Este protocolo fornece uma compreensão multifacetada da ativação dos processos de morte celular, o que pode fornecer insights críticos sobre os mecanismos da doença e informar estratégias terapêuticas. Este protocolo baseia-se no uso de uma técnica mais simples e para acessar a ativação de múltiplas caspases imperativas a partir de uma única população de células endógenas para determinar grandemente a ativação. A morte de células imunes inatas tem sido implicada em todo o espectro da doença, de infecções a doenças inflamatórias e cânceres.
Compreender os mecanismos moleculares da morte celular através da ativação da caspase pode fornecer insights críticos sobre os processos da doença. O Dr. Julieann, pesquisador associado de pós-doutorado de um laboratório, demonstrará o procedimento. Após isolar a medula óssea e diferenciar as BMDMs, infectar as células com o vírus influenza A.
Calcule o volume de vírus necessário em uma multiplicidade de infecção de 20 unidades formadoras de placas. Remova o meio dos BMDMs e lave as células uma vez com 500 microlitros de PBS. Adicione 450 microlitros de vírus Influenza A em DMEM de alta glicose sem FBS inativado por calor a cada poço e incube as placas a 37 graus Celsius por uma hora em uma incubadora umidificada para permitir a absorção.
Ao final da incubação de uma hora, adicione 50 microlitros de FBS inativado pelo calor e devolva as placas à incubadora a 37 graus Celsius por um total de 12 horas. Após 12 horas de incubação, retire a placa da incubadora. Aspirar 150 microlitros do sobrenadante e descartá-lo ou guardá-lo para análise do sobrenadante.
Não remova o sobrenadante restante. Agora, crie a solução de coleta de proteínas combinando 50 microlitros de tampão de lise de caspase e 100 microlitros de quatro tampões XSDS por poço. Em seguida, adicione 150 microlitros da mistura a cada poço.
Para cada poço, pipete a mistura para coletar as células lisadas e o sobrenadante. Durante a pipetagnação, raspe o fundo do poço com a ponta da pipeta para interromper as células. Após a raspagem e pipetagem, colete o lisado de proteína em tubos de 1,5 mililitro rotulados.
Usando um bloco de calor, aqueça todos os tubos a 100 graus Celsius por 12 minutos. Retire os tubos do bloco de calor e centrifuja a 14.500 G durante 30 segundos à temperatura ambiente para peltar quaisquer componentes insolúveis. Preparar o aparelho de eletroforese com um gel de poliacrilamida a 12% com 10 orifícios.
Encha o aparelho de eletroforese com tampão de funcionamento e remova o pente de gel. Em seguida, aqueça as amostras a 100 graus Celsius por cinco minutos. Centrifugar as amostras a 14, 500 G durante 30 segundos à temperatura ambiente antes de carregar.
Em seguida, carregue lentamente 30 microlitros da amostra em cada poço. Use o sobrenadante combinado e o tampão de lisado proteico e lisato de caspase ou o homogeneizado tecidual para caspase 1, 3, 7 e 8 blots, e use o tampão de proteína lisado DN RIPA descrito no protocolo ou o homogeneizado tecidual para caspase 11 e 9. Para avaliar todas as seis caspases de uma só vez, use o mesmo procedimento para carregar as mesmas amostras em cada um dos seis géis.
Conecte o aparelho de eletroforese à fonte de alimentação e ajuste a energia para 80 volts por 20 minutos para iniciar a corrida do gel. Após os 20 minutos iniciais, ajuste a potência para 100 volts por 45 a 60 minutos. Observe a frente do corante.
Quando a frente do corante atingir o fundo do gel, desligue a energia. Enquanto o gel é executado, prepare o buffer de transferência conforme descrito no manuscrito. Torne a solução fresca a cada vez.
Remova o gel do aparelho de eletroforese usando o liberador de gel. Para configurar a pilha de transferência para o gel, ative uma membrana PVDF mergulhando-a em metanol por um minuto. Pré-molhar dois pedaços de papel de filtro, o gel e a membrana de PVDF e tampão de transferência por cinco minutos.
Mantenha a membrana e o gel PVDF em recipientes separados durante esta incubação de cinco minutos. Comece a montar a pilha de transferência no sistema semi-seco. No lado inferior do nano de platina, coloque um pedaço de papel de filtro, a membrana PVDF, o gel e, finalmente, um pedaço de papel de filtro.
Estenda ou pressione suavemente as bolhas de ar entre as camadas e feche a parte superior do sistema. Agora, conecte-se à fonte de alimentação. Ajuste a potência para 25 volts por 40 minutos.
Após a transferência, desmonte a pilha de transferência, colete a membrana e coloque-a em uma placa de Petri quadrada. Em seguida, execute o bloqueio da membrana adicionando 15 mililitros de uma solução de leite desnatado a 5% e incube a membrana em um agitador de balanço a 50 a 70 RPM à temperatura ambiente por uma hora. Após a incubação, remova a solução de bloqueio, adicione 10 mililitros da solução de anticorpos diluídos e incube por duas horas à temperatura ambiente ou quatro graus Celsius durante a noite em um agitador de balanço, como demonstrado anteriormente.
Em seguida, recolha a solução de anticorpos e lave a membrana adicionando 15 mililitros de TBST à membrana num agitador de balanço à temperatura ambiente durante 10 minutos. Descarte o TBST. Repita a lavagem com 15 mililitros de TBST três vezes.
Adicionar 10 mililitros da solução de anticorpos conjugados HRP secundários diluídos. Incubar num agitador à temperatura ambiente durante uma hora. No final da incubação, uma vez que a solução de anticorpos é removida, lave a membrana adicionando 15 mililitros de TBST em um agitador de balanço à temperatura ambiente por 10 minutos.
Depois de completar as etapas de lavagem e remover o TBST, adicione 10 mililitros do substrato HRP de alta sensibilidade. Deixe descansar à temperatura ambiente durante um minuto. Remova a membrana do substrato.
Prossiga diretamente para a imagem usando um imageador de quimioluminescência com a bandeja trans branca acessória inserida na posição inferior. Exponha a membrana usando o modo de exposição automática. São analisadas as caspase pró e ativada 1, 11, 3, 7, 8 e 9 no tipo selvagem e mutante ZBP1 após infecção pelo vírus Influenza A, tipo selvagem e mutante AIM2 após infecção por HSV1 e infecção por Francisella novicida, ou BDMs mutantes do tipo selvagem e NLRP3 após estimulação com lipopolissacarídeo e ATP.
As células sem sensores de PANoptosis a montante não sofrem morte celular robusta em resposta aos estímulos cognatos indutores de PANoptosis. A infecção pelo vírus influenza A induz a formação do ZBP1-PANoptosome e as células deficientes em ZBP1 são significativamente protegidas da morte celular durante a infecção pelo vírus Influenza A. Da mesma forma, as infecções por HSV1 e Francisella novicida induzem a formação do PANoptossomo AIM2, e as células deficientes em AIM2 não sofrem morte celular robusta em resposta a essas infecções.
As células sem sensores de inflamassoma a montante são protegidas da morte celular em resposta aos seus respectivos estímulos, e as células deficientes em NLRP3 não sofrem morte celular em resposta ao lipopolissacarídeo e ATP. É importante lembrar de preparar uma mistura de lisado celular para determinar uma caspase específica. Após o carregamento do jato, a amostra luminosa deve ser armazenada menos 20 graus para manter a integridade dos objetivos da caspase para acompanhamento Em conjunto com este protocolo, imagens de morte celular em tempo real ou ensaios de LDH podem ser usados para monitorar a execução da morte celular, e ELIZAs podem ser usados para verificar a liberação de citocinas ou DAMPs de células submetidas a diferentes tipos de morte celular.
