1. Klonen und Zell-Linie-Generation
<ol><li>PCR verstärken die BNB-Region entspricht Aminosäurereste 1-140 (BNB140), von menschlichen MLKL cDNA für Rahmen standard Restriktionsenzym-basierte Klonen mit Oligomerisierung Domäne 2 x FK506-bindendes Protein (2xFKBP oder 2xFV) und Venus Leuchtstofflampen Protein in Doxycyclin (Dox) - induzierbaren retroviral Vektor pRetroX-TRE3G, BNB140zu erhalten - 2xFV-Venus (Tabelle 1, Figuren 1A-B).</li>
	<li>Primäre Mlkl- /- oder ripk3- / - Mlkl- / - Maus embryonale Fibroblasten (MEFs) erhalten aus den jeweiligen Mäusen, die in das grüne Labor durch Transiente Transfektion mit SV40-große Antigen zu verewigen mit dem Ausdruck Plasmid. Wählen Sie Zellen aus verewigt in ~ 1 – 2 Wochen, und pflegen in DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL Penicillin und Streptomycin, 1 mM Natrium Pyruvat und unwesentlichen Aminosäuren bei 37 ° C und 5 % CO2 im standard Gewebe ergänzt Kultur-Inkubatoren.</li>
	<li>Transduzieren SV40 verewigt Mlkl- / - MEFs mit umgekehrter Tetracyclin kontrollierte transaktivator (RtTA)-enthält Retrovirus von ein Plasmid enthält die Blasticidin-Resistenz-Gen (unsere modifizierte Plasmid) ausgedrückt und Leckerbissen für 1 Woche mit 5 μg/mL Blasticidin für stabil auszudrücken RtTA28Zellen auswählen.</li>
	<li>Transduzieren RtTA exprimierenden MEFs mit Dox-induzierbaren retroviralen Vektors mit der Chimäre MLKL (pRetroX-NBB140-2xFV-Venus-Puro) und wählen Sie mit 4 μg/mL Puromycin für 1 Woche, 2 Tage nach Transduktion.</li>
</ol>2. live-Cell-Mikroskopie-Bildgebung des MLKL-vermittelten Necroptosis
<ol><li>Platte, Mlkl- / - MEFs Ausdruck BNB140-2xFV-Venus bei einer Dichte von 50.000 Zellen pro Bohrloch (1 mL/na) in 24 auch Platten, und über Nacht inkubieren (Abb. 2A). Verwenden Sie Leben-Zelle Färbung für automatisierte Zellzählung (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Zellen für 12 h mit Dox zu behandeln (0,5 μg/mL) induzieren die Expression von BNB140-2xFV-Venus.</li>
	<li>Induzieren Necroptosis mit 25 nM FKBP Dimerizer (Dim) zusätzlich 25 nM Membran undurchlässig grün fluoreszierenden Farbstoff (siehe Tabelle der Materialien) in standard DMEM (siehe 1.2). Zellen Necroptosis akkumulieren den Farbstoff wie ihre Plasmamembran Integrität von BNB140kompromittiert-vermittelte riss. Führen Sie Tests in dreifacher Ausfertigung oder vervierfacht.</li>
	<li>Zur Überwachung der Necroptosis mit einfarbigen oder Dual bildgebende Systeme (siehe Tabelle der Materialien), legen Sie die Schiffe in die jeweiligen Belichtungseinheit, untergebracht in einem Säugetier Gewebekultur-Inkubator.</li>
	<li>Öffnen Sie die Software (siehe Tabelle der Materialien) und wählen Sie die Registerkarte Zeitplan kommenden scannt unter der Aufgabenliste. Hinweis: dieses Protokoll ist für die Bildgebung mit einfarbigen Systemen, aber eine ähnliche Software ist für zwei-Farben-Systeme verfügbar.</li>
	<li>Wählen Sie das "Fach, Schiff, Scantypen", und "Scan-Pattern" in der Registerkarte "Physische Layout" und "Schnell Fluoreszenz" in der Registerkarte "Eigenschaften".</li>
	<li>Fügen Sie die "Scan Zeit" durch Klicken auf das Fenster "Zeitachse" und die Gesamtzahl von Zeitpunkten und Frequenz des Erwerbs (in der Regel 1 Übernahme jeweils 0,5 h bis 1 h 6 h bis 12 h lang alle 5 min für schnelle Kinetik Necroptosis) und wählen Sie "App zunächst Bildaufnahme Ly"(roter Knopf).</li>
	<li>Necroptosis mit der Bildanalyse-Software zu quantifizieren (siehe Tabelle der Materialien) durch Auswahl aus den "Aufgabenbereich", "Counting neue Analyse von Objekten mit festen Segmentierung Schwellenwert über der Hintergrund-Ebene", die ermittelt werden, indem Sie den Cursor der Mauszeiger über Hintergrund Regionen in mehreren Bildern in der Analyse verwendet.</li>
	<li>Prüfen Sie fluoreszierende Objekte durch Auswahl mit aktuellen Bild Vorschau und verfeinern Sie die Schwellenwerte nach Bedarf.</li>
	<li>Integrieren Sie grüne Fluoreszenz zählt durch Öffnen der Registerkarte "Neue Analyse starten" zu, wählen Sie den "Zeitbereich", die Brunnen analysiert werden, geben den Auftragsnamen"Analyse", und drücken "OK".</li>
	<li>Zugang analysiert Daten aus der Registerkarte "Analyse Aufträge" durch einen Doppelklick auf den Namen des jeweiligen Auftrags und aus dem Diagramm/Export-Fenster für die weitere Analyse in externen Grafik-Software exportieren (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Quantitate Daten als grüne Fluoreszenz positiv (+ Ve) zählt/mm2 oder normalisieren die Grafen von Confluence und drücken die Daten als grüne Fluoreszenz + Ve zählt/Zusammenfluss.</li>
	<li>Optional am experimentellen Endpunkt Beflecken Zellen mit 100 nM die Membran-permeationsfähigen grün fluoreszierenden Farbstoff (siehe Tabelle der Materialien). Daten auf % Necroptotic Zellen als das Verhältnis der grünen Fluoreszenz/grüne Fluoreszenz am Endpunkt zu normalisieren.</li>
</ol>3. live-Zelle konfokalen Mikroskopie Bildgebung der Plasmamembran Rekrutierung und Permeabilisierung von MLKL
<ol><li>Platte, Mlkl- / - MEFs Ausdruck BNB140-2xFV-Venus bei einer Dichte von 20.000 Zellen pro Bohrloch (0,5 mL/na) in einem Glas unten 4-Well Mikroskopie Kammer vorbehandelt mit 50 µg/mL Fibronektin in PBS bei 37 ° C für 30 min und ~ 12 h ( inkubieren Abbildung 2B).</li>
	<li>Behandlung der Zellen mit Dox (0,5 μg/mL) für ~ 12 h induzieren die Expression von BNB140-2xFV-Venus.</li>
	<li>Induzieren Necroptosis durch Inkubation mit frischem Medium (1 mL/na) mit 25 nM Dim induzieren BNB140-2xFV-Venus-Aktivierung und Translokation in der Plasmamembran.</li>
	<li>Legen Sie die Kammer auf eine drehenden Scheibe Laserscanning confocal Mikroskop gebaut auf einem umgekehrten Stand ausgestattet mit Umweltkontrolle und ein 63 1,4 NA Ziel und imaging-Erwerb mit Software der Wahl beginnen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Initialisieren der Software, wählen Sie "Focus" Symbol und YFP Filterkonfiguration (Erregung Wellenlänge 515 nm).</li>
	<li>Suchen Sie das Sichtfeld und die Brennebene und engagieren Sie das Wartung-System mithilfe der Registerkarte "Definitive Fokus" zu.</li>
	<li>Um Übernahme zu beginnen, die Registerkarte "Capture" gefolgt von Zuordnung der Filterkonfiguration, geeignete EMCCD Kamera Belichtung Zeit und Intensivierung Verstärkung und Zeitraffer Aufnahmeparameter einschließlich Intervall und Länge des Erwerbs.</li>
	<li>Zelluläre Umverteilung der fluoreszierenden BNB140zu überwachen-2xFV-Venus-Protein während der Necroptosis durch den Erwerb von Bilder alle 10 s mit einer EMCCD Kamera mit einem 515 nm Laser (Film 1). Hinweis: Immunofluoreszenz geht mit fluoreszierenden Proteins Bildgebung. Venus ist eines der widerstandsfähiger fluoreszierende Proteine Immunofluoreszenz29. Fluoreszierende Proteine, anfälliger für Immunofluoreszenz sind, verwendet, Bild alle 30 s oder länger, um die Wiederherstellung des Signals zwischen bildgebenden Zeitpunkten ermöglichen.</li>
	<li>Plasmamembran Verband der BNB140überwachen-2xFV-Venus während Necroptosis, Bild alle 10 s die Probe vorbereitet in 3.3 durch Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie unter Verwendung eines Mikroskops, ausgestattet mit einer automatisierten TIRF-Slider und eine 100 x 1,4 NA Ziel und einer EMCCD Kamera (Film 2). Führen Sie die Schritte 3,5 – 3,7, aber passen Sie den Winkel der TIRF innerhalb der TIRF Fokus Registerkarte nach Probe und unten Glasstärke der Mikroskopie Kammer. Hinweis: Plasmamembran Markierungen wie LCK-C-RFP können als Steuerelemente für die Plasmamembran Lokalisierung in TIRF Analyse verwendet werden.</li>
	<li>Durchführen Sie Bildverarbeitung zur Verbesserung der Qualität durch Faltung mit der negativen normalisierte zweite Ableitung einer Gaußschen Funktion (Marr Algorithmus).</li>
</ol>(4) Elektronenmikroskopie
<ol><li>Platte, Mlkl- / - MEFs Ausdruck BNB140-2xFV-Venus bei einer Dichte von 5 Millionen Zellen in einem Plasma beschichtet 150 mm Zelle Kulturschale und inkubieren Sie für 12 h (Abbildung 3).</li>
	<li>Behandlung der Zellen mit Doxycyclin (0,5 μg/mL) induzieren die Expression von NB1-140-2xFV-Venus für 12 h.</li>
	<li>Induzieren BNB140-2xFV-Venus-Aktivierung und Translokation in der Plasmamembran mit 25 nM Homodimerizer für 5 Minuten. Diesmal wird aus der Kinetik der Necroptosis beobachtet in live Cell Imaging gegründet.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und beheben Zellen mit 10 mL 2,5 % Glutaraldehyd, 2 % Paraformaldehyd in 0,1 M Natrium Cacodylate Puffer pH 7,4 (Cacodylate Puffer) bei 37 ° c vorgewärmt zu</li>
	<li>Sammeln der Probenmaterials durch Schaben und Spinnen die Proben 10 min bei 500 X g. Verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Postfix die Probe für 1,5 h in reduzierten 2 % Osmium ausgefällt mit 1,5 % Kaliumferrocyanid in 0,1 M Natrium Cacodylate Puffer. Osmium ausgefällt ist eine Färbung Agent in TEM Kontrast am meisten benutzt. Wir benutzten TEM als vorläufige Analyse vor SEM der Zelle Necroptosis unterziehen.</li>
	<li>Spülen Sie die Probe 5 Mal in Reinstwasser für 5 min bei 500 X g, gefolgt von Spülungen im Puffer (siehe 4.6), Wasser und Ethanol auf eine automatische Prozessor. Verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Für die SEM Fleck vorher festen Proben mit 1 % Uranyl Acetat und Blei Aspartat-Schwermetall Fleck31.</li>
	<li>Die Proben durch eine abgestufte Reihe von Alkohol und Propylen oxid Lösungen zu entwässern.</li>
	<li>Einbetten der Probenmaterials in harten Harz32 , einen Harz-Block zu erhalten.</li>
	<li>Schneiden Sie dicke Schichten von 0,5 μm zu bestimmen, den richtigen Bereich der Analyse.</li>
	<li>Bestreichen Sie die Proben mit einem hauchdünnen Film von elektrisch leitfähigen Metall (Iridium).</li>
	<li>Image und analysieren die Proben (Abbildung 3). Für die Quantifizierung, ein Low-Vergrößerung Bild der Block Harzoberfläche mit exponierten Zellen wird gescannt, bei 5 keV mit einem Elektronenmikroskop.</li>
	<li>Zellen in einzelne Bilder von SEM zu visualisieren oder imaging-Software genutzt werden kann, um mehrere Felder-of-View in einem zusammenhängenden Bild30beitreten. Etwa 100 Zellen verwendet werden, um den Bruch der Zellen in der Necroptosis auf diese Weise durch die Erzeugung einer hochauflösenden Montage im Software der Wahl zu bewerten (siehe Tabelle der Materialien). Hinweis: Scoring nekrotische Morphologie von SEM normale Zelle Funktionen mit dem Fortschreiten der Pre-nekrotische oder nekrotischen Phänotypen vergleicht. Zu diesen Features gehören Plasmamembran Änderungen einschließlich Mikrovilli verschwinden, Abflachung, Brüche in den Zellen von 10 nm bis 1 µm Größe oder Verlust der Organelle Struktur über mindestens 30 – 40 % der cytosolischen Zellbereich.</li>
</ol>(5) Lipid-Bindung des MLKL durch Kernresonanzspektroskopie (NMR)
<ol><li>15N beschriftet BNB1-156 von standard Protein-Expression und Reinigung wie oben beschrieben24vorzubereiten.</li>
	<li>Auflösen von 500 µg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol Ammoniumsalz (18:0 PI) und 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) Ammoniumsalz (18:1 PI) in 500 µL des eiskalten Kchl3 jeweils für Endkonzentrationen von 1 mg/mL.</li>
	<li>1 mg/mL 18:0 und 18:1 PI im Wasserbad Beschallung für 1 min bei Raumtemperatur beschallen oder bis zu 5 min in ein Eis-Wasser-Gemisch.</li>
	<li>
Aliquoten 1 mg/mL 18:0 und 18:1 PI in sauberes glasvials für individuelle NMR Titration Serie (Abbildung 4). Transfer-Lipide in organischen Lösungsmitteln mit luftdichten Glas Spritzen.
	<ol>
<li>Aliquoten 132 µL 1 mg/mL 18:1 PI (molare Masse = 880.137 g/Mol) in Kchl3 für eine endgültige Wiederfreisetzung Volumen von 1.200 µL bei 125 µM Konzentration. Hinweis: Für 5 mm NMR Röhrchen, bereiten Sie serielle Verdünnung Mengen von > 1.000 µL und endgültige NMR probieren Sie Mengen von > 500 µL. Vorbereitung 3 mm NMR Röhrchen, serielle Verdünnung Datenmengen > 300 µL und endgültige NMR probieren Sie Mengen von > 150 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquoten 1 mg/mL porcinen Gehirn L-α-Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate Ammoniumsalz in 20:9:1 Kchl3/MeOH/H2O (Gehirn PI (4,5) P2) in saubere Glasflaschen.</li>
	<li>Stellen Sie Fläschchen unter einem gasförmigen Strom von Argon (Ar) oder Stickstoff (N2) mit mäßiger Strömung organisches Lösungsmittel verdunsten ohne zu spritzen gegen die Glaswände Fläschchen. 5 bis 30 min ist in der Regel ausreichend für Volumina von 10 bis 200 µL organischen Lösungsmittel.</li>
	<li>Ordnen Sie Glas Ampulle(n) auf Grund einer Büchner oder große Pinzette Isolierflasche mit Gummistopfen verschließen und befestigen Sie Kunststoffschlauch mit einer Vakuumleitung verbunden. Evakuieren Sie Kolben unter milden Vakuum über Nacht, verbleibende organische Stoffe zu entfernen.</li>
	<li>Lipid-Film-Aliquote mit Inertgas überlagert, mit einem luftdichten Deckel verschließen und bei-20 ° C für den Einsatz innerhalb eines Monats oder-80 ° C für die längerfristige Lagerung lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie NMR Probe Puffer ohne Waschmittel (-Det) mit 20 mM NaXHyPO4 pH 6,8, 10 % D2O und Waschmittel (+ Det) mit 20 mM NaXHyPO4 pH 6,8, 10 % D2O, 0,34 mM n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM).</li>
	<li>Hinzufügen + Det Puffer Glasfläschchen mit Lipid-Film auf gewünschte Konzentration zu erreichen und im Wasserbad für bis zu 30 min, abwechselnd Beschallung für 10 min beschallen gefolgt durch Sichtkontrolle. Hinweis: Beschallung kann Probe warm. Raumtemperatur für 15 min vor der endgültigen Protein Probe Rekonstitution abkühlen lassen.</li>
	<li>Führen Sie serielle Verdünnung der Lipid-Reinigungsmittel-Mizellen in + Det Puffer mit Beschallung von 1:1 Mischungen für die gewünschte Konzentration-Serie. Ab 125 µM Lipidkonzentration, werden drei Wiederholungen 62,5 µM, 31,3 µM und 15,6 µM Lipid in 0,34 mM DDM ergeben.</li>
	<li>Bereiten Sie Kontrolle und NMR-Proben von Protein und Zusatzstoffe in - Det zu verweisen und + Det Puffer, beziehungsweise. Protein und Additive zu jeder Verdünnung der Lipid in + Det Puffer hinzufügen. Hinweis: Für 15N BNB156, Protein ist hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 40 µM und ergänzt mit 2 mM deuterierter Dithiothreitol, Cys Rückstände reduziert zu halten.</li>
	<li>Übertragen Sie das entsprechende Volumen der Proben auf 5 mm oder 3 mm NMR Röhrchen (siehe Hinweis im Schritt 5.4).</li>
	<li>Manuell laden Sie Proben in NMR-Gerät oder in ein Automatisierungs-Plattform wie der SampleCase Loader vereinbaren.</li>
	<li>Zusammengesetzte NMR-Spektren mit standard Puls-Programme für 1H Proton Spektren als Qualitätskontrolle gefolgt von 2D 1H -15N Korrelation Spektren entweder als transversale Entspannung optimiert Spektroskopie (TROSY) zu erwerben oder Heteronuclear mehrere Quantum Kohärenz (SOFAST-HMQC)33. Hinweis: Verwendung von 3 mm NMR Röhrchen erfordert 64 Scans für 1 H -15N TROSY (~ 3 h) oder 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Scan-Nummern sind für 5 mm NMR Röhrchen halbiert.</li>
	<li>Verarbeitete 2D NMR-Spektren können eine CARA Repository34 zur Analyse oder anderer Software der Wahl für den Benutzer hinzugefügt werden.</li>
	<li>
Analysieren Sie Software, indem Sie kommentieren 2D NMR-Resonanzen für drei gut dispergierte und gelöst Spitzen für jedes Protein-Staat. Notieren Sie die Peak-Amplituden für jede der sechs Gipfel für jeden Puffer Zustand mit BNB156 (Abb. 5A).
	<ol>
<li>CARA verwenden, um eine Batch-Integration-Liste erstellen (Klicken Sie auf Main Menu Rubrik "Spektrum | Setup-Batch-Liste"...) Alle Spektren gesammelt und zu analysieren, mit einer einzigen Spitze Aufgabendatei (Klicken Sie auf Main Menu Überschrift "Gipfel | Importieren Sie Peaklist"... ...und wählen Sie eine benutzerdefinierte .peaks-Datei mit 6 total Gipfeln, 3 für jedes Protein Staates innerhalb definiert).</li>
		<li>Feinabstimmung der Einstellungen vornehmen ("Integrator | Tune Peak Modell"...) der X-Breite 0,06 ppm und Y-Breite 0,30 ppm (Klicken Sie auf Main Menu Überschrift "Integrator | Tune Peak Modell"...) vor der Aufnahme der endgültigen Ausgabe in zwei Menüauswahl (1.) Klicken Sie auf Main Menu Überschrift "Integrator | Integrieren Sie Batch-Liste") (2. Klicken Sie auf Main Menu Überschrift "Gipfel | Integration-Tabelle exportieren") (Abb. 5B). Hinweis: Die Rückgrat Amid Resonanzen für Rückstände M21, V53 und L105 wurden für den BNB156 geschlossen-Brace Staat zugewiesen. Der Open-Brace-Staat war Rückgrat Amid Resonanzen von Rückständen G130 und A141 und Epsilon Proton Sidechain-Resonanz der W133 mit 3D NMR-Experimente-24zugeordnet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normalisieren Sie Proben für den direkten Vergleich von verschiedenen Magneten oder Probe Bedingungen durch Mittelung der drei Open-Brace Amplituden der Referenzproben und berechnen einen Normalisierungsfaktor im Zusammenhang mit den beiden Referenzen. Berechnen Sie die skalierten Amplituden für BNB156 Resonanzen mit den Normalisierungsfaktor und Einstellung negative Amplituden auf NULL (Tabelle 2). Beispiele: (1) Vergleich von Proben aus verschiedenen Magneten: Magnet A, BNB156DDM und Magnet B, BNB156+ DDM. (2) Waschmittel Vergleich: 0,34 mM DDM und 1,7 mM DDM.</li>
	<li>Berechnen Sie für jede Resonanz, dass die skalierte Bruchteil des geschlossen - oder Open-Klammer durch Division mit der Palette von Mindest-und maximale Amplitude der alle Spektren enthalten entsprechende Hinweise frei BNB156 und vollständig offen-Brace BNB156 in gesammelt Waschmittel.</li>
	<li>Die normalisierte NMR-Amplituden als Funktion der Lipidkonzentration des Grundstückes und vergleichen den Bruchteil der öffnen-Brace BNB156 unter verschiedenen Bedingungen (Abbildung. 5 C). Hinweis: Alternativ kann Analyse des Bruchs der geschlossen-Brace Konformation gegen Lipidkonzentration durchgeführt werden um Lipid Bindung an BNB156zu vergleichen. Wir bevorzugen die frühere Analyse, weil es schneller und bessere Berichte auf den Bruch-durch Lipide engagiert.</li>
</ol>

<ol>
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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+blocks+early+postnatal+lethality+mediated+by+caspase-8+and+RIPK3.">RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3.</a> Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).</li><li>Rickard, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+regulates+RIPK3-MLKL-driven+systemic+inflammation+and+emergency+hematopoiesis.">RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis.</a> Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).</li><li>Kaiser, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+3-mediated+necrosis+via+TRIF,+RIP3,+and+MLKL.">Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).</li><li>Upton, J. W., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAI+Another+Way:+Necroptotic+Control+of+Viral+Infection.">DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection.</a> Cell Host &amp; Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).</li><li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+signalling+is+tuned+by+phosphorylation+of+MLKL+residues+outside+the+pseudokinase+domain+activation+loop.">Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop.</a> Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).</li><li>Quarato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Engagement+of+Distinct+MLKL+Phosphatidylinositol-Binding+Sites+Executes+Necroptosis.">Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis.</a> Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).</li><li>Davies, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brace+helices+of+MLKL+mediate+interdomain+communication+and+oligomerisation+to+regulate+cell+death+by+necroptosis.">The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis.</a> Cell Death &amp; Differentiation. , (2018).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plug+release+mechanism+for+membrane+permeation+by+MLKL.">A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL.</a> Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).</li><li>Dondelinger, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL+compromises+plasma+membrane+integrity+by+binding+to+phosphatidylinositol+phosphates.">MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates.</a> Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).</li><li>Llambi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BOK+Is+a+Non-canonical+BCL-2+Family+Effector+of+Apoptosis+Regulated+by+ER-Associated+Degradation.">BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation.</a> Cell. 165 (2), 421-433 (2016).</li><li>Malkani, N., Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+secrets+of+fluorescent+proteins:+distinct+bleaching+in+various+mounting+fluids+and+photoactivation+of+cyan+fluorescent+proteins+at+YFP-excitation.">Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation.</a> PLoS One. 6 (4), 18586 (2011).</li><li>Perez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+workflow+for+the+automatic+segmentation+of+organelles+in+electron+microscopy+image+stacks.">A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126 (2014).</li><li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lead+aspartate,+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology.">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).</li><li>Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=15N+and+13C-+SOFAST-HMQC+editing+enhances+3D-NOESY+sensitivity+in+highly+deuterated,+selectively+[1H,13C]-labeled+proteins.">15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).</li><li>Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+computer+aided+resonance+assignment+tutorial.">The computer aided resonance assignment tutorial.</a> Cantina Verlag. , (2004).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+sequence+determinants+control+human+and+mouse+receptor+interacting+protein+3+(RIP3)+and+mixed+lineage+kinase+domain-like+(MLKL)+interaction+in+necroptotic+signaling.">Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).</li><li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+the+necroptosis+effector+MLKL.">Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).</li></ol>

Wir bieten Protokolle für Techniken, die wir zusammen als die vermeintliche Henker der Plasmamembran Bruch24MLKL verwickelt. Neben der Entschlüsselung der regulatorischen Netzwerk, das MLKL-vermittelten Necroptosis regelt, können diese Techniken unabhängig verwendet werden, andere geeignete biologische Systeme zu charakterisieren. Praktisch gesehen, sind diese Techniken Medium zu niedrigen Durchsatz Discovery-Tools.
Wir haben routinemäßig verwendet live Cell Imagi...

Identifizierung von genetischen Komponenten des Necroptosis hat die Verwendung von Tiermodellen, die Implikation des Necroptosis in Physiologie und Krankheit1,2,3,4,5testen erleichtert. Ko von RIPK3 oder MLKL bei Mäusen hatten minimal Implikation in Entwicklung und Erwachsenen Homöostase, was darauf hindeutet, dass diese Necroptosis nicht für wichtig Leben3,6. Darüber hinaus enthalten bestimmte Arten entweder RIPK3 oder MLKL Gene, Unterstützung der unwesentliche Rolle der Necroptosis in Tiere7,8. Auf der anderen Seite hat anspruchsvolle ko Tiermodellen mit verschiedenen Pathologien im Labor induziert eine wichtige Rolle bei Entzündungen, angeborene Immunität und Virusinfektion9,10, Necroptosis ergeben 11 , 12.
Necroptosis kann auf verschiedene Weise durch Signalisierung durch verschiedene angeborene Immunität Sensoren aktiviert werden alle die sich bei der Aktivierung von RIPK31,13,14. Aktive RIPK3 wiederum phosphorylates und aktiviert MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. Die meisten studierte, und vielleicht der komplexeste Weg, führt zu einer Aktivierung des RIPK3 beinhaltet Tod Rezeptor Ligatur, die gabelt basierend auf die nachgelagerten Zusammensetzung der Signalisierung komplexe entweder induzieren Apoptose oder Necroptosis1. Necroptosis entsteht, wenn durch RIPK1 Signalisierung begünstigt wird und zu Engagement von RIPK319,20 führt. Dieses Ergebnis ist leicht begünstigt auf pharmakologische Hemmung oder genetische Löschung von Caspase 8, eine vermeintliche endogener Inhibitor des Necroptosis, die Necroptosis in Schach hält. RIPK1 bindet an und aktiviert RIPK3. Eine weitere Möglichkeit, Necroptosis zu aktivieren ist durch Toll-Like-Rezeptoren TLR3/TLR4 Signaltechnik, die eingreift und aktiviert RIPK3 durch TIR-Domain-haltigen Adapter-induzierende Interferon-β (SIMPE)21. Noch ist eine andere Art zu sterben durch Necroptosis durch Aktivierung der DNA-Sensor DAI, der direkt eingreift und aktiviert RIPK322.
MLKL ist ein cytosolischen Protein, bestehend aus einer N-terminalen Helix-Bundle (NB)-Domäne und einer C-terminalen Pseudokinase Domäne (PsKD) durch eine regulatorische Klammer Region3verbunden. In normalen Zellen ist MLKL in das Zytosol gefunden wo es angenommen wird, in einem inaktiven Komplex mit RIPK314. Aktivierung des Necroptosis löst RIPK3 Phosphorylierung des MLKL in der Aktivierung der PsKD und möglicherweise weitere Standorte in der NB und Klammer3,15,23. Phosphorylierung bewirkt eine Konformationsänderung in MLKL, der Dissoziation von RIPK314führt. Schlecht verstandene Konformationsänderungen lassen Sie die Klammer aus dem PsKD24. Die Klammer, die 2 Helices enthält, vermittelt Oligomerisierung von MLKL in einem vermeintlichen Trimer durch die C-terminale Helix25. Die N-terminale Helix der Orthese hemmt die NB-Domäne, die für Membran Permeabilisierung24,26unerlässlich. Isoliert reicht die NB Domäne Permeabilisierung der Plasmamembran und Necroptosis16,24,27induzieren. Die Pro-Necroptotic-Aktivität der NB wurde in Maus einen Mangel an MLKL (Mlkl- / - MEFs) embryonalen Fibroblasten rekonstituiert. NB ist ein Lipid-bindende Domäne, die bevorzugt die Phospholipid-Phosphatidylinositol-4,5-Diphosphat (PIP2) eingreift. Wir haben einen schrittweisen Mechanismus der Aktivierung des MLKL, wobei Klammer Oligomerisierung erleichtert die Einstellung des MLKL in der Plasmamembran über schwachen Wechselwirkungen der NB mit dem PIP2 polare Kopfgruppe24vorgeschlagen. An der Membran erfährt die NB geregelten Exposition eine zusätzliche High-Affinity-Bindungsstelle für PIP2, die durch die Orthese in inaktiven MLKL maskiert wird. Insgesamt destabilisieren mehrere Interaktionen der NB mit PIP2 der Plasmamembran zu seinen Bruch, obwohl der molekulare Mechanismus dieser Ereignisse sind nicht geklärt.
Hier zeigen wir spezifische Methoden verwendet, um die Funktion des MLKL als Vollstrecker des Necroptosis24charakterisieren. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die minimalsten Domain MLKL, NB und Klammer (NBB) die Klammer Hemmung unterliegt und durch erzwungene Dimerisierung induzieren Plasmamembran Bruch und Necroptosis aktiviert werden können. Wir beschreiben unsere induzierbaren Expressionssystems kombiniert mit erzwungenen drogeninduzierte FKBP-vermittelte Dimerisierung für live Cell Imaging und Elektronenmikroskopie der Zellen Necroptosis. Darüber hinaus zeigen wir unsere in-vitro- NMR-Analyse der Interaktionen der BNB mit Phosphatidylinositols (PIPs).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1175px;" width="1174">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:429px;">Cloning and cell line generation</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:323px;"></td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pRetroX-TRE3G</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tet-On transactivator plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Llambi et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/-</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dillon et al., 2014</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin S Hydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP2647100 CAS#3513-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell death quantification and live-cell microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycycline</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631311 CAS# 24390-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B/B Homodimerizer AP20187</td>
			<td>Takara</td>
			<td>635059 CAS# 195514-80-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYTOX Green</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syto16</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S7578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NMR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15N Ammonium Chloride</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>NLM-467-10 CAS# 12125-02-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deuterated DTT</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>DLM-2622-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deuterium Oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>617385-1 CAS# 7789-20-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310 CAS# 69227-93-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-&#945;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046X CAS# 383907-42-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850143 CAS# 849412-67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850149 CAS# 799268-53-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Specialized Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IncuCyte FLR or ZOOM</td>
			<td>Essen BioScience, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios NanoLab 660 DualBeam&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Electron microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)</td>
			<td>Essen BioScience, Inc.</td>
			<td>http://www.essenbioscience.com</td>
			<td style="width:193px;">Imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FEI MAPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>https://www.fei.com/software/maps/</td>
			<td style="width:193px;">EM analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TopSpin v3.2</td>
			<td>Bruker BioSpin</td>
			<td>http://www.bruker.com</td>
			<td style="width:193px;">NMR data collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CARA v1.9.1.7</td>
			<td></td>
			<td>http://cara.nmr.ch/&#160;</td>
			<td style="width:193px;">NMR data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:429px;">Slidebook</td>
			<td style="width:229px;">3i (Intelligent Imaging Innovations)</td>
			<td style="width:323px;">https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td>
			<td style="width:193px;">Confocal microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of mlkl-mediated plasma membrane rupture in necroptosis

Necroptosis ist ein programmierter Zelle Tod Weg, ausgelöst durch die Aktivierung des Rezeptors Interaktion Proteinkinase 3 (RIPK3), die phosphorylates und aktiviert die gemischte Abstammung Kinase-ähnliche Domäne Pseudokinase, MLKL, Bruch oder permeabilize der Plasmamembran . Necroptosis ist eine entzündliche Weg mehrere Pathologien einschließlich Autoimmunität, infektiöse und Herz-Kreislauferkrankungen, Schlaganfall, Neurodegeneration und Krebs zugeordnet. Hier beschreiben wir Protokolle, die verwendet werden, um MLKL als der Henker der Plasmamembran Bruch in Necroptosis zu charakterisieren. Wir visualisieren den Prozess der Necroptosis in Zellen mittels live Cell Imaging mit konventionellen und konfokale Fluoreszenzmikroskopie und in festen Zellen mittels Elektronenmikroskopie, die zusammen die Umverteilung von MLKL aus dem Zytosol in das Plasma enthüllt Membran vor Induktion von großen Löchern in der Plasmamembran. Wir präsentieren in Vitro Kernspinresonanz (NMR) Analyse mit Lipiden, um vermeintliche Modulatoren des MLKL-vermittelten Necroptosis zu identifizieren. Basierend auf dieser Methode, identifizierten wir quantitative Lipid-verbindliche Präferenzen und Phosphatidyl-Inositol Phosphate (PIPs) als kritische Bindemittel der MLKL, die für die Plasmamembran targeting und Permeabilisierung in Necroptosis erforderlich sind.

Visualisierung von regulierten Necroptosis Ausführung in lebenden Zellen wurde möglich durch induzierbaren Ausdruck eines minimalen abgeschnittene MLKL Konstrukts, BNB140-2xFV-Venus. Dieses Konstrukt behält die Fähigkeit, Plasmamembran Permeabilisierung induzieren und durch Dim-induzierte Oligomerisierung FKBP-Kassette (2xFV) aktiviert ist. Wir beobachten und Quantifizierung der Necroptosis durch live-Cell-Mikroskopie imaging, Überwachung kinetisch (alle 5 min) die Aufnahm...

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Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Wir berichten Methoden zur Charakterisierung von MLKL-vermittelten Plasmamembran Bruch in Necroptosis einschließlich konventioneller und konfokale live-Cell-Mikroskopie Bildgebung, Scannen, Elektronenmikroskopie und NMR-basierte Lipid-Bindung.

Charakterisierung der MLKL-vermittelten Plasmamembran Bruch in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

characterization-mlkl-mediated-plasma-membrane-rupture

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Aufrufe.  St. Jude Children's Research Hospital. Wir berichten Methoden zur Charakterisierung von MLKL-vermittelten Plasmamembran Bruch in Necroptosis einschließlich konventioneller und konfokale live-Cell-Mikroskopie Bildgebung, Scannen, Elektronenmikroskopie und NMR-basierte Lipid-Bindung.

Serie: Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Forschung

Biologie

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Quantitative Messung der GLUT4 Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Mapping molekulare Diffusion in der Plasmamembran durch Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Die Cell-basierten L-Glutathion Schutz Assays zur Endozytose und Recycling von Plasmamembranproteinen Studieren

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasmamembran Verformungen Mit pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Funktionelle Charakterisierung von Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Wärmetauscher von intrazellulären Kompartimente Mit Proton-Tötung Selection man sie an der Plasmamembran Express

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Mikroperfusion Technik zur Untersuchung von Mikrogefäßdurchlässigkeit Verordnung in Rattengekröse

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...