li>
		<li>Adicionar 25 mL de mistura ácida (20 mL de ácido fosfórico 85% e 209 mL ácido propiônico em 1 litro de H2O; Armazenar em um frasco marrom) e 10 mL de éster metílico de ácido p-hidroxi-benzoico de 10% em etanol a 95%.</li>
		<li>Despeje o ágar de melaço na parte da tampa e o fundo de um prato de cultura de tecidos de2 35 x 10 mm. Nota: Antes de derramar o melaço placas de ágar, certifique-se que as tampas e/ou a base da placa de2 35 x 10 mm se encaixa snuggly na boca de uma garrafa de estoque de Drosophila (descrita no passo 1.6). Dependendo da marca de placas usado, a base pode não ser utilizável.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fazer fermento fresco pasta adicionando água destilada para ativo fermento seco (5g fermento/7 mL de água) até que a mistura torna-se uma pasta que pode ser facilmente espalhada sobre uma superfície sólida (ou seja, a consistência da manteiga de amendoim).</li>
	<li>Espalhe cerca de 1,5 g de fermento de colar na superfície de uma tampa de postura de melaço.</li>
	<li>Abrir quatro buracos de ar em lados opostos de um plástico 6 oz garrafa de estoque de drosófila usando uma agulha 22g.</li>
	<li>Transferi as moscas recentemente acasaladas de frasco de alimentos em frascos de cultura. Nota: As moscas podem ser transferidas por qualquer um usando o CO2 como um anestésico temporário ou segurando a parte superior do frasco na boca da garrafa e agudamente tocando o fundo da garrafa contra uma bancada.</li>
	<li>Rapidamente, coloque um boné de postura de melaço com pasta de fermento na superfície para a boca de uma garrafa de estoque de Drosophila . Use fita de laboratório para fixar a tampa de postura no lugar. Nota: Se moscas foram anestesiados antes da transferência, o frasco deve ser colocado horizontalmente sobre a bancada até que todas as moscas se recuperaram. Uma vez que as moscas são completamente móveis, coloca o frasco em uma incubadora com a tampa de postura de melaço na parte inferior da cultura.</li>
	<li>Recoloque a tampa de postura de melaço pelo menos uma vez por dia durante os primeiros dois dias, invertendo o frasco de estoque, tocando o fundo da garrafa contra a bancada, removendo a tampa de ovo velho, e imediatamente, colocando uma nova tampa de ovo dentro da boca da garrafa. Descarte a tampa antiga postura. Nota: Este passo garante que as fêmeas não está segurando seus ovos e permite a coleta de populações sincronizadas.</li>
	<li>Coloque uma tampa nova postura para o frasco de estoque após dia 3, substituir após 2 h e descarte. Remova e substitua a segunda postura cap depois de quatro horas. Rotule o fundo deste boné de postura com a data, hora e genótipo. Nota: Os ovos coletados durante esta janela de 4h serão usados para análise. Esta etapa de sincronização é crítica para analisar os estádios de desenvolvimento específicos. Os ovos podem ser coletados dessa maneira por vários dias.</li>
	<li>Inserir as tampas de postura em uma placa de Petri 60 x 15 mm2 e coloque em uma incubadora na temperatura e umidade.</li>
	<li>Inspecione as tampas postura todos os dias por problemas com fome, densidade populacional ou contaminação. Nota: As larvas devem ter acesso à alimentação adequada para garantir o desenvolvimento contínuo. Se necessário, colar de fermento fresco pode ser espalhado em todos os tampões de postura que serão usados no experimento. Além disso, se a densidade de população larval é muito alta, larvas começará a vaguear fora a placa de cultura. Estas amostras não devem ser usadas para análise metabolómica porque a elevada densidade populacional e intermediários crises de fome vivida enquanto vagando irão resultar em dados inconsistentes. Uma densidade de ~ 80 – 100 médio segundo ínstar larvas (L2) por placa ou 40-50 médio terceiro instar as larvas (L3) por placa é recomendado. Amostras que são visivelmente contaminadas com bactérias ou fungos devem ser descartadas.</li>
</ol>2. coleta de amostra larval
<ol><li>Larvas de idade até o ponto desejado. Se coletando larvas L3, sincronizar novamente as amostras na muda L2-L3. A ressincronização é comumente alcançada usando um método descrito anteriormente que usa os espiráculos anteriores como um marco no desenvolvimento de15. Alternativamente, meados-L3 larvas podem ser sincronizadas usando um de gene repórter sgs3 16. Nota: a este respeito, encontramos larvas meados-L2 (~ 60 h após a postura de ovos) são ideais para a maioria das análises porque desenvolvimento larval é ainda relativamente síncrono, nesta fase, cuidadosamente coletadas amostras têm uma alimentação adequada para desenvolver para este Commit e os número de animais por amostra é gerenciável (veja abaixo). Um passo adicional de sincronização é necessário para as larvas L3 porque os numerosos pulsos de isoinokosterone que ocorrem durante o desenvolvimento de L3 têm efeitos dramáticos no metabolismo e irão gerar artefatos em populações não sincronizadas.</li>
	<li>Use uma agulha de dissecação para levantar delicadamente a massa de levedura fora o ágar. Coloque o fermento para uma nova PAC de ágar de melaço. Nota: a maioria das larvas comerá na interface entre o ágar de melaço e o colar de levedura.</li>
	<li>Use um pincel pequeno para coletar larvas de superfície recém exposta do ágar melaço. Coloque as larvas em um tubo de centrífuga de 1,5 mL no gelo. Nota: As dimensões das amostras apropriadas para cada estágio do desenvolvimento são as seguintes: 50 primeiro ínstar larvas (L1); 25 larvas de meados-L2; 20 larvas L3 precoce; 15 meados-L3 ou tarde larvas L3.</li>
	<li>Lave e congele amostras (etapas 2.3 através de 2.8) em pequenos lotes (quatro a seis amostras) ao coletar um conjunto de amostra grande. As amostras devem ser congeladas dentro de 20 min de colocação de larvas em tubos. Nota: Recomendamos usar tubos de Flex Eppendorf 1,5 mL porque outros tubos podem interferir com a transferência da amostra na etapa 3. As amostras devem ser colhidas em tubos de microcentrífuga. Não coletar amostras em tubos de grânulo descritos no passo 3.1. Grânulos cerâmicos retêm a solução de lavagem de NaCl, o que resulta em medidas de massa imprecisas e introduz contaminantes na amostra.</li>
	<li>Adicione 1 mL de gelado 0,9% NaCl dentro do tubo, fechar a tampa e verticalmente da aleta do tubo para cuidadosamente para lavar as larvas.</li>
	<li>Coloque o tubo de volta no gelo para ~ 30 s. Durante este tempo, as larvas vão afundar até o fundo do tubo, mas fermento permanecerão em suspensão. Uma vez que todas as larvas têm formado uma pelota solta, remova a solução de NaCl usando uma pipeta de 1 mL.</li>
	<li>Repita etapas 2.4 e 2.5, duas vezes, ou até que a solução de lavagem final é claro. Nota: As etapas adicionais de lavagem podem ser necessárias se a amostra recolhida contém uma quantidade excessiva de levedura.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 2.000 × g por 1 min a 4 ° C.</li>
	<li>Remova todos os solução residual utilizando uma pipeta de 200 µ l.</li>
	<li>Imediatamente, congele a amostra em nitrogênio líquido. Nota: O protocolo pode ser pausado para esta etapa. As amostras podem ser armazenadas por até 3 meses a-80 ° C.</li>
</ol>3. transferência de amostras para tubos do grânulo
<ol><li>Cada amostra larval deve ser transferida do tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para um tubos de screwcap de 2 mL contendo esferas de cerâmica de 1,4 mm. Em preparação para esta etapa de transferência, use um marcador de etanol-prova para rotular o lado de um tubo de grânulo de screwcap 2 mL (marcações da tampa serão destruídas durante a etapa de 4.4).</li>
	<li>A massa do tubo rotulado grânulo usando uma balança analítica capaz de medir com precisão 0,01 mg de Tara.</li>
	<li>Se larval amostras foram armazenadas a-80 ° C, coloque os tubos de amostra no antes do nitrogênio líquido para transferência.</li>
	<li>Use pinça longa para remover o tubo de amostra de 1,5 mL do nitrogênio líquido dewar.</li>
	<li>Usando luvas de nitrilo, agarre o congelado do tubo, inverter e libra agudamente a tampa do tubo contra a bancada para desalojar o sedimento congelado. Imediatamente despeje a pelota em um tubo de grânulo de screwcap 2ml previamente tarada. Se o pellet não desalojar, retornar o tubo de nitrogênio líquido e repita. Nota: Pelotas Larval não desalojará de todos os tubos de microcentrífuga. Se usar um tubo diferente da recomendada, determine se pelotas larvas podem ser desalojadas antes da colheita de amostras para análise.</li>
	<li>Rapidamente medir a massa combinada do tubo da pelota e o grânulo larval. Imediatamente, coloque o tubo de amostra em nitrogénio líquido. A pelota larval massa será usada para normalizar os dados da metabolómica. Nota: O protocolo pode ser pausado para esta etapa. As amostras podem ser armazenadas por até 3 meses a-80 ° C.</li>
</ol>4. extração da amostra
<ol><li>Coloque os tubos de amostra em uma bancada de-20 ° C mais frio.</li>
	<li>Adicione 0,8 mL de metanol a 90% prechilled (-20 ° C) contendo 2 µ g/mL de ácido succínico-d4 em cada tubo. Retorne a amostra para a bancada de-20 ° C mais frio. Nota: O ácido succínico-d4 serve como padrão interno. Só uso HPLC grau H2O e metanol. Desde que o metanol e outros solventes orgânicos são voláteis e difíceis de medir com precisão usando pipetas de deslocamento de ar, recomendamos o uso de pipetas volumétricas para esta etapa e todas as etapas seguintes.</li>
	<li>Configurar um controle negativo adicionando 0,8 mL de metanol a 90% prechilled (-20 ° C) contendo 2 µ g/mL de ácido succínico-d4 num tubo vazio do grânulo.</li>
	<li>Homogeneizar as amostras por 30 segundo a 6,45 m/s usando um homogeneizador de moinho do grânulo localizado em uma sala de controle de temperatura de 4 ° C. Nota: Falha para rapidamente e completamente homogeneizar a pelota larval é uma fonte comum de variabilidade na análise da metabolómica. Só use Homogeneizadores que são capazes de destruir congelado larvas tecidos dentro de 30 s.</li>
	<li>Retornar os tubos de amostras homogeneizadas para a bancada de-20 ° C mais frio e incube-os no congelador-20 ° C pelo menos 1 h.</li>
	<li>Centrifuga os tubos em 20.000 × g ou o máximo de velocidade por 5 min a 4 ° C para remover o precipitado resultante.</li>
	<li>Transferi 600 µ l do sobrenadante para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL. Não perturbe o precipitado. Se o pellet precipitado torna-se deslocado ao pipetar o sobrenadante, retornar todos os sobrenadante no tubo e repita a etapa 4.6.</li>
	<li>Coloque os tubos de amostra em uma centrífuga a vácuo. Certifique-se de que todos os tubos estão abertos antes de selar o centrifugador. Secar as amostras à temperatura ambiente até que todo solvente é removido (esta etapa geralmente leva ~ 16 h para completar). Nota: Se necessário, o protocolo pode ser pausado para esta etapa. Amostra seca pode ser armazenada a-80 ° C.</li>
</ol>5. química derivatização
<ol><li>Se as amostras secas foram armazenadas a-80 ° C, coloque os tubos de amostra fechada em uma centrífuga a vácuo e secar por 30 min. Esta etapa deve ser executada antes de abrir o tubo de amostra. Nota: Este passo remove a condensação que se acumula na parte externa do tubo de microcentrífuga quando retirados do congelador. Esta parte do protocolo é extremamente sensível a H2O e precaução extra deve ser tomada para manter todos os reagentes tão seco quanto possível.</li>
	<li>
Prepare uma solução de cloridrato de methoxylamine de 40 mg/mL (MOX) em piridina anidra. Apenas use a piridina anidra. Loja MOX e piridina num exsicador e preparar a solução MOX diariamente. Cuidado: MOX e piridina são tóxicos. Prepare esta solução na coifa.<ol>
<li>Use um soprador de ar quente para secar uma seringa de vidro de 1 mL.</li>
		<li>Insira a agulha da seringa para o frasco de piridina anidra. Retire 1 mL de piridina e adicionar a um tubo de microcentrífuga contendo 40mg de MOX.</li>
		<li>Lave a garrafa de piridina anidra com argônio. Tapar o frasco e retornar para o exsicador.</li>
		<li>Dissolva o MOX na piridina incubando o tubo em um misturador térmico a 35 ° C por 10 min a 600 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 40 µ l de MOX de 40 mg/mL em solução de piridina anidra para a amostra seca.</li>
	<li>Vórtice de 10 s e brevemente centrífuga (10.000 x g por 20 s).</li>
	<li>Incube a 30 ° C, durante 1 h a 600 rpm em um misturador térmico.</li>
	<li>Centrifugar a 20.000 × g ou velocidade máxima por 5 min remover o problema de partículas.</li>
	<li>Transferi 25 µ l do sobrenadante para um tubo de mostruário com uma inserção de microvolume de vidro de 250 µ l desativado.</li>
	<li>Adicionar 40 µ l de N- metil -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) contendo 1% TMCS. Atenção: MSTFA é tóxico. Execute esta etapa na coifa. Nota: Se estiver disponível, esta etapa pode ser concluída por um mostruário de Gerstel.</li>
	<li>Coloque uma tampa no frasco do mostruário e selar usando uma ferramenta de frisador.</li>
	<li>Incube a amostra a 37 ° C durante 1 hora com agitação (250 rpm).</li>
	<li>Prepare uma solução ácido graxo metil éster padrão (FAMES) como anteriormente desceribed3. Adicione 3 µ l de FAMES no frasco de mostruário automático usando um mostruário automático robótico imediatamente antes da injeção. Nota: Famas são usadas para calibrar o deslocamento do tempo de retenção e verificar o desempenho do instrumento. Se nenhum mostruário automático robótico está disponível, FAMEs podem ser adicionados durante a etapa de 5,8.</li>
</ol>6. deteção de GC-MS
Nota: Na maioria dos casos, o usuário irá realizar essa etapa com o auxílio de uma instalação de núcleo de espectroscopia de massa. Este protocolo é projetado para ser usado com um 30 m, coluna GC com uma coluna de guarda de 5m.
<ol><li>Randomize a ordem da amostra.</li>
	<li>
Prepare o GC-MS.
	<ol>
<li>Conjunto, a taxa de fluxo de gás portador Hélio a 1 mL/min.</li>
		<li>Definir a temperatura de entrada de 250 ° C.</li>
		<li>Programa o GC para executar o gradiente de temperatura a seguir:<ol>
<li>Temperatura inicial para 95 ° C, com uma espera de 1 min.</li>
			<li>Aumente a temperatura de 110 ° C, à taxa de 40 ° C/min com uma espera de 2 min.</li>
			<li>Aumentar para 250 ° C por rampa de 5° C/min.</li>
			<li>Aumentar a 330 ° C, à taxa de 25 ° C/min com uma preensão final de 4 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Definir o atraso de solvente para 3,5 min. Nota: O tempo pode ser alterado de acordo com o sistema de GC-MS. A finalidade desta etapa é evitar MSTFA e MOX de danificar o detector.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injete 1 µ l da amostra pyrazole o GC-MS (dividir a proporção de 10:1). Nota: Injete 2 µ l da amostra se a intensidade dos picos é muito baixa. A ordem de injeção de amostras deve ser aleatórios.</li>
	<li>Operar o espectrômetro de massa no modo de varredura completa sobre uma escala em massa de 50 – 500 m/z.</li>
</ol>7. análise de dados
<ol><li>Analise dados metabolómica usando tanto uma abordagem não segmentada ou alvo. Alvo de análise é focado em medir a abundância de um conjunto definido de metabólitos, tais como as medições de lactato que descrevemos abaixo. Em contraste, a análise não segmentado usa uma abordagem imparcial para identificar qualquer característica metabólica que mudou significativamente entre dois conjuntos de amostra. Nota: Nosso laboratório usa primeiramente o programas livres MetAlign17 e18,de MetaboAnalyst19 para análise de dados. Desde que uma descrição adequada tanto o controle de qualidade, normalização e etapas de processamento de dados estão além do escopo deste manuscrito, referimos o usuário protocolos mais detalhados que são dedicados ao processamento de dados20,21, 22. Além disso, um fluxograma descrevendo as etapas necessárias para essa análise podem ser encontrado em outro lugar8.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Metabolomics oferece uma oportunidade sem precedentes para analisar as reações metabólicas que compõem o metabolismo intermediário. A sensibilidade desta tecnologia, no entanto, processa dados suscetíveis a base genética, pistas do desenvolvimento e uma variedade de estresses ambientais, incluindo temperatura, umidade, densidade populacional e disponibilidade de nutrientes. Portanto, uma alta qualidade e reprodutíveis metabolomics análise exige que as amostras sejam cobrados em condições altamente controladas....

Mosca da fruta Drosophila melanogaster emergiu como um sistema ideal para estudar o mecanismo molecular que regulam o metabolismo intermediário. Não só são a maioria das vias metabólicas conservadas entre Drosophila e seres humanos, mas chaves sensores de nutrientes e reguladores de crescimento, tais como a insulina, Tor e myc, também são ativos na mosca1,2. Como resultado, a Drosophila pode ser usado para explorar a base metabólica de doenças humanas que variam de diabetes e obesidade a neurodegeneração e câncer. A este respeito, desenvolvimento larval de Drosophila fornece o quadro ideal para se estudar um programa metabólico conhecido como glicólise aeróbica, ou o efeito de Warburg. Assim como muitos tumores glicólise aeróbica para gerar biomassa de hidratos de carbono, então, para fazer a drosófila larvas ativam glicólise aeróbica para promover o crescimento do desenvolvimento3,4,5. Essas semelhanças entre larval e metabolismo de tumor estabelecer drosófila como um modelo de chave para compreensão como aeróbio glicólise é regulamentado na vivo.
Apesar do fato que a mosca tem emergido como um modelo popular para estudar o metabolismo, a maioria dos estudos de Drosophila dependem de métodos que são projetados para medir metabólitos individual3, tais como a trealose, triglicérides ou ATP. Como um protocolo específico é necessária para medir cada metabólito, estudos baseados no ensaio são tendenciosas para aqueles compostos que podem ser medidos usando jogos comerciais, caro e trabalhoso. Uma solução para estas limitações emergiu do campo da metabolómica, que fornece um meio mais eficiente e imparcial de estudar o metabolismo de Drosophila . Ao contrário de um estudo baseado em ensaio, uma análise única metabolómica simultaneamente pode medir centenas de metabólitos de pequenas moléculas e fornecem uma compreensão abrangente de estado metabólico6,7 de um organismo. Esta técnica expandiu-se significativamente o âmbito da drosófila estudos metabólicos e representa o futuro deste emergente campo8.
Metabolómica estudos são realizados principalmente utilizando três tecnologias: (i) ressonância magnética nuclear (NMR), (ii) líquida cromatografia / espectrometria de massa (LC-MS) e (iii) cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS)9. Cada abordagem apresenta desvantagens e vantagens distintas, e todas essas tecnologias têm sido usadas para estudar com sucesso o metabolismo de Drosophila . Desde que a pesquisa conduzida em nosso laboratório está focada em metabolitos pequenos, polares, empregamos principalmente um método baseados em GC-MS. GC-MS fornece o usuário com um número de vantagens, incluindo a grande reprodutibilidade, pico resolução, sensibilidade, e a disponibilidade de uma espectral biblioteca de impacto (EI) de elétrons padrão, que permite a identificação rápida de descoberto metabólica características de10,11. A preparação de amostras para GC-MS, no entanto, é um pouco complexa e exige uma cuidadosa atenção aos detalhes. Amostras devem ser coletadas, lavadas, pesava e congeladas em uma maneira que sacia rapidamente reações metabólicas. Além disso, a carcaça da mosca é resistente para protocolos padrão de homogeneização e requer um moinho do grânulo para garantir a extração de metabólito ideal. Finalmente, amostras analisadas por GC-MS devem se submeter a derivatização química antes da deteção12. Enquanto os métodos publicados anteriormente descrevem todas estas etapas3,13,14, um protocolo visual que permita que o usuário iniciante reproducibly gerar dados de alta qualidade ainda é necessária. Aqui vamos demonstrar como preparar amostras de larvas de Drosophila para análise metabolomics baseados em GC-MS. Este protocolo permite que o usuário reproducibly medir muitos dos pequenos metabólitos polares que compõem o metabolismo de carbono central.

<table><tbody><tr><td>Unsulfured blackstrap molasses</td><td>Good Food, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>EMD Millipore</td><td>PX2012-7</td><td></td></tr><tr><td>Methoxyamine hydrocholoride (MOX)</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>155405</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA with 1% trimethylchlorosilane</td><td>Sigma</td><td>69478</td><td></td></tr><tr><td>Fleischmann&amp;rsquo;s Active dry yeast</td><td>AB Mauri Food Inc</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>6oz Drosophila stock bottle</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes)&amp;nbsp;</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-627</td><td></td></tr><tr><td>Vial insert, 250 &amp;micro;L deactivated glass with polymer feet</td><td>Agilent</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>Succinic acid-2,2,3,3-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>293075</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo&amp;nbsp;</td><td>SC210A</td><td></td></tr><tr><td>o-Phosphoric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242-1</td><td></td></tr><tr><td>Propionic acid</td><td>Sigma</td><td>P5561</td><td></td></tr><tr><td>p-Hydroxy benzoic acid methyl ester</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-040E</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td></td></tr><tr><td>MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifuge tube</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish</td><td>Corning Incorporated</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>GC column</td><td>Phenomex</td><td>ZB-5MSi</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (gc-ms)-based metabolomics

Recentes avanços no campo da metabolómica estabeleceram a mosca de fruta Drosophila melanogaster como um poderoso modelo genético para estudar o metabolismo animal. Combinando a vasta gama de ferramentas genéticas drosófila com a capacidade de levantamento de grandes áreas de metabolismo intermediário, uma abordagem metabolomics pode revelar interações complexas entre dieta, genótipo, eventos de vida-história e Dicas ambientais. Além disso, estudos metabolomics podem descobrir novos mecanismos enzimáticos e descobrir conexões anteriormente desconhecidas entre vias metabólicas aparentemente díspares. Para facilitar o uso mais difundido dessa tecnologia entre a comunidade de Drosophila , aqui nós fornecemos um protocolo detalhado que descreve como preparar amostras de larvas de Drosophila para cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS)- com base em análise da metabolómica. Nosso protocolo inclui descrições de coleta de amostra larval, extração do metabólito, derivatização química e análise por CG-em. Conclusão bem-sucedida do presente protocolo permitirá que os usuários medir a abundância relativa dos metabólitos polares pequenas, incluindo aminoácidos, açúcares e ácidos orgânicos envolvidos na glicólise e os ciclos TCA.

Lactato desidrogenase (dLDH) mutantes, desprovidas de atividade dLDH4e geneticamente-controles foram coletados como larvas de meados-L2 e processada de acordo com o protocolo descrito acima. Quando comparados com controles, larvas mutantes exibem alterações significativas no lactato, piruvato e L-2-Hidroxiglutarato4. Espectros foram adquiridos com um sistema de Agilent GC6890-5973i MS. Um exemplo dos espectros de GC-MS gerar com n...

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Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

Este protocolo descreve como preparar larvas de Drosophila para análise da metabolómica baseados em GC-MS.

Preparação de amostras de larvas de Drosophila por cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS)-com base em metabolómica

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

preparation-drosophila-larval-samples-for-gas-chromatography-mass

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

11.1K visualizações.  Indiana University. Este protocolo descreve como preparar larvas de Drosophila para análise da metabolómica baseados em GC-MS.

Vídeo: Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions. 
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Preparação de mitocondriais frações enriquecidas para Análise metabólica em<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Biologia do Desenvolvimento

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Genética

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

Preparação em média<em&gt; Drosophila</em&gt; Extractos de embrião para experiências proteômicas

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity results in the hydrolysis of the membrane lipid phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate [PI(4,5)P2] leading ultimately to the activation of transient receptor potential (TRP) and TRP like (TRPL) channels. The activity of PLC&#946; also leads subsequently to the generation of many lipid species several of which have been proposed to play a role in TRP and TRPL activation. In addition, several classes of lipids have been proposed to play key roles in organizing the cell biology of photoreceptors to optimize signaling reactions for optimal sensory transduction. Historically, these discoveries have been driven by the ability to isolate Drosophila mutants for enzymes that control the levels of specific lipids and perform analysis of photoreceptor physiology in these mutants. More recently, powerful mass spectrometry methods for isolation and quantitative analysis of lipids with high sensitivity and specificity have been developed. These are particularly suited for use in Drosophila where lipid analysis is now possible from photoreceptors without the need for radionuclide labeling. In this article, the conceptual and practical considerations in the use of lipid mass spectrometry for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of various signaling lipids in Drosophila photoreceptors are covered. Along with existing methods in molecular genetics and physiological analysis such lipid is likely to enhance the power of photoreceptors as a model system for discoveries in biology.

<meta charset="utf8"></head><body>Análise da sinalização lipídica em fotorreceptores de Drosophila usando espectrometria de massas

The manuscript presents versatile, robust, and sensitive mass spectrometry protocols to identify and quantify several classes of lipids from Drosophila photoreceptors.

Análise da sinalização lipídica em fotorreceptores de Drosophila usando espectrometria de massas

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity ...

Bioquímica

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Neurociência

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purificação de Transcrições e metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabeças

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Biologia

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at the Drosophila NMJ enables researchers to acquire synaptic information, encompassing both quantitative data on synapse abundance and detailed insights into their morphology. However, the diffuse distribution and limited visual range of the TEM present challenges for the ultrastructural analysis. This study introduces an innovative and efficient sample preparation method that surpasses the conventional approach. The procedure begins by placing a metal mesh at the base of a flat-bottomed bottle or test tube, followed by positioning fixed larvae samples onto the mesh. An additional mesh is placed over the samples, ensuring that they are positioned between the two meshes. The fixed samples are thoroughly dehydrated and infiltrated before proceeding with the embedding procedure. Then embedding of the samples in epoxy resin is performed in a flat sheet manner, which allows for the preparation of muscles for positioning and sectioning. Benefiting from these steps, all the muscles of Drosophila larvae can be visualized under light microscopy, therey facilitating subsequent positioning and sectioning. Excess resin is removed after locating the 6th and 7th muscles of body segments A2 and A3. Serial ultra-thin sectioning of the 6th or 7th muscle is performed.

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

This report provides a new sample preparation procedure for visualizing neuromuscular junctions in Drosophila Larvae. This method is more effective in preventing the curling of the samples compared to the traditional method and is particularly useful for Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

Otimizando o processo de preparação de amostras para microscopia eletrônica de transmissão de junções neuromusculares em larvas de Drosophila

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

Monitoramento do transporte de metabólitos cerebrais em Drosophila usando sensores FRET

Visualizing Monocarboxylates and Other Relevant Metabolites in the Ex Vivo Drosophila Larval Brain Using Genetically Encoded Sensors

The high energy requirements of brains due to electrical activity are one of their most distinguishing features. These requirements are met by the production of ATP from glucose and its metabolites, such as the monocarboxylates lactate and pyruvate. It is still unclear how this process is regulated or who the key players are, particularly in Drosophila.
Using genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer-based sensors, we present a simple method for measuring the transport of monocarboxylates and glucose in glial cells and neurons in an ex-vivo Drosophila larval brain preparation. The protocol describes how to dissect and adhere a larval brain expressing one of the sensors to a glass coverslip. 
We present the results of an entire experiment in which lactate transport was measured in larval brains by knocking down previously identified monocarboxylate transporters in glial cells. Furthermore, we demonstrate how to rapidly increase neuronal activity and track metabolite changes in the active brain. The described method, which provides all necessary information, can be used to analyze other Drosophila living tissues.

Autor em destaque: Avanços na pesquisa do metabolismo energético do cérebro usando o modelo Drosophila

Here we present a protocol to visualize the transport of monocarboxylates, glucose, and ATP in glial cells and neurons using genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer-based sensors in an ex-vivo Drosophila larval brain preparation.

Visualização de monocarboxilatos e outros metabólitos relevantes no cérebro de larvas ex vivo de Drosophila usando sensores codificados geneticamente

Preparação de amostras de larvas de Drosophila por cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS)-com base em metabolómica

Resumo

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Purificação de Transcrições e metabolitos de

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Visualização de monocarboxilatos e outros metabólitos relevantes no cérebro de larvas ex vivo de Drosophila usando sensores codificados geneticamente

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