A distribuição difusa e o alcance visual limitado do MET apresentam desafios para a análise de infraestrutura. Este protocolo apresenta um método inovador e eficiente de preparação de amostras que supera a abordagem convencional. Este método avançado de preparação de amostras TEM é mais eficaz na prevenção do enrolamento das amostras em comparação com o método tradicional, permitindo que as amostras permaneçam planas durante a desidratação subsequente.
A seleção dos reagentes e o ajuste da dosagem devem ser necessários dependendo do tipo de amostra. Existem muitos reagentes químicos tóxicos usados no processo de preparação da amostra. Demonstrando o procedimento estará Sheng Qingyuan, um estudante de mestrado do laboratório do Dr. Gan Guangming.
Para começar, disseque as larvas errantes de Drosophila no final do terceiro ínstar em solução de Jan e obtenha toda a parede do corpo de acordo com os procedimentos padrão. Fixe a parede do corpo larval com o fixador na câmara de dissecção durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, transfira a parede do corpo larval da câmara de dissecção para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e enxágue-o várias vezes com tampão de cacodilato de sódio.
Fixe a parede do corpo larval em tetróxido de ósmio a 1% por duas horas. Após a fixação, lavar as amostras várias vezes com água destilada. Adicione solução de acetato de mictório saturado a 2% no tubo para corar a junção neuromuscular PHI.
E depois de duas horas, enxágue as amostras com água deionizada. Em seguida, usando uma tesoura, corte dois pedaços redondos de malha de metal com poros de 270 mícrons. Coloque a malha de metal na base de uma garrafa de fundo plano.
Em seguida, coloque as larvas fixas na malha, seguida da colocação de outra malha. Desidrate as amostras em uma concentração crescente de etanol por 20 minutos cada a quatro graus Celsius. Em seguida, enxaguar as amostras duas vezes com óxido de propileno à temperatura ambiente durante cinco minutos cada.
Em seguida, coloque as amostras em uma solução de óxido de propileno e resina epóxi, seguida de resina epóxi pura por duas horas em temperatura ambiente. Para incorporar, corte um filme de polietileno em um grande quadrado e um pequeno suporte retangular oco. Cole o quadrado pequeno com o quadrado grande.
Adicione resina epóxi suficiente no centro do grande quadrado. Em seguida, ligue o estereoscópio e coloque as amostras na resina epóxi pré-posicionada com o lado do músculo voltado para cima. Adicione várias gotas de resina epóxi nas amostras e cubra-as com filme de polietileno.
Colocar as amostras para polimerização a temperaturas crescentes durante 24 horas cada. Após a polimerização, usando uma lâmina afiada, remova as partes excedentes do corpo larval, mantendo um trapézio, incluindo o segmento A2 e A3. Remova o trapézio da parede restante do corpo larval e prenda-o à cápsula cheia de resina com cola AB.
Ao microscópio óptico, confirmar a posição do sexto e sétimo músculos dos segmentos A2 e A3, mantendo o plano tangente paralelo ao sexto músculo. Em seguida, corte um quinto da amostra ao longo dos dois lados do segmento A3. Usando um micrótomo, prepare uma seção ultrafina da amostra a partir do sexto músculo.
Após o corte, prenda o máximo de fatias possível a cada malha de cobre. Use um microscópio eletrônico de transmissão para observar as amostras. Entre a resina Lowicryl K4M e a resina epóxi, a resina Lowicryl K4M forneceu resultados mais nítidos e facilmente observáveis dos músculos do corpo de Drosophila.
A imagem confocal demonstrou visualização aprimorada da junção neuromuscular entre o sexto e o sétimo músculos. A microscopia eletrônica de transmissão revelou junções neuromusculares semelhantes a contas, oferecendo informações aprimoradas sobre a estrutura sináptica. As amostras permaneceram planas durante todo o processo de desidratação devido à restrição das malhas metálicas.
Além disso, as amostras foram polimerizadas entre os produtos plásticos, evitando que as amostras se dobrassem. No futuro, o método de preparação de amostras MET pode ser aplicado ao neurópilo do cérebro e do cordão nervoso ventral, melhorando assim o potencial da pesquisa ultraestrutural.
