1. clonagem e geração de linha da pilha
<ol><li>PCR amplificar a região do NBB, correspondente a resíduos de aminoácidos 1-140 (NBB140), do cDNA MLKL humano no quadro padrão baseada em enzimas de restrição clonagem com a proteína de ligação de oligomerização domínio 2 x FK506 (2xFKBP ou 2xFV) e fluorescentes de Venus proteína em doxiciclina (Dox) - inducible vetor retroviral pRetroX-TRE3G para obter o NBB140- 2xFV-Venus (tabela 1, figuras 1A-B).</li>
	<li>Imortalizar primário mlkl- / - ou ripk3- / - mlkl- / - rato embrionários fibroblastos (MEFs) obtidos os respectivos ratos disponíveis no laboratório verde por transfecção transiente com antígeno SV40-grande expressando o plasmídeo. Selecionar células imortalizadas em ~ 1-2 semanas e manter-se em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina e estreptomicina, piruvato de sódio 1 mM e aminoácidos não essenciais em 37 ° C e 5% CO2 em tecido padrão incubadoras de cultura.</li>
	<li>Transduce SV40-imortalizado mlkl- / - MEFs com liberada a tetraciclina reversa controlada (rtTA)-contendo retrovírus expressado de um plasmídeo contendo o gene de resistência de blasticidin (nosso plasmídeo modificado) e tratar para 1 semana com 5 μg/mL blasticidin para selecionar para celulas que expressam estàvel rtTA28.</li>
	<li>Transduce os MEFs rtTA-expressando com o vetor retroviral Dox-inducible contendo o MLKL Quimérico (pRetroX-NBB140-2xFV-Venus-puro) e selecione usando 4 puromicina μg/mL para uma semana, 2 dias depois de transdução.</li>
</ol>2. imagem de microscopia viver-pilha de Necroptosis mediada por MLKL
<ol><li>Placa mlkl- / - MEFs expressando NBB140-2xFV-Vênus em uma densidade de 50.000 células por poço (1 mL/poço) em 24 bem as placas e incubar durante uma noite(Figura 2). Viver-pilha uso coloração para a célula automatizada contagem (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Tratar as células para 12 h com Dox (0.5 μg/mL) para induzir a expressão do NBB140-2xFV-Venus.</li>
	<li>Induzir a necroptosis com dimerizer FKBP 25 nM (Dim) Além de fluorescente verde-membrana impermeável de 25 nM tingir (ver Tabela de materiais) em DMEM padrão (ver 1.2). Células em fase necroptosis acumulam o corante como sua integridade de membrana plasmática é comprometida pelo NBB140-mediada por ruptura. Realize ensaios em triplicado ou quadruplicado.</li>
	<li>Para monitorar necroptosis usando sistemas de imagem single ou duplo-cor (ver Tabela de materiais), coloque os vasos na unidade de imagem respectiva abrigada em uma incubadora de cultura de tecidos de mamíferos.</li>
	<li>Abra o software (consulte a Tabela de materiais) e selecione a guia Agenda Scans programados sob a lista de tarefas. Nota: o presente protocolo é para tratamento de imagens usando sistemas de cor única, mas um software similar está disponível para sistemas dual-cores.</li>
	<li>Selecione a "bandeja, vaso, tipos de varredura" e o padrão de"varredura" na guia "Layout físico" e "Fast fluorescência" na guia Propriedades.</li>
	<li>Adicione o "Scan Time" clicando na janela de "Timeline" e o número total de pontos de tempo e frequência de aquisição (tipicamente 1 aquisição cada 0,5 h a 1 h para 6 h às 12 h, ou a cada 5 min para necroptosis rápido-cinética) e comece a aquisição de imagens, selecionando "App ly"(botão vermelho).</li>
	<li>Quantificar necroptosis usando o software de análise de imagem (consulte a Tabela de materiais), selecionando o "painel de tarefas", "Objeto Counting nova análise com limite fixo de segmentação acima do nível do plano de fundo", que pode ser determinado pelo pairar a cursor do mouse sobre as regiões de fundo em várias imagens usadas na análise.</li>
	<li>Examinar objetos fluorescentes selecionando visualização usando a imagem atual e refinar os níveis de limite conforme necessário.</li>
	<li>Integrar a fluorescência verde contagens abrindo a aba "Lançar nova análise", escolher o "intervalo de tempo", selecione os poços analisados, digite o nome de trabalho"análise" e pressione "Okey".</li>
	<li>Acesso analisou dados da guia "Trabalhos de análise" clicando duas vezes sobre o nome do respectivo trabalho e exportar a partir da janela de gráfico/exportação para análise adicional no software gráfico externo (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Dosar dados como fluorescência verde positivo (+ ve) contagens/mm2 ou normalizar as contagens por confluência e expressar os dados como fluorescência verde + ve contagens/confluência.</li>
	<li>Opcionalmente, no ponto de extremidade experimental, mancha células com 100 nM da membrana-permeant verde fluorescente tintura (ver Tabela de materiais). Normalize os dados às células de necroptotic % como a razão de fluorescência fluorescência verde/verde no ponto de extremidade.</li>
</ol>3. imagem de microscopia Confocal live-célula de recrutamento de membrana plasmática e permeabilização por MLKL
<ol><li>Placa mlkl- / - MEFs expressando NBB140-2xFV-Venus em uma densidade de 20.000 células por poço (0,5 mL/poço) em um copo baixo câmara 4-bem microscopia pré-tratados com 50 µ g/mL fibronectina em PBS a 37 ° C por 30 min e incube por ~ 12 h ( Figura 2B).</li>
	<li>Tratar as células com Dox (0.5 μg/mL) para ~ 12 h induzir a expressão do NBB140-2xFV-Venus.</li>
	<li>Induzir a necroptosis pela incubação com meio fresco (1 mL/poço) contendo 25 nM Dim para induzir NBB140-2xFV-Venus ativação e translocação para a membrana plasmática.</li>
	<li>Coloque a câmara em um laser do disco girando microscópio confocal, construído em uma posição invertida equipada com controle ambiental e um 63 1.4 objetivo at e começar usando o software de escolha de aquisição de imagem (consulte a Tabela de materiais).</li>
	<li>Inicializar o software, selecione o ícone de "Foco" e configuração de filtro YFP (excitação de onda 515 nm).</li>
	<li>Localize o campo de visão e plano focal e envolver o sistema de manutenção de foco usando a guia "Foco definitivo".</li>
	<li>Para começar a aquisição, selecione a guia de "Captura", seguida por atribuição de configuração de filtro apropriado EMCCD câmera exposição tempo e intensificação ganho e parâmetros de aquisição de lapso de tempo, incluindo o intervalo e a duração da aquisição.</li>
	<li>Monitorar celular redistribuição dos fluorescente NBB140-2xFV-proteína de Venus durante necroptosis através da aquisição de imagens a cada 10 s por uma câmera EMCCD usando um laser de 515 nm (1 filme). Nota: O fotobranqueamento é uma preocupação com a imagem de proteína fluorescente. Vênus é uma das mais resistentes proteínas fluorescentes fotobranqueamento29. Se forem utilizadas proteínas fluorescentes que são mais suscetíveis à fotobranqueamento, imagem a cada 30 s ou mais para permitir a recuperação de sinal entre os pontos de tempo de imagem.</li>
	<li>Para monitorar a membrana plasmática associação do NBB140-2xFV-Venus durante necroptosis, imagem a cada 10 s a amostra preparada em 3.3 por fluorescência de reflexão interna total microscopia (TIRF) usando um microscópio equipado com um slider TIRF automatizada e um 100 x 1.4 at objetivo e uma câmera EMCCD (filme 2). Siga os passos 3.5-3.7, mas ajustar o ângulo TIRF dentro guia TIRF foco, de acordo com a espessura de vidro de amostra e na parte inferior da câmara de microscopia. Nota: os marcadores de membrana plasmática como LCK-C-RFP podem ser utilizados como controles para localização da membrana plasmática em análise TIRF.</li>
	<li>Execute o processamento para realçar a qualidade por convolução com a negativa normalizada segunda derivada de uma função gaussiana (algoritmo de Marr) de imagem.</li>
</ol>4. microscopia de elétron
<ol><li>Placa mlkl- / - MEFs expressando NBB140-2xFV-Venus em uma densidade de 5 milhões de células em um plasma-revestido 150 mm placa de cultura de células e incubar durante 12 h (Figura 3).</li>
	<li>Tratar as células com doxiciclina (0.5 μg/mL) para induzir a expressão de NB1-140-2xFV-Venus para 12h.</li>
	<li>Induzir a NBB140-2xFV-Venus ativação e translocação para a membrana plasmática com 25 nM de homodimerizer por 5 min. Desta vez é estabelecida de cinética de necroptosis observados em imagem latente da viver-pilha.</li>
	<li>Remova a mídia e corrigir células usando 10 mL de glutaraldeído 2,5%, paraformaldeído de 2% em 0,1 M de sódio cacodylate tampão pH 7,4 (cacodylate tampão) pré aquecido a 37 ° C.</li>
	<li>Coletar a amostra por raspagem e girar as amostras por 10 min a 500 x g. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>O postfix a amostra por 1,5 h em tetróxido de ósmio reduzido 2% com ferrocianeto de potássio 1,5% em tampão de cacodylate de sódio 0,1 M. Tetróxido de ósmio é um agente de coloração amplamente usado TEM para fornecer contraste. Nós usamos TEM como análise preliminar antes SEM das células, passando por necroptosis.</li>
	<li>Enxágue a amostra 5 vezes em água ultrapura por 5 min cada a 500 x g, seguido de lavagens em buffer (ver 4.6), água e etanol em um processador automático. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Para a SEM, mancha as amostras previamente corrigidas com 1% de uranilo acetato e chumbo aspartato heavy metal mancha31.</li>
	<li>Desidrate as amostras através de uma série graduada de soluções de óxido de álcool e propileno.</li>
	<li>Incorpore a amostra em resina dura32 para obter um bloco de resina.</li>
	<li>Seções de corte espessura de 0.5 μm para determinar a área correta de análise.</li>
	<li>Revesti as amostras com uma ultra fina película de metal eletricamente condutor (Iridium).</li>
	<li>Imagem e analisar as amostras (Figura 3). Para a quantificação, uma imagem de baixa ampliação da superfície do bloco de resina com células expostas é digitalizada em 5 keV usando um microscópio eletrônico.</li>
	<li>Visualizar as células através de imagens individuais, capturadas por SEM ou software de imagem pode ser utilizado para unir vários campos de visão em uma imagem contíguo30. Aproximadamente 100 células podem ser usadas para avaliar a fração de células em fase necroptosis, desta forma gerando uma montagem de alta resolução no software de escolha (ver Tabela de materiais). Nota: Marcar morfologia necrótica por SEM compara características de célula normal com a progressão dos fenótipos pre-necróticos ou necróticos. Esses recursos incluem alterações de membrana plasmática, incluindo o desaparecimento microvilli, achatamento, rupturas em células que variam de 10 nm a 1 µm em tamanho, ou perda da estrutura das organelas através de pelo menos 30 – 40% da área celular citosólica.</li>
</ol>5. lipídios vinculação do MLKL por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR)
<ol><li>Prepare-se 15N-rotulado NBB1-156 pela expressão da proteína padrão e purificação, como descrito anteriormente,24.</li>
	<li>Dissolva 500 µ g de sal de amónio 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (PI 18:0) e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) sal de amónio (18:1 PI) em 500 µ l de gelado CHCl3 cada para concentrações finais de 1 mg/mL.</li>
	<li>Proceda à sonicação 1mg/mL 18:0 e 18:1 PI num banho de água sonication para 1 min à temperatura ambiente ou em até 5 min em uma mistura de água gelada.</li>
	<li>
Alíquota de 1 mg/mL 18:0 e 18:1 PI em frascos de vidro limpo para série de titulação individual NMR (Figura 4). Transferência de lipídios em solventes orgânicos, usando seringas de vidro herméticos.
	<ol>
<li>Alíquota µ l 132 de 1 mg/mL 18:1 PI (massa molar = 880.137 g/mol) em CHCl3 para um volume final de ressuspensão de 1.200 µ l na concentração de 125 µM. Nota: Para tubos de 5mm NMR, preparar volumes de diluição serial de > 1.000 µ l e NMR final da amostra volumes de > 500 µ l. Para tubos de 3 mm NMR, preparar volumes de diluição serial de > 300 µ l e NMR final da amostra volumes de > 150 µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alíquota de 1 mg/mL de suínos no cérebro L-α-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato sal de amónio em 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (cérebro P PI (4,5)2) em frascos de vidro limpo.</li>
	<li>Coloque os frascos sob um fluxo gasoso de argônio (Ar) ou nitrogênio (N2) com fluxo moderado para evaporar o solvente orgânico sem salpicar contra as paredes do frasco de vidro. Cinco a trinta min é normalmente suficiente para volumes de solvente orgânico de 10 a 200 µ l.</li>
	<li>Providenciar conj de vidro no fundo de um balão de vácuo usando uma pinça grande, ou Büchner selar com uma rolha de borracha e prenda o tubo plástico conectado a uma linha de vácuo. Evacue o balão sob vácuo suave durante a noite para remover resíduos orgânicos.</li>
	<li>Sobreposição de alíquotas de filme lipídico com gás inerte, selar com uma tampa hermética e armazenar a-20 ° C para uso dentro de um mês ou -80 ° C para o armazenamento de longo prazo.</li>
	<li>Preparar os buffers de amostra NMR sem detergente (-Det) contendo pH 20 mM ndxHyPO4 6,8, 10% D2Ó e com detergente (+ Det) contendo pH 20 mM ndxHyPO4 6,8, 10% D2O, 0,34 mM n-dodecil-β-D-maltopyranoside (DDM).</li>
	<li>Adicionar + Det buffer para frasco de vidro com película de lipídios para atingir a concentração desejada e proceda à sonicação em banho de água de até 30 min., alternando sonication por 10 min, seguido por inspeção visual. Nota: Sonication pode aquecer a amostra. Deixe arrefecer à temperatura ambiente por 15 minutos antes da reconstituição de amostra de proteína final.</li>
	<li>Realize uma diluição serial de micelas de lipídios-detergente em + Det buffer usando sonication de misturas 1:1 para a série de concentração desejada. A partir da concentração de lipídios 125 µM, três repetições renderá 62,5 µM, 31.3 µM e 15,6 lipídico µM em 0,34 mM DDM.</li>
	<li>Preparar o controle e amostras de NMR de proteína e de aditivos no Det - e + Det amortecedores, respectivamente. Adicione a proteína e aditivos para cada diluição de lipídio em + Det buffer. Nota: Para 15NBB N156, proteína é adicionada a uma concentração final de 40 µM e suplementada com 2mm deuterado ditiotreitol manter resíduos Cys reduzidos.</li>
	<li>Transferi o volume apropriado de amostras de 5 mm ou 3 mm tubos NMR (ver nota na etapa 5.4).</li>
	<li>Carregar amostras em instrumento NMR ou organizar-se em uma plataforma de automação, tais como o carregador de SampleCase manualmente.</li>
	<li>Adquirir o composto espectro RMN usando programas padrão de pulso para espectros de prótons H 1como controle de qualidade, seguido por espectros de correlação 2D 1H -15N quer como espectroscopia de relaxação transversal otimizada (TROSY) ou heteronuclear múltiplas quântica coerência (SOFAST-HMQC)33. Nota: Uso de tubos de 3 mm NMR requer 64 varreduras para 1 H -15N TROSY (~ 3 h) ou 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Varredura de números são cortadas ao meio para tubos de 5mm NMR.</li>
	<li>Espectro de RMN 2D transformados pode ser adicionados a um repositório de CARA34 para análise ou outro software de escolha para o usuário.</li>
	<li>
Analise software, anotando 2D ressonâncias NMR para três picos bem dispersos e resolvidos para cada Estado de proteína. Grave as amplitudes de pico para cada um dos seis picos para cada condição de buffer contendo NBB156 (Figura 5A).
	<ol>
<li>Usar o CARA para preparar uma lista de lote-integração (rubrica clique em Main Menu "espectro | Configurar lista de lote"...) de todos os espectros coletados e analisar usando um arquivo de atribuição único pico (rubrica clique em Main Menu "picos | Peaklist de importação"... e escolher um arquivo definido pelo usuário .peaks com 6 picos totais, 3 para cada Estado de proteína, definidos dentro).</li>
		<li>Ajustar as configurações ("integrador | Ajustar o modelo pico"...) de largura X 0,06 ppm e Y-largura 0,30 ppm (rubrica clique em Main Menu "integrador | Ajustar o modelo pico"...) antes de gravar a saída final em duas seleções de menu (1. Clique Menu principal título "integrador | Integrar a lista de lote") (2. Clique Menu principal título "picos | Exportar tabela de integração") (Figura 5B). Nota: As ressonâncias de amida de espinha dorsal para resíduos M21, V53 e L105 foram atribuídas para o estado de fechado-cinta de156 NBB. O estado aberto-cinta foi atribuído ao ressonâncias de amida de espinha dorsal dos resíduos G130 e A141 e a Épsilon próton cadeia lateral ressonância de W133 usando 3D NMR experimentos24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normalize as amostras para comparação directa de ímãs diferentes ou condições de amostra em média as três amplitudes aberto-cinta das amostras de referência e calculando um fator de normalização, relativos as duas referências. Calcule as amplitudes dimensionadas para ressonâncias de156 NBB usando o fator de normalização e amplitudes negativas de ajuste a zero (tabela 2). Exemplos: 1) comparando amostras de ímãs diferentes: ímã A, NBB156DDM e ímã B, NBB156+ DDM. 2) detergente comparação: 0,34 mM DDM e 1,7 mM DDM.</li>
	<li>Calcular para cada ressonância a fração reduzida da fechado - ou aberto-cinta, dividindo com o intervalo de mínimo para máximo amplitude de todos os espectros coletados contendo referências apropriadas da enciclopédia NBB156 e totalmente aberto-cinta NBB156 em detergente.</li>
	<li>Plotar as amplitudes de NMR normalizadas em função da concentração de lipídios e comparar a fração de aberto-cinta NBB156 em diferentes condições (figura. 5C). Nota: Como alternativa, análise da fração de conformação fechada-Segurem-se contra a concentração de lipídios pode ser realizada para comparar a ligação de lipídios a NBB156. Preferimos a análise anterior, porque é mais rápido e melhores relatórios sobre a fração totalmente-noivos por lipídios.</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Inflammatory+Perspective+on+Necroptosis.">An Inflammatory Perspective on Necroptosis.</a> Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).</li><li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+and+its+role+in+inflammation.">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li><li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+kind+of+cell+suicide:+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis.">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).</li><li>Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+execution+mechanisms+of+necroptosis:+an+overview.">Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase.">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+MLKL+causes+necrotic+membrane+disruption+upon+phosphorylation+by+RIP3.">Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3.</a> Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).</li><li>Cai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+translocation+of+trimerized+MLKL+protein+is+required+for+TNF-induced+necroptosis.">Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+to+plasma+membrane+leads+to+necrotic+cell+death.">Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death.</a> Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).</li><li>Dillon, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+blocks+early+postnatal+lethality+mediated+by+caspase-8+and+RIPK3.">RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3.</a> Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).</li><li>Rickard, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+regulates+RIPK3-MLKL-driven+systemic+inflammation+and+emergency+hematopoiesis.">RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis.</a> Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).</li><li>Kaiser, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+3-mediated+necrosis+via+TRIF,+RIP3,+and+MLKL.">Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).</li><li>Upton, J. W., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAI+Another+Way:+Necroptotic+Control+of+Viral+Infection.">DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection.</a> Cell Host &amp; Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).</li><li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+signalling+is+tuned+by+phosphorylation+of+MLKL+residues+outside+the+pseudokinase+domain+activation+loop.">Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop.</a> Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).</li><li>Quarato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Engagement+of+Distinct+MLKL+Phosphatidylinositol-Binding+Sites+Executes+Necroptosis.">Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis.</a> Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).</li><li>Davies, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brace+helices+of+MLKL+mediate+interdomain+communication+and+oligomerisation+to+regulate+cell+death+by+necroptosis.">The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis.</a> Cell Death &amp; Differentiation. , (2018).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plug+release+mechanism+for+membrane+permeation+by+MLKL.">A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL.</a> Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).</li><li>Dondelinger, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL+compromises+plasma+membrane+integrity+by+binding+to+phosphatidylinositol+phosphates.">MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates.</a> Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).</li><li>Llambi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BOK+Is+a+Non-canonical+BCL-2+Family+Effector+of+Apoptosis+Regulated+by+ER-Associated+Degradation.">BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation.</a> Cell. 165 (2), 421-433 (2016).</li><li>Malkani, N., Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+secrets+of+fluorescent+proteins:+distinct+bleaching+in+various+mounting+fluids+and+photoactivation+of+cyan+fluorescent+proteins+at+YFP-excitation.">Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation.</a> PLoS One. 6 (4), 18586 (2011).</li><li>Perez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+workflow+for+the+automatic+segmentation+of+organelles+in+electron+microscopy+image+stacks.">A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126 (2014).</li><li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lead+aspartate,+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology.">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).</li><li>Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=15N+and+13C-+SOFAST-HMQC+editing+enhances+3D-NOESY+sensitivity+in+highly+deuterated,+selectively+[1H,13C]-labeled+proteins.">15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).</li><li>Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+computer+aided+resonance+assignment+tutorial.">The computer aided resonance assignment tutorial.</a> Cantina Verlag. , (2004).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+sequence+determinants+control+human+and+mouse+receptor+interacting+protein+3+(RIP3)+and+mixed+lineage+kinase+domain-like+(MLKL)+interaction+in+necroptotic+signaling.">Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).</li><li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+the+necroptosis+effector+MLKL.">Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).</li></ol>

Nós fornecemos os protocolos para técnicas que nós combinamos implicados MLKL como o carrasco putativo de ruptura de membrana plasmática24. Além de decifrar a rede regulamentar que regula MLKL-mediada necroptosis, estas técnicas podem ser usadas independentemente para caracterizar outros sistemas biológicos adequados. Praticamente falando, estas técnicas são ferramentas de descoberta de médio para baixo-taxa de transferência.
Rotineiramente usamos imagem late...

Identificar componentes genéticos de necroptosis tem facilitado o uso de modelos animais para testar a implicação de necroptosis em fisiologia e doença1,2,3,4,5. Nocaute de RIPK3 ou MLKL em ratos teve implicação mínima na homeostase desenvolvimento e adulto, sugerindo que necroptosis não é essencial para a vida de3,6. Além disso, certas espécies não contêm genes ou RIPK3 ou MLKL, apoiando o papel de não-essenciais da necroptosis em animais7,8. Por outro lado, desafiar modelos animais nocaute com várias patologias induzidas em laboratório revelou um importante papel de necroptosis na inflamação, imunidade inata e infecção viral9,10, 11 , 12.
Necroptosis podem ser ativadas de várias maneiras por sinalização através de sensores diferentes imunidade inata, todos que se traduzam na ativação de RIPK31,13,14. RIPK3 ativo, por sua vez, fosforila e ativa MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. O mais estudado, e talvez a forma mais complexa, levando à ativação de RIPK3 envolve a morte do receptor da ligadura, que bifurca com base na composição a jusante dos complexos sinalização também induzir apoptose ou necroptosis1. Necroptosis segue-se quando é favorecida e sinalização através de RIPK1 resulta em noivado de RIPK319,20. Este resultado é facilmente favorecido mediante inibição farmacológica ou exclusão genética de caspase 8, um inibidor endógeno putativo de necroptosis que fica necroptosis na baía. RIPK1 liga a e ativa RIPK3. Outra maneira de ativar necroptosis é através de receptores Toll-like TLR3/TLR4 de sinalização, que se envolve e ativa RIPK3 a TIR-domínio-contendo adaptador de indução interferon-β (TRIF)21. Ainda outra forma de morrer por necroptosis é pela ativação do sensor DNA DAI, que diretamente se engaja e ativa RIPK322.
MLKL é uma proteína citosólica, composta de um domínio do N-terminal hélice bundle (NB) e um domínio de pseudokinase C-terminal (psKD) ligados por uma região reguladora chave3. Em células normais, MLKL é encontrado no citosol onde é pensado para ser um complexo inativo com RIPK314. Ativação de necroptosis desencadeia fosforilação de RIPK3 de MLKL no loop ativação do psKD e sites potencialmente adicionais no NB e cinta3,15,23. Fosforilação induz uma mudança conformacional na MLKL que resulta na dissociação do RIPK314. Mudanças conformacionais mal-compreendidos liberar a chave do psKD24. A joelheira, que contém 2 hélices, Medeia oligomerização de MLKL em um trímero putativo através do C-terminal hélice25. A hélice do N-terminal do contraventamento inibe o domínio NB, que é essencial para a membrana permeabilização24,26. Isoladamente, o domínio NB é suficiente para induzir a permeabilização da membrana plasmática e necroptosis16,24,27. A atividade de pro-necroptotic de NB foi reconstituída em fibroblastos embrionários de rato deficientes em MLKL (mlkl- / - MEFs). NB é um domínio de ligação de lipídios que envolve preferencialmente o difosfato de fosfatidilinositol 4,5 de fosfolípidos (PIP2). Propusemos um mecanismo gradual de ativação do MLKL, no qual cinta oligomerização facilita o recrutamento de MLKL para a membrana plasmática através de interações fracas de NB com o PIP2 grupo cabeça polar24. Na membrana, o NB sofre exposição regulamentada de um site adicional de alta afinidade de ligação para PIP2, que é mascarada pelo contraventamento em MLKL inativo. Em geral, as várias interações de NB com PIP2 desestabilizam a membrana plasmática, levando a sua ruptura, embora o mecanismo molecular desses eventos não ter sido elucidado.
Aqui ilustramos métodos específicos usados para caracterizar a função do MLKL como executor do necroptosis24. Em particular, enfocamos o domínio mínimo do MLKL, NB e cinta (NBB), que é regulada pela inibição de contraventamento e pode ser ativadas através de dimerização forçada para induzir necroptosis e ruptura da membrana plasmática. Nós descrevemos o nosso sistema de expressão inducible combinado com forçada induzido FKBP-mediada dimerização para imagem latente da viver-pilha e microscopia eletrônica de células em fase necroptosis. Além disso, ilustramos nossa análise em vitro NMR das interações do NBB com phosphatidylinositols (PIPs).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1175px;" width="1174">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:429px;">Cloning and cell line generation</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:323px;"></td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pRetroX-TRE3G</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tet-On transactivator plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Llambi et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/-</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dillon et al., 2014</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin S Hydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP2647100 CAS#3513-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell death quantification and live-cell microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycycline</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631311 CAS# 24390-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B/B Homodimerizer AP20187</td>
			<td>Takara</td>
			<td>635059 CAS# 195514-80-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYTOX Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syto16</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S7578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NMR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15N Ammonium Chloride</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>NLM-467-10 CAS# 12125-02-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deuterated DTT</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>DLM-2622-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deuterium Oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>617385-1 CAS# 7789-20-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310 CAS# 69227-93-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-&#945;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046X CAS# 383907-42-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850143 CAS# 849412-67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850149 CAS# 799268-53-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Specialized Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IncuCyte FLR or ZOOM</td>
			<td>Essen BioScience, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios NanoLab 660 DualBeam&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Electron microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)</td>
			<td>Essen BioScience, Inc.</td>
			<td>http://www.essenbioscience.com</td>
			<td style="width:193px;">Imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FEI MAPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>https://www.fei.com/software/maps/</td>
			<td style="width:193px;">EM analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TopSpin v3.2</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>http://www.bruker.com</td>
			<td style="width:193px;">NMR data collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CARA v1.9.1.7</td>
			<td></td>
			<td>http://cara.nmr.ch/&#160;</td>
			<td style="width:193px;">NMR data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:429px;">Slidebook</td>
			<td style="width:229px;">3i (Intelligent Imaging Innovations)</td>
			<td style="width:323px;">https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td>
			<td style="width:193px;">Confocal microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of mlkl-mediated plasma membrane rupture in necroptosis

Necroptosis é uma via de morte celular programada desencadeada pela ativação do receptor interagindo proteína quinase 3 (RIPK3), que fosforila e ativa o pseudokinase quinase-como domínio de linhagem mista, MLKL, ruptura ou permeabilize a membrana plasmática . Necroptosis é uma via inflamatória associada com múltiplas patologias, incluindo a auto-imunidade, doenças infecciosas e cardiovasculares, acidente vascular cerebral, neurodegeneração e câncer. Aqui, descrevemos os protocolos que podem ser usados para caracterizar MLKL como o carrasco de ruptura de membrana plasmática em necroptosis. Visualizamos o processo de necroptosis nas células usando a imagem latente da viver-pilha com microscopia de fluorescência confocal e convencional e nas células fixas usando microscopia eletrônica, que juntos, revelou a redistribuição do MLKL do citosol para o plasma membrana antes da indução de grandes buracos na membrana plasmática. Apresentamos em vitro ressonância magnética nuclear (NMR) análise usando lipídios para identificar putativos moduladores de necroptosis MLKL-mediada. Com base neste método, identificamos quantitativas preferências de ligação de lipídios e fosfatos de fosfatidil-inositol (PIPs) como ligantes críticos do MLKL que são necessárias para direcionamento de membrana plasmática e permeabilização em necroptosis.

Visualizar regulamentados necroptosis execução em células vivas foi possível através da expressão inducible de uma construção mínima de MLKL truncada, NBB140-2xFV-Venus. Essa construção mantém a capacidade de induzir a permeabilização da membrana plasmática e é ativada através da oligomerização Dim-induzido da fita FKBP (2xFV). Observamos e quantificar necroptosis por microscopia de viver-pilha de imagem, monitoramento cineticamente (a cada 5 min), a absorç?...

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Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Nós relatamos métodos para a caracterização da ruptura de membrana de plasma MLKL-mediada em necroptosis incluindo imagem de microscopia de viver-pilha convencional e confocal, varredura microscopia eletrônica e vinculação de lipídios NMR-baseado.

Caracterização da ruptura de membrana de Plasma MLKL-mediada em Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

characterization-mlkl-mediated-plasma-membrane-rupture

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K visualizações.  St. Jude Children's Research Hospital. Nós relatamos métodos para a caracterização da ruptura de membrana de plasma MLKL-mediada em necroptosis incluindo imagem de microscopia de viver-pilha convencional e confocal, varredura microscopia eletrônica e vinculação de lipídios NMR-baseado.

Vídeo: Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Medição Perto membrana plasmática e global Dynamics cálcio intracelular em astrócitos

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Biologia

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Taxas de medição de plasma Proteína de membrana endocítica por Biotinilação reversível

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Medição quantitativa do GLUT4 translocação para a membrana plasmática por citometria de fluxo

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Mapeamento de Difusão Molecular na membrana plasmática por Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

A utilização de um robô para alta capacidade de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imagem Plasma Membrane Deformações Com pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Caracterização funcional de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Trocadores de intracelular compartimentos usando a Seleção Proton-matança de expressá-las na membrana plasmática

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Estado fundamental depleção Super-resolução Imaging em células de mamíferos

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...