Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do HIV, como determinar a composição genética de provírus do HIV e diferentes tipos de células. Especialmente identificando aqueles que estão geneticamente intactos e potencialmente replicação competente. As principais vantagens desta técnica é que ela nos permite amplificar provírus de HIV de comprimento único de células infectadas pelo HIV e, em seguida, sequestradas por sequenciamento de próxima geração.
Para começar, prepare todos os buffers conforme descrito no protocolo de texto. Obtenha uma pelota celular e adicione cem microliters de tampão de lise por milhão de células. Misture por pipetting para cima e para baixo.
Lise as células incubando em um cicloviário térmico a 55 graus celsius por uma hora e, em seguida, adicione 85 graus celsius por 15 minutos. Para começar a amplificar provírus de DNA único HIV-1, misture os reagentes para o PCR da primeira rodada conforme listado na tabela um do protocolo de texto. Adicione 38 microliters a 85 poços em uma placa PCR de 96 poços e rotule esta placa como PCR 1.
Depois disso, mova a placa PCR 1 para uma área clara designada para a adição de DNA genômico. O uso de cloridrato tris dilui o DNA genômico de uma razão de um a três para uma razão de um a 81, certificando-se de preparar 45 microliters de cada diluição. Adicione dois microliters de DNA genômico diluído a cada amostra bem e dois microliters de cloridrato tris a cada poço de controle negativo.
Sele a placa inteira, exceto pelo controle positivo. Em seguida, mova-se para uma área designada para a adição do controle positivo. Adicione dois microliters do controle positivo ao poço correspondente e, em seguida, sele completamente a placa.
Use um rotador de placa PCR para girar brevemente a placa PRC 1 e retirar qualquer conteúdo residual dos lados dos poços. Execute a placa PCR 1 no ciclo de tempor térmica conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, misture os reagentes para a segunda rodada de PCR conforme listado na tabela um.
Adicione 28 microliters deste mix PCR 2 a 85 poços de uma nova placa PCR de 96 poços. Rotule esta placa como PCR 2. Usando um rotador de placa, gire brevemente a placa PCR 1 para retirar qualquer conteúdo residual dos lados dos poços.
Adicione 80 microliters de cloridrato tris a cada poço desta placa. Depois disso, use uma pipeta de canal de mutli para transferir dois microliters de cada poço da placa PCR 1 para os poços correspondentes na placa PCR 2. Sele a placa PCR 2 com envoltório adesivo claro.
Gire brevemente a placa PCR 2 no rotador de placa. Enquanto isso, sele a placa PCR 1 com uma película de vedação térmica para armazenamento a longo prazo a menos 20 graus celsius. Execute a placa PCR 2 em um cicloviário térmico conforme descrito no protocolo de texto.
Em seguida, gire brevemente a placa PCR 2 para retirar qualquer conteúdo residual dos lados dos poços. Usando uma pipeta multicanal, adicione 60 microlitradores de cloridrato tris a cada poço. Em seguida, execute 15 microliters de cada poço em dois 48 bem pré-moldados 1% de géis de agarose que contêm brometo de etídio.
Identifique os poços que contêm o produto amplificado e seus tamanhos aproximados e salve a imagem do gel. Depois disso, determine a diluição na qual não mais de 30% dos poços são positivos para o produto amplificado. Primeiro, use um rotador de placas para girar brevemente a placa PCR 2 e puxe qualquer conteúdo residual dos lados dos poços.
Transfira 40 microliters dos poços que contêm produto amplificado para os poços correspondentes de uma nova placa midi de 96 poços. Em seguida, estabeleça um kit de purificação baseado em alimentação magnética, certificando-se de levar as contas magnéticas à temperatura ambiente e preparar uma nova solução de 80% de etanol. Uma vez que as contas atingem o vórtice de temperatura ambiente, elas garantem que elas sejam completamente resuspendidas.
Usando uma pipeta multicanal, adicione 40 microliters de contas aos 40 microliters de produto amplificado em cada poço da placa midi. Misture suavemente pipetting para cima e para baixo 10 vezes. Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos.
Em seguida, transfira a placa para um suporte magnético e deixe descansar por dois minutos. Depois disso, remova e descarte o supernaspeso. Com a placa ainda no banco, lave as contas adicionando duzentos microliters da solução de 80% de etanol para cada poço.
Incubar em temperatura ambiente por 30 segundos e, em seguida, remover e descartar o supernatante. Repita este processo de lavagem uma vez desde a adição do etanol até o descarte do supernante. O uso de uma pipeta multicanal remove o excesso de etanol.
Deixe as contas secarem por 15 minutos. Depois disso, retire a placa do suporte. Adicione 30 microliters de tampão de elução a cada poço e misture suavemente tubos para cima e para baixo 10 vezes.
Incubar em temperatura ambiente por dois minutos. Coloque a placa de volta no suporte magnético e deixe descansar por dois minutos. Usando uma pipeta multicanal, transfira 25 microliters do supernatante para os poços correspondentes de uma nova placa PCR de 96 poços.
Em seguida, use um fotômetro de espectro para determinar e registrar a concentração aproximada de cada produto de DNA amplificado. Defina um kit de quantificação de DNA duplo encalhado e dilua o buffer para uma vez em água livre de DNAs estérei. Adicione 99 microliters do buffer a um número apropriado de poços vazios em uma placa de cultura de tecido fundo plano.
Em seguida, adicione cem microliters de tampão a três poços em branco. Para que cada produto amplificado seja medido adicione um microliter de DNA purificado em triplicado a cada poço contendo tampão. Diluir lambda duplo DNA encalhado 10 vezes de dois nanogramas por microliter para ponto zero zero nanogramas por microliter para preparar os padrões.
Adicione cem microliters de cada padrão de DNA duplo preso a três poços. Diluir o corante florescence de um a duzentos com tampão. Adicione rapidamente cem microliters a cada poço que contenha uma amostra, em branco ou padrão e misture por pipetação para cima e para baixo.
Depois disso, cubra a placa com papel alumínio para evitar contato com a luz. Usando um leitor de microplaca, regise a emissão de floresnce. Use as medidas registradas para determinar a concentração de DNA duplo encalhado em cada amostra.
Em seguida, diluir cada produto purificado com água a uma concentração de zero ponto dois nanogramas por microliter. Após pcr aninhado, os produtos amplificados são executados em um gel de 1% de agarose. A qualidade inicial do PCR pode ser determinada inspecionando os controles.
Como os controles negativos contendo produto amplificado indicam contaminação e os controles positivos sem produto amplificado indicam amplificação insuficiente. Apenas os poços executados na diluição do ponto final que contenham provírus amplificados únicos são considerados para sequenciamento. Embora os poços que contenham vários provírus amplificados de diferentes comprimentos possam ser visualizados nesta fase, eles não devem ser selecionados para sequenciamento.
Para a montagem de Novo, a qualidade dos contigs montados pode ser avaliada para profundidade e adequação suficientes da cobertura. Populações mistas também podem ser identificadas nesta fase pela presença de cobertura irregular. A representação visual das sequências isoladas de um participante revela que 97% de suas sequências estão defeituosas.
Com sequências intactas encontradas em células T de efeito e memória transitória CD4. Ao tentar este procedimento é importante lembrar que apenas produtos amplificados obtidos na diluição limitante, que é onde não mais de 30 por cento dos poços são positivos, contêm um único provírus. Após este procedimento, os produtos amplificados podem ser sequenciados para determinar a composição genética dos provírus do HIV.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo do HIV explorarem a distribuição de provírus geneticamente intactos do HIV e diferentes tipos de células em pacientes em terapia para determinar onde provírus geneticamente intactos e potencialmente replicantes competentes se escondem. Não se esqueça que trabalhar com células infectadas pelo HIV pode ser perigoso e precauções como usar equipamentos de proteção individual adequados e trabalhar em um laboratório certificado devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
