Este trabalho foi apoiado por concessões do departamento de defesa (DoD) nos exército pesquisa médica e Materiel comando (USAMRMC) Congressional dirigido Medical Research programas (CDMRP) (PR121604) e os institutos nacionais de artrite e osteomuscular e dermatoses (NIAMS), NIH R01 AR068332 para Uma Sankar.

O procedimento a seguir foi realizado com a aprovação do Comitê de uso (IACUC) e Indiana universidade escola de medicina institucional Cuidado Animal. Todas as cirurgias de sobrevivência foram realizadas sob condições estéreis, conforme descrito pelas diretrizes do NIH. Dor e risco de infecções eram geridas com adequada analgésicos e antibióticos para garantir um resultado positivo.
1. anestesia e preparação
<ol><li>Pesar o mouse e anestesiá-lo com uma mistura de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) administrada através de via intraperitoneal (I.P.). Coloque o mouse em uma gaiola vazia e monitorá-lo até que está totalmente sedado.</li>
	<li>Certifique-se de que o mouse está sedado usando um reflexo de pitada de dedo do pé. Aplica a pomada oftálmica para seus olhos para protegê-los da secagem.</li>
	<li>Retire a pele da extremidade direita. Limpe o local cirúrgico com um etanol de esfoliação e 70% à base de iodo. Esfregue o local cirúrgico, começando no centro do joelho e fazer uma varredura circular para fora. Repita este 3x com scrubs frescos, terminando com etanol a 70%.</li>
	<li>Administre uma dose pré-operatória de analgesia de cloridrato de buprenorfina (0,03 mg/kg) por via subcutânea para a gestão da dor no pós-operatório imediato.</li>
	<li>Coloque o mouse sobre uma almofada de aquecimento, coberta por um bloco cirúrgico estéril.</li>
</ol>2. abordagem cirúrgica
Nota: Antes da fratura, o peso e a altura de queda devem ser empiricamente determinadas para a cepa específica, idade e sexo dos ratos antes da cirurgia. Este procedimento cirúrgico é otimizado para camundongos machos C57BJ6 com 10 semanas de idade.
<ol><li>Coloque o mouse sobre as costas e flexionar o joelho da perna operativa. Usando uma lâmina de bisturi, faça uma incisão de 1,5 cm, centralizada sobre a articulação do joelho.</li>
	<li>Deslocar lateralmente à patela usando fórceps para expor a extremidade distal do fêmur. Inserir a agulha hipodérmica 1.5 - em aço inoxidável de longa 25 gauge no centro do sulco troclear, ao longo do canal medular de forma retrógrada e através da extremidade proximal do fêmur. Tire um raio-x para garantir a colocação apropriada do pino. Nota: A agulha deve sair do lado dorsal do mouse para criar um caminho para o fio-guia.</li>
	<li>Passe um fio-guia do tungstênio calibre 36 tempo 4 - na através do eixo da agulha, entrando através do hub no fêmur distal e saindo o chanfro do lado dorsal do mouse.</li>
	<li>Após a colocação bem sucedida do fio-guia, remova cuidadosamente a agulha de calibre 25 puxando suavemente no hub, mantendo o membro e o fio-guia no lugar. Confirme a colocação do fio-guia por raios-x.</li>
	<li>Segure um peso de 391 g de uma altura de 34,6 cm acima do disco de impacto (figura 1A). Posição do fêmur horizontalmente através de dois suportar pontos, tal que as regiões intertrocantérica e supracondilianas do fêmur descansar sobre os batentes de apoio (figura 1B) e o lado lateral do membro é virado para o ponto de carregamento (Figura 1 ). Largar o peso e Retire cuidadosamente o mouse do dispositivo imediatamente após a fratura.</li>
	<li>Confirme o local da fratura por raios-x.</li>
	<li>Insira o tubo de aço inoxidável de calibre 24 hipodérmico sobre o guia para estabilizar o fêmur fraturado. Nota: Este aplicativo pode exigir alguma força como o ponto de entrada foi gerado usando uma agulha de diâmetro menor. Esta diferença de diâmetro efetivamente impede uma migração potencial da haste calibre 24 através da extremidade proximal do fêmur. A profundidade de inserção pode ser sentida manualmente como a tubagem romba encontra o osso cortical do grande trocanter.</li>
	<li>Confirme a posição da haste de aço e a estabilização do fêmur fraturado por raio-x antes de remover o fio-guia.</li>
	<li>Corte o tubo em excesso na extremidade distal do fêmur usando cortadores de fio. Enterre os tubos expostos sob a superfície dos côndilos usando fórceps para aplicar uma força descendente suave, tomando cuidado para não deslocar a articulação do joelho.</li>
	<li>Reposicione a patela usando fórceps. Feche o local da incisão com uma sutura absorvível de 5-0.</li>
</ol>3. pós-operatórios
<ol><li>Após a cirurgia, os ratos podem ser injetados com até 500 µ l de estéril salina através da rota I.P. para ajuda-los na sua recuperação pós-operatória.</li>
	<li>Monitore os animais em uma cama de recuperação aquecida até que eles despertam da cirurgia. Uma vez ambulatorial, devolvê-los à sua jaula.</li>
	<li>Continue a acompanhar de perto os ratos durante vários dias após a cirurgia para garantir que eles são a cura adequadamente e recuperar a mobilidade. Administre analgesia de cloridrato de buprenorfina (0,03 mg/kg) por via subcutânea cada 6 h durante 3 dias após a cirurgia e conforme necessário depois disso. Evite o uso de drogas antiinflamatórias não-esteroides (AINEs), como eles têm sido mostrados para prejudicar a consolidação óssea após a cirurgia.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schnell, S., Friedman, S. M., Mendelson, D. A., Bingham, K. W., Kates, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+1-Year+Mortality+of+Patients+Treated+in+a+Hip+Fracture+Program+for+Elders.">The 1-Year Mortality of Patients Treated in a Hip Fracture Program for Elders.</a> Geriatric Orthopaedic Surgery &amp; Rehabilitation. 1 (1), 6-14 (2010).</li><li>Burge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+economic+burden+of+osteoporosis-related+fractures+in+the+United+States,+2005-2025.">Incidence and economic burden of osteoporosis-related fractures in the United States, 2005-2025.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 22 (3), 465-475 (2007).</li><li>Cunningham, B. P., Brazina, S., Morshed, S., Miclau, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+healing:+A+review+of+clinical,+imaging+and+laboratory+diagnostic+options.">Fracture healing: A review of clinical, imaging and laboratory diagnostic options.</a> Injury. 48, S69-S75 (2017).</li><li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+anti-fracture+agent+heal+fractures?.">Can an anti-fracture agent heal fractures?.</a> Clinical Cases in Mineral and Bone Metabolism. 7 (1), 11-14 (2010).</li><li>Hak, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+union+and+nonunions:+epidemiology,+clinical+issues,+and+financial+aspects.">Delayed union and nonunions: epidemiology, clinical issues, and financial aspects.</a> Injury. 45, S3-S7 (2014).</li><li>Decker, S., Reifenrath, J., Omar, M., Krettek, C., Muller, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-osteotomy+and+osteotomy+large+animal+fracture+models+in+orthopedic+trauma+research.">Non-osteotomy and osteotomy large animal fracture models in orthopedic trauma research.</a> Orthopaedic Reviews (Pavia). 6 (4), 5575 (2014).</li><li>Histing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+bone+healing+models:+standards,+tips,+and+pitfalls+results+of+a+consensus+meeting.">Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting.</a> Bone. 49 (4), 591-599 (2011).</li><li>Jacenko, O., Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mouse+models+in+studies+of+skeletal+disorders.">Transgenic mouse models in studies of skeletal disorders.</a> Journal of Rheumatology Supplement. 43, 39-41 (1995).</li><li>Nikolaou, V. S., Efstathopoulos, N., Kontakis, G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+osteoporosis+in+femoral+fracture+healing+time.">The influence of osteoporosis in femoral fracture healing time.</a> Injury. 40 (6), 663-668 (2009).</li><li>Bain, S. D., Bailey, M. C., Celino, D. L., Lantry, M. M., Edwards, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dose+estrogen+inhibits+bone+resorption+and+stimulates+bone+formation+in+the+ovariectomized+mouse.">High-dose estrogen inhibits bone resorption and stimulates bone formation in the ovariectomized mouse.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 8 (4), 435-442 (1993).</li><li>Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+in+Bone+Fracture+Healing+Research.">Mouse Models in Bone Fracture Healing Research.</a> Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).</li><li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+healing:+mechanisms+and+interventions.">Fracture healing: mechanisms and interventions.</a> Nature Reviews in Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).</li><li>Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+remodeling+during+fracture+repair:+The+cellular+picture.">Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture.</a> Seminar in Cellular and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).</li><li>Ai-Aql, Z. S., Alagl, A. S., Graves, D. T., Gerstenfeld, L. C., Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+controlling+bone+formation+during+fracture+healing+and+distraction+osteogenesis.">Molecular mechanisms controlling bone formation during fracture healing and distraction osteogenesis.</a> Journal of Dental Research. 87 (2), 107-118 (2008).</li><li>Gerstenfeld, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Reconstruction+of+Fracture+Callus+Morphogenesis.">Three-dimensional Reconstruction of Fracture Callus Morphogenesis.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 54 (11), 1215-1228 (2006).</li><li>Marsell, R., Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+bone+healing+therapies.">Emerging bone healing therapies.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 24, S4-S8 (2010).</li><li>Lybrand, K., Bragdon, B., Gerstenfeld, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+bone+healing:+fracture,+marrow+ablation,+and+distraction+osteogenesis.">Mouse models of bone healing: fracture, marrow ablation, and distraction osteogenesis.</a> Current Protocols of Mouse Biology. 5 (1), 35-49 (2015).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+LockingMouseNail--a+new+implant+for+standardized+stable+osteosynthesis+in+mice.">The LockingMouseNail--a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice.</a> Journal of Surgical Research. 169 (2), 220-226 (2011).</li><li>Histing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+locking+plate+to+study+intramembranous+bone+healing+in+a+mouse+femur+fracture+model.">An internal locking plate to study intramembranous bone healing in a mouse femur fracture model.</a> Journal of Orthopaedic Research. 28 (3), 397-402 (2010).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+internal+fixation+of+femoral+fractures+in+mice:+impact+of+stability+on+fracture+healing.">A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing.</a> Journal of Biomechistry. 41 (8), 1689-1696 (2008).</li><li>Holstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+establishment+of+defined+mouse+models+for+the+study+of+fracture+healing+and+bone+regeneration.">Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 23 (5 Suppl), S31-S38 (2009).</li><li>Bonnarens, F., Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+standard+closed+fracture+in+laboratory+animal+bone.">Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone.</a> Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).</li><li>Holstein, J. H., Menger, M. D., Culemann, U., Meier, C., Pohlemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+locking+femur+nail+for+mice.">Development of a locking femur nail for mice.</a> Journal of Biomechistry. 40 (1), 215-219 (2007).</li><li>McBride-Gagyi, S. H., McKenzie, J. A., Buettmann, E. G., Gardner, M. J., Silva, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+conditional+knockout+in+osteoblasts+and+endothelial+cells+does+not+impair+bone+formation+after+injury+or+mechanical+loading+in+adult+mice.">Bmp2 conditional knockout in osteoblasts and endothelial cells does not impair bone formation after injury or mechanical loading in adult mice.</a> Bone. 81, 533-543 (2015).</li><li>Williams, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CaMKK2+Enhances+Fracture+Healing+by+Stimulating+Indian+Hedgehog+Signaling+and+Accelerating+Endochondral+Ossification.">Inhibition of CaMKK2 Enhances Fracture Healing by Stimulating Indian Hedgehog Signaling and Accelerating Endochondral Ossification.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).</li></ol>

Os autores deste manuscrito não tem nada para divulgar. Os autores ainda afirmam que não há restrições sobre o completo de todo o material utilizado no estudo relatado neste manuscrito.

O objetivo deste procedimento cirúrgico é gerar fraturas femorais fechadas padronizadas em camundongos. A principal vantagem desse modelo é que a fixação interna ocorre após a geração da fratura, evitando assim uma angulação da haste intramedular. Talvez o aspecto mais importante deste protocolo é a geração de uma fratura transversal padronizada no midshaft fêmur, como a geometria da fratura é dependente da força de flexão aplicada e o posicionamento do membro hind. Posicionamento incorreto do fêmur durante o momento de torção pode levar a fraturas cominutivas ou oblíquas. A altura, peso e queda deve ser empiricamente pré-determinado, conforme eles são dependentes da idade, sexo e linhagem dos ratos. A força aplicada pode ser ainda mais controlada usando um máquina de teste equipada com um aparelho de flexão de três pontos no lugar de um peso caiu24de material. No entanto, gerar fraturas com um peso caiu é um modelo clinicamente relevante das lesões de alto impacto ou estresse.
Além disso, as complicações podem desenvolver durante o procedimento cirúrgico. O fio-guia pode tornar-se deslocado após a geração da fratura, conduzindo a um desalinhamento do fêmur ferido durante a estabilização com a haste intramedular. Isto pode ser evitado pelo monitoramento com imagem radiográfica antes e após a geração da fratura. No caso de fraturas cominutivas, o animal deve ser excluído do estudo. Além disso, animais devem ser acompanhados de perto após a cirurgia para a migração da haste intramedular, pois isso poderia afetar a mobilidade e a cura do membro lesionado. Uma limitação da técnica é na vivo microtomografia ou ressonância magnética (MRI) as análises não são possíveis, como o aço inoxidável, haste intramedular comprometeria a qualidade da imagem. Portanto, estas análises só podem ser realizada ex vivo, seguindo a remoção cuidadosa da haste intramedular.
Embora existam muitos modelos de fratura murino, o modelo de fratura fechada do fêmur se destaca como uma simples, eficiente e o método clinicamente relevante para o estudo a regeneração óssea. A fixação interna com uma haste intramedular, conforme descrito no presente protocolo, oferece estabilidade suficiente para consolidação consistente, mas ainda pode permitir um certo grau de movimento axial e rotacional do fêmur ferido. Enquanto abrir modelos tais como osteotomias permitem a geração de padronizada "fraturas", eles exigem uma fixação externa rígida do osso, e a cura depende de ossificação intramembranosa. Fraturas agudas ossos longos geralmente curam através de uma combinação de endocondral e ossificação intramembranosa. Portanto, as fraturas femorais fechadas descritas neste protocolo fornecem um modelo fisiologicamente relevante para estudar o mecanismo subjacente de consolidação óssea. Futuros estudos envolvendo fraturas femorais fechadas murino beneficiaria o desenvolvimento de uma haste intramedular radiotransparente para permitir na vivo por imagens técnicas, tais como o uso de corantes de contraste para medir a formação de novos vasos na membro lesionado. No total, o modelo murino fratura fechada do fêmur é uma plataforma atrativa para estudar os eventos celulares e moleculares associados a lesão óssea e regeneração e identificar novos alvos terapêuticos para acelerar a cicatrização óssea.

Fraturas estão entre as lesões mais comuns que ocorrem para o sistema músculo-esquelético e estão associadas com um enorme fardo socioeconômico, incluindo custos de tratamento que são projetados para superar a US $ 25 bilhões anualmente no Estados Unidos1, 2. Embora a maioria das fraturas cura sem incidentes, a cura é associado com substancial tempo de inatividade e perda de produtividade. Aproximadamente 5-10% de todas as fraturas resultar em um atraso de cura ou não-sindicalizados, devido à idade ou outras condições de saúde crônica subjacente, tais como osteoporose e diabetes mellitus3,4,5. Não há tratamentos farmacológicos aprovados pela FDA estão atualmente disponíveis para promover a cicatrização óssea eficiente e encurtar o tempo de recuperação.
Consolidação da fratura é um processo complexo e altamente dinâmico envolvendo a coordenação de vários tipos de células. Portanto, uma compreensão abrangente dos eventos celulares e moleculares associados a regeneração óssea é crucial para a identificação de alvos terapêuticos que acelerar este processo. Como com outras doenças humanas, o estabelecimento de um modelo animal altamente favorável e reprodutível é crucial no estudo da consolidação óssea. Animais maiores, como ovelhas e suínos, têm propriedades de remodelação óssea e biomecânica semelhantes aos seres humanos, mas são caros, exigem tempo cura substancial e não são facilmente passíveis de manipulação genética6. Por outro lado, os modelos animais pequenos, tais como ratos e camundongos, oferecem muitas vantagens, incluindo uma facilidade de manuseio, baixo custo de manutenção, ciclos de reprodução curto e um mais curto de tempo cura7. Além disso, o genoma do rato é totalmente sequenciado, permitindo a manipulação rápida e a geração de variantes genéticas. Assim, o mouse é um sistema poderoso modelo para estudar doenças humanas, lesão e reparar a8. Em humanos, comorbidades como osteoporose e diabetes mellitus aumentam a probabilidade de uma cicatrização. Um número de modelos existentes do mouse está disponíveis para estudar os efeitos de comorbidades, tais como osteoporose e diabetes mellitus na lesão do osso e cura. Pacientes que sofrem de osteoporose tem uma formação óssea diminuiu acentuadamente durante as fases posteriores de uma fratura cura9. Ovariectomizadas ratos (OVX) exibem perda óssea rápida e óssea retardada de cura semelhantes às observadas em osteoporose pós-menopausa10,11. Além disso, muitos modelos de mouse do tipo I e tipo diabetes II imitar a fenótipos massa óssea baixa e prejudicada consolidação visto em humanos11. Além disso, modelos de fratura murino servem como uma plataforma versátil para estudar os processos biológicos complexos ocorrem em calo ósseo e explorar novas estratégias terapêuticas que aceleram a regeneração do tecido ósseo.
Apesar das diferenças na estrutura óssea e metabolismo, o processo geral de fratura óssea cura permanece muito semelhante em camundongos e humanos, envolvendo uma combinação de endocondral e ossificação intramembranosa seguido de remodelação óssea. Ossificação endocondral envolve o recrutamento de células progenitoras para regiões menos mecanicamente estáveis em torno da gap de fratura, onde eles se diferenciar em condrócitos que hipertrofia e mineralize da cartilagem para produzir um calo mole. A segunda onda de células progenitoras infiltrar o calo e se diferenciam em osteoblastos maduros que secretam novo osso matriz12,13,14,15. Durante a ossificação intramembranosa, progenitores na superfície periosteal e endosteal diretamente diferenciarem em matriz secretoras de osteoblastos e facilitam a ponte da fratura lacuna9,11,12 ,13. Juntos, a endocondral e intramembranosa ossificações resultam no desenvolvimento de um calo duro, que é ainda mais remodelado ao longo do tempo para formar um osso secundário forte capaz de suportar cargas mecânicas13,14 ,15. Em seres humanos saudáveis, o processo de cicatrização leva cerca de 3 meses, em comparação com apenas 35 dias em ratos16.
Consolidação da fratura foi comumente estudado usando qualquer modelos cirúrgicos abertos ou fechados,17. Abra as abordagens cirúrgicas, como a geração de um defeito de tamanho crítico ou completar a osteotomia, padronizar a localização da lesão e a geometria para reduzir os desvios causados por fraturas cominutivas. Osteotomias servem como um excelente modelo para estudar o mecanismo subjacente por trás de um não-União porque a cura é frequentemente atrasada em comparação com fraturas fechadas. Além disso, uma fixação rígida externa é necessária para estabilizar o osso osteotomized, significando que a regeneração dependerá principalmente da ossificação intramembranosa. Abordagens cirúrgicas abertas usam dispositivos tais como bloqueio de unhas, pin-clipes e placas de travamento para fornecer estabilidade axial e rotacional ao membro fraturado; no entanto, tais dispositivos são caros e requerem significativamente mais tempo na cirurgia18,19,20,21. Por outro lado, modelos fechados são estabilizados com um dispositivo de fixação intramedular simples, permitindo a suficiente instabilidade estimular a cura endocondral. Como resultado, modelos de fratura fechada não facilmente imitar as condições de um não-sindicalizados. Técnicas de fixação interna, tais como pinos intramedular, pregos e parafusos de compressão, são vantajosas, como eles são mais barato, fácil de usar e minimizar o tempo de cirurgia21,22,23. Em alguns casos, os pinos intramedulares são inseridos antes da fratura, mas da flexão do pino intramedular pode levar a angulação ou deslocamento do fêmur fraturado, contribuindo para um tamanho variável calo e cura. O local da fratura e geometria são mais difíceis de padronizar em modelos fechados, como eles são gerados usando um dispositivo de flexão de três pontos, onde um peso é cair na diáfise. No entanto, com a técnica adequada, esta abordagem cirúrgica oferece resultados rápidos e consistentes. Além disso, o modelo de fratura fechada serve como uma ferramenta clinicamente relevante para o estudo de fraturas causadas por força de alto impacto ou estresse mecânico22.
Este protocolo cirúrgico foi adaptado de métodos anteriormente descritos usando um pino intramedular para estabilizar a fraturadas fêmures de ratos e camundongos22,24,25. Primeiro, uma agulha de haste intramedular de pequeno diâmetro é inserida através do entalhe de intracondylar para estabelecer um ponto de entrada, e um fio-guia é introduzido antes de gerar uma fractura transversal a femoral midshaft usando um três-ponto de gravidade-dependente dispositivo de dobra. Após a bem sucedida geração de uma fratura do fêmur fechada, uma haste intramedular de maior diâmetro é incorporada sobre o fio-guia para estabilizar o fêmur fraturado. Este método evita o risco de cicatrização causada pela angulação do pino intramedular durante a fratura, como a colocação da pós-fratura haste permite a estabilização de reposicionamento e otimizada do fêmur ferido.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Oster Minimax Trimmer</td>
			<td>Animal World Network</td>
			<td>78049-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POVIDONE-IODINE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>395516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPHTHALMIC OINTMENT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC0490117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styker T/Pump Warm Water Recirculator</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>TP-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Sub-Q Syringe</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENCORE Sensi-Touch PF</td>
			<td>Moore Medical LLC</td>
			<td>30347</td>
			<td>Latex, powder-free surgical glove</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide 25G Hypodermic Needles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-High-Temperature Tungsten Wire,</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3775K37</td>
			<td>0.005&#34; Diameter, 1/16 lb. Spool, 380&#39; Long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>304 stainless steel, 24G thin walled tubing</td>
			<td>Microgroup Inc</td>
			<td>304h24tw-5ft</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#15 Scalpel Blades</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10015-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 Scalpel Blades</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11002-12</td>
			<td>Serrated/Straight/12cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11066-07</td>
			<td>1x2 Teeth/Straight/7cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissector Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td>Slim Blades/Angled to Side/Sharp-Sharp/10cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td>ToughCut/Straight/Sharp-Sharp/11.5cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar Needle Holder with Suture Cutter</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12002-12</td>
			<td>Straight/Serrated/12cm/with Lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crile Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13004-14</td>
			<td>Serrated/Straight/14cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Wire Cutter</td>
			<td>ACE Surgical Supply Co., Inc.</td>
			<td>08-051-90</td>
			<td>ACE #150 Wire Cutter, tungsten carbide tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 VICRYL Suture</td>
			<td>Ethicon Suture</td>
			<td>J423H</td>
			<td>3-0 VICRYL UNDYED 27&#34; FS-2 CUTTING</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piXarray 100 Digital Specimen Radiography System</td>
			<td>Bioptics, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Cabinet x-ray system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Einhorn 3-Point Bending Device</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Built</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the generation of closed femoral fractures in mice: a model to study bone healing

Fraturas ósseas imponham um enorme fardo socio-económica em pacientes, além de afetar significativamente a sua qualidade de vida. Estratégias terapêuticas que promovem a consolidação óssea eficiente são inexistentes e em alta demanda. Eficazes e reprodutíveis de modelos animais de cura de fraturas são necessários para compreender os complexos processos biológicos associados a regeneração óssea. Muitos modelos animais de consolidação da fratura foram gerados ao longo dos anos; no entanto, modelos de fratura murino surgiram recentemente como poderosas ferramentas para estudar a consolidação óssea. Desenvolveram-se uma variedade de modelos abertos e fechados, mas o modelo de fratura fechada do fêmur se destaca como um método simples para a geração de resultados rápidos e podem ser reproduzidos de forma fisiologicamente relevante. O objetivo do presente protocolo cirúrgico é gerar fraturas femorais fechadas unilaterais em camundongos e facilitar uma estabilização pós-fratura do fêmur através da inserção de uma haste intramedular aço. Apesar de dispositivos como um prego ou um parafuso para oferecer maior estabilidade axial e rotacional, o uso de uma haste intramedular fornece uma estabilização suficiente para resultados consistentes de curativas sem produzir novos defeitos no tecido ósseo ou danificar-se nas proximidades de macio tecido. Imagem radiográfica é usada para monitorar a progressão da formação de calo, união óssea e posterior remodelação do calo ósseo. Resultados de cicatrização óssea são normalmente associados com a força do osso curado e medidos com testes de torção. Ainda assim, compreendendo os início eventos celulares e moleculares associados a reparação da fratura é fundamental no estudo da regeneração do tecido ósseo. O modelo de fratura fechada de fêmur em ratos com fixação intramedular serve como uma plataforma atrativa para estudar a consolidação de fratura óssea e avaliar estratégias terapêuticas para acelerar a cicatrização.

O sucesso da implementação do procedimento cirúrgico foi monitorado com imagens radiográficas. Etapas-chave incluem a inserção de uma agulha de haste intramedular, a colocação de um fio-guia, a indução de uma fratura transversal no midshaft a femoral e a estabilização adequada com uma haste intramedular (Figura 2Aeu - 2Aiv). A progressão de cura do calo da fratura foi monitorada com imagens radiográficas semanais até a 28 dias após a cirurgia (Figura 2B). No dias 10-16 pós-fratura, os condrócitos submeteu-se hipertrofia e produziram mineralizada cartilagem para formar um calo mole proeminente.
É importante entender os início eventos celulares e moleculares envolvidos na endocondral e intramembranosa ossificações, ao estudar a consolidação de fratura óssea. Fêmures estavam manchadas com toluidina azuis em 7 e 14 dias pós-fratura para visualizar a formação de uma matriz de cartilagem na gap da fratura (Figura 3A). A formação de cartilagem foi detectáveis 7 dias após a fratura e alinhado com a lacuna de fratura por pós-fratura dia 14.
Após a formação do calo macio, osteoclastos reabsorvido cartilagem calcificada e osteoblastos maduros sintetizaram nova matriz óssea. Inicialmente, a deposição de matriz óssea dentro o calo era espacialmente específico, mas uma remodelação da cartilagem calcificada, ao longo do tempo, produzido mais definidas estruturas na região central e a periferia do calo de fratura. Colágeno tipo 1 (COL1) é um componente importante da matriz óssea, e sua expressão mostrou a organização espacial e a quantidade relativa de matriz óssea que foi presente 14 dias pós-fractura (Figura 3B). Tomados em conjunto, estes dados mostram a produção coordenada da cartilagem e matriz óssea primária durante a cicatrização endocondral.
Depois disso, durante os dias 17-35 pós-fratura, o osso primário gradualmente foi remodelado para formar um osso secundário forte, assemelhando-se a isso a cortical parece12. Microcomputed tomografia computadorizada (micro-CT) análise revelou o volume do calo diminuído cerca de 50% entre os dias 14 e 28 pós-fratura, indicando uma efectiva remodelação do calo ósseo (Figura 4A - 4B). Apesar de técnicas de imagem radiográficas fornecem uma valiosa avaliação do conteúdo ósseo e microarquitetura, teste de torção deve ser realizada para avaliar correctamente a resistência óssea em relação ao fêmur contralateral não-lesionado.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58122/58122fig1.jpg"> Figura 1: um diagrama do aparelho fratura e o posicionamento do mouse durante a geração de uma fratura. (A), este painel mostra um diagrama dos aparelhos utilizados para gerar fraturas e a identificação dos componentes: (A1) o disco de impacto, nozes (A2) e barras roscadas, (A3) a plataforma superior, Postes verticais (A4), (A5) primavera e haste, (A6) a plataforma inferior, (A7) a fase de apoio, (A8) o botão serrilhado e (A 9) a base. As setas indicam um deslocamento para baixo das barras roscadas e haste depois que um peso é Descartado para o disco de impacto. (B) fraturas são geradas no meio da diáfise usando uma lâmina de guilhotina (B1) enquanto o intertrocantérica e regiões supracondilianas do fêmur são suportadas pelo bigornas (B2). (C) essas imagens demonstram o posicionamento do membro hind rato do outro lado os batentes do suporte anterior para a geração de uma fratura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58122/58122fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58122/58122fig2.jpg"> Figura 2: fratura de indução e cura progressão monitorado com o uso de radiografia. (A) de imagens radiográficas dos ratos foram tomado durante a cirurgia, mostrando a inserção de uma agulha de calibre 25 (Ai) retrógrada através do comprimento do fêmur, (todos) a colocação de fio guia tungstênio calibre 30 antes ( Aiii) a geração de uma fratura transversal e (Aiv) a estabilização do fêmur fraturado com uma haste de calibre 24. (B) semanal imagens radiográficas foram usadas para monitorar a progressão da cura acima de 28 dias pós-fratura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58122/58122fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58122/58122fig3.jpg"> Figura 3: formação de cartilagem e nova deposição de matriz óssea durante a ossificação endocondral. (A), este painel mostra cortes histológicos de 7 e 14 dias velhos calos manchados de toluidina azul. A periferia do calo é delineada em vermelho. (B), este painel mostra a imuno-histoquímica mancha para o colágeno tipo 1 expressão como verde dentro do calo de fratura 14 dias pós-fratura (40 X e ampliação de 100 X). As amostras foram counterstained com DAPI Visualizar núcleos como azul. Carro = cartilagem; BM = medula óssea; Oct = velho osso cortical; Mus = músculo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58122/58122fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58122/58122fig4.jpg"> Figura 4: análise de Micro-CT do calo fratura. (A), este painel mostra longitudinal e transversais micro-CT imagens da fratura do calo em 14 e 28 dias pós-fratura (n = 6/grupo). (B), este painel mostra o volume do calo média (mm3) em 14 e 28 dias pós-fratura. As barras de erro representam um desvio-padrão. A comparação estatística entre os grupos de tratamento foi realizada utilizando um unpaired-de-cauda-2 do aluno t-teste. Desvio-padrão; p < 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58122/58122fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

O modelo murino fratura fechada do fêmur é uma plataforma poderosa para estudar a consolidação da fratura e novas estratégias terapêuticas para acelerar a regeneração óssea. O objetivo do presente protocolo cirúrgico é gerar fraturas femorais fechadas unilaterais em camundongos, usando uma haste intramedular aço para estabilizar o fêmur.

A geração de fraturas fechadas de fêmur em ratos: um modelo para estudar a consolidação óssea

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...

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Nanyang Technological University

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JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

Bone Tissue and the Skeletal System

SCIENTISTS IN ACTION

15.1K visualizações.  Indiana University School of Medicine. O modelo murino fratura fechada do fêmur é uma plataforma poderosa para estudar a consolidação da fratura e novas estratégias terapêuticas para acelerar a regeneração óssea. O objetivo do presente protocolo cirúrgico é gerar fraturas femorais fechadas unilaterais em camundongos, usando uma haste intramedular aço para estabilizar o fêmur.

Vídeo: The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

Biomarcadores em um modelo animal para Revelando correlatos neurais, hematológica e Comportamental do TEPT

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Medicina

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Modelo Murino de Cicatrização

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Femoral Medula Óssea aspiração Live Ratos

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Um Defeito modelo simples Critical porte Femoral em Ratos

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and either cut or crush it to induce peripheral nerve injury. Advantages of this surgery are its simplicity, high reproducibility, and the lack of effect on vital functions or mobility from the subsequent facial paralysis, thus resulting in a relatively mild surgical outcome compared to other nerve injury models. A major advantage of using a cranial nerve injury model is that the motoneurons reside in a relatively homogenous population in the facial motor nucleus in the pons, simplifying the study of the motoneuron cell bodies. Because of the symmetrical nature of facial nerve innervation and the lack of crosstalk between the facial motor nuclei, the operation can be performed unilaterally with the unaxotomized side serving as a paired internal control. A variety of analyses can be performed postoperatively to assess the physiologic response, details of which are beyond the scope of this article. For example, recovery of muscle function can serve as a behavioral marker for reinnervation, or the motoneurons can be quantified to measure cell survival. Additionally, the motoneurons can be accurately captured using laser microdissection for molecular analysis. Because the facial nerve axotomy is minimally invasive and well tolerated, it can be utilized on a wide variety of genetically modified mice. Also, this surgery model can be used to analyze the effectiveness of peripheral nerve injury treatments. Facial nerve injury provides a means for investigating not only motoneurons, but also the responses of the central and peripheral glial microenvironment, immune system, and target musculature. The facial nerve injury model is a widely accepted peripheral nerve injury model that serves as a powerful tool for studying nerve injury and regeneration.

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Axotomia do nervo facial em ratos: um modelo para estudo de resposta motoneuron para Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and ...

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold. 
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.

Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.

Estabelecimento de um Defeito Modelo segmentar Femoral Critical-size em Ratos estabilizada por osteossíntese Placa

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

An Intramedullary Locking Nail for Standardized Fixation of Femur Osteotomies to Analyze Normal and Defective Bone Healing in Mice

Bone healing models are essential to the development of new therapeutic strategies for clinical fracture treatment. Furthermore, mouse models are becoming more commonly used in trauma research. They offer a large number of mutant strains and antibodies for the analysis of the molecular mechanisms behind the highly differentiated process of bone healing. To control the biomechanical environment, standardized and well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory in mice. Here, we report on the design and use of an intramedullary nail to stabilize open femur osteotomies in mice. The nail, made of medical-grade stainless steel, provides high axial and rotational stiffness. The implant further allows the creation of defined, constant osteotomy gap sizes from 0.00 mm to 2.00 mm. Intramedullary locking nail stabilization of femur osteotomies with gap sizes of 0.00 mm and 0.25 mm result in adequate bone healing through endochondral and intramembranous ossification. Stabilization of femur osteotomies with a gap size of 2.00 mm results in atrophic non-union. Thus, the intramedullary locking nail can be used in healing and non-healing models. A further advantage of the use of the nail compared to other open bone healing models is the possibility to adequately fix bone substitutes and scaffolds in order to study the process of osseous integration. A disadvantage of the use of the intramedullary nail is the more invasive surgical procedure, inherent to all open procedures compared to closed models. A further disadvantage may be the induction of some damage to the intramedullary cavity, inherent to all intramedullary stabilization techniques compared to extramedullary stabilization procedures.

This protocol describes an osteosynthesis technique using an intramedullary locking nail for standardized fixation of femur osteotomies, which can be used to analyze normal and defective bone healing in mice.

Uma haste intramedular de bloqueio para Padronizado Fixação do fêmur Osteotomias para analisar normal e defeituosa cicatrização óssea em ratos

Bone healing models are essential to the development of new therapeutic strategies for clinical fracture treatment. Furthermore, mouse models are becoming ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

We describe a step-by-step method of performing direct pulp capping on mice teeth for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

Desenvolvimento de um Modelo-capeamento pulpar direto para a Avaliação dos pulpar cicatrização de feridas e Formação reparadora dentina em Ratos

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an increased use of mouse models in orthopedic research was noted, most probably because mouse models offer a large number of genetically-modified strains and special antibodies for the analysis of molecular mechanisms of fracture healing. To control the biomechanical conditions, well-characterized osteosynthesis techniques are mandatory, also in mice. Here, we report on the design and use of a closed bone healing model to stabilize femur fractures in mice. The intramedullary screw, made of medical-grade stainless steel, provides through fracture compression an axial and rotational stability compared to the mostly used simple intramedullary pins, which show a complete lack of axial and rotational stability. The stability achieved by the intramedullary screw allows the analysis of endochondral healing. A large amount of callus tissue, received after stabilization with the screw, offers ideal conditions to harvest tissue for biochemical and molecular analyses. A further advantage of the use of the screw is the fact that the screw can be inserted into the femur with a minimally invasive technique without inducing damage to the soft tissue. In conclusion, the screw is a unique implant that can ideally be used in closed fracture healing models offering standardized biomechanical conditions.

This protocol describes a minimally invasive osteosynthesis technique using an intramedullary screw for standardized stabilization of femur fractures, which can be used to analyze endochondral bone healing in mice.

Um modelo minimamente invasivo para analisar a fratura endocondral cura em ratos sob condições biomecânicas padronizadas

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

A Closed-chest Model to Induce Transverse Aortic Constriction in Mice

Research on cardiac hypertrophy and heart failure is frequently based on pressure overload mouse models induced by TAC. The standard procedure is to perform a partial thoracotomy to visualize the transverse aortic arch. However, the surgical trauma caused by the thoracotomy in open-chest models changes the respiratory physiology as the ribs are dissected and left unattached after chest closure. To prevent this, we established a minimally invasive, closed chest approach via lateral thoracotomy. Herein we approach the aortic arch via the 2nd intercostal space without entering the chest cavities, leaving the mouse with a less traumatic injury to recover from. We perform this operation using standard laboratory settings for open chest TAC procedures with equal survival rates. Apart from maintaining physiological breathing patterns due to the closed chest approach, the mice seem to benefit by showing rapid recovery, as the less invasive technique appears to facilitate a fast healing process and to reduce immune response after trauma.

Here, we present a protocol of Transverse Aortic constriction (TAC) via a lateral thoracotomy. This technique is a minimally invasive, closed chest surgical procedure aiming to simulate pressure overload and heart failure in mice utilizing standard TAC laboratory settings.

Um modelo de peito fechado para induzir a constrição da aorta transversa em ratos

Research on cardiac hypertrophy and heart failure is frequently based on pressure overload mouse models induced by TAC. The standard procedure is to ...