Agradecemos Laurie Lee para a leitura crítica do manuscrito. TWC é apoiado por um American Heart Association Predoctoral Clube (12PRE6590007). MRB é apoiado por uma bolsa de formação Instituto Nacional do Câncer (T32 CA119925). SSH é suportado pelo National Institutes of Health (R01DK078640). EL é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01GM081635 e R01GM103926).

1. Preparação do extrato do ovo Xenopus NOTA: Cada sapo produz cerca de 1 ml de extrato de ovo utilizável. Extratos de 10 rãs são normalmente preparados ao mesmo tempo, eo volume de tampão descrito abaixo é para realizar a 10 sapo Xenopus extrato do ovo de preparação. O volume do tampão pode ser ajustada em conformidade, para preparações maiores ou mais pequenas de extracto de ovo. Preps gerados desta maneira consistente originar concentrações de proteína ≥ 50 mg / ml. O processo de coleta de ovos e transformá-los em extrato é mais eficiente quando realizada por duas pessoas. (Para técnicas básicas de criação de sapo, ver Sive et al. 33). <ol><li> Coleção do ovo <ol><li> Para preparar os sapos, injetar cada sapo fêmea com 100 U de grávida Mare Serum gonadotrofina (PMSG) de um recém-feitos 250 estoque U / ml. Use uma seringa de 3 ml de tuberculina com uma agulha G 27 para injectar por via subcutânea, com o bisel daa agulha para cima, para dentro do saco de linfa dorsal, que está localizado a aproximadamente 1 cm de distância da linha média das descolorações dentada ao longo do comprimento das pernas de rã. </li><li> Armazene rãs condicionadas em água (além de NaCl 20 mM, consulte Sive et al. 33) a 18 ° C durante 5-10 dias. Para pé sistemas de tanques de água, a densidade animal é de aproximadamente 4 L de água por sapo fêmea. NOTA: O tempo mínimo necessário para aprontar para entrar em vigor é de 5 dias, e os efeitos de priming desgastar depois de 10 dias. </li><li> Solução 0,5 x de Marc Modificado Ringer (MMR) a partir de um estoque de 20x MMR preparar. 20x MMR consiste de cloreto de sódio 2 M, cloreto de potássio 40 mM, cloreto de cálcio 40 mM, cloreto de magnésio 20 mM, e 100 mM de 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfónico ácido (HEPES), pH 7,4. </li><li> Configure baldes para todos os sapos injetados (um sapo por 4 L balde). NOTA: Apesar de mais de uma rã pode ser colocado no mesmo depósito de recolha de ovos, se um dos sapospõe ovos predominantemente de baixa qualidade, uma quantidade substancial de esforço será necessário para separar os ovos de má qualidade daqueles que são adequados para a tomada de extrato. Assim, maximizar o número de rãs no mesmo tanque para minimizar a quantidade de tampão usado para coletar ovos não vale a pena o risco. </li><li> Injetar 750 U gonadotrofina coriônica humana (HCG) no saco linfático dorsal de cada sapo usando uma agulha 27 G, conforme descrito em 1.1.1. </li><li> Coloque cada um dos sapos com injecção de HCG em baldes de 4 L individuais contendo 0,5 x MMR arrefecido a 16 ° C. </li><li> Coloque os contentores com as rãs em uma incubadora de 16 ° C para coletar ovos O / N (15-16 h). NOTA: Manter a temperatura adequada é fundamental para todo o processo, desde a coleta de ovos para preparar o extrato do ovo. </li></ol></li><li> Dejellying Eggs NOTA: Os ovos são cobertos com um revestimento de gelatina que tem de ser removido antes de fazer extracto. A probabilidade de lise espontânea dos ovos aumenta à medida que o tempo between postura de ovos e extrair preparação aumenta. Assim, é importante levar a cabo através dos seguintes passos, tão rapidamente quanto possível. <ol><li> Prepare a 4 L de 1x MMR, 50 ml de 0,1 x MMR, e 400 ml de 2% de cisteína, pH 7,7, feita em água destilada. Manter todas as soluções a 16 ° C. </li><li> Para expelir ovos adicionais, esprema delicadamente o lombar e abdômen do sapo. </li><li> Retire os sapos e a maior parte do MMR, para deixar os ovos em cerca de 1-200 ml de MMR em cada balde. </li><li> Retire os resíduos com uma pipeta de transferência, e avaliar a qualidade dos ovos: ovos de alta qualidade são geralmente marcadas por uma clara separação entre o hemisfério animais mais pigmentadas eo hemisfério vegetal levemente colorido e tem o maior contraste-escuro a luz. Descarte com uma pipeta de transferência de todos os ovos que aparecem pegajoso, malhada, ou lise (branco e inchado) como eles vão diminuir a qualidade global do extrato. Se&gt; 10% dos ovos, são de fraca qualidade, a todalote deve ser descartada. </li><li> Misture os ovos em um copo de vidro de 500 ml e derramar tanto MMR quanto possível, mantendo os ovos submersos. </li><li> Lave os ovos, mexendo suavemente com o dobro do volume dos ovos de MMR. Repita duas vezes, e remover quaisquer detritos ou ovos obviamente de má qualidade. </li><li> Adicionar cerca de 100 ml de 2% de cisteína para o recipiente de vidro, agite a mistura, e permitir que os ovos que se contentar com 5 min a 16 ° C. Decantar a cisteína. NOTA: Dejellying é marcado pelo aparecimento gradual de camadas de geléia flutuam acima dos ovos e embalagem mais compacta dos ovos como eles agora ocupam um volume menor, sem o casaco de geléia. </li><li> Adicionar mais 100 ml de 2% cisteína, agite bem, espere 5 minutos, e em seguida despeje lentamente ao largo da cisteína. Repetir até que os ovos tornaram-se bem compactado (usualmente por tratamento terceira cisteína). Nota: Se os ovos são deixados demasiado tempo em cisteína, que são propensos a lise. Da mesma forma, os ovos dejellied são frágeis e propensos a lise mecânica sesão rodadas com muita força ou se eles são expostos ao ar. Uma vez que os ovos foram dejellied, é importante que prossiga rapidamente para os passos de centrifugação. </li><li> Deitar fora cisteína, e enxaguar o casaco geléia e outros detritos, lavando suavemente ovos em 1x MMR. Decantar cuidadosamente tampão ao longo do lado do recipiente. Repita duas vezes ou até que a solução MMR não é mais nublado. Ao lavar com MMR 1x continuar a remover os ovos más usando uma pipeta de transferência. </li><li> Realizar um enxágüe final suave com 30 ml 0,1 x MMR, e gentilmente despeje o máximo de buffer possível. Mais uma vez, retire todos os ovos obviamente ruins. </li></ol></li><li> Embalagem e Crushing ovos por centrifugação NOTA: O extracto descrito abaixo, que é usada para a degradação β-catenina é uma variante do factor de extracto citostático (metafase II-presos). Em contraste com o extracto de baixa velocidade e alta velocidade usada para estudos do ciclo celular, extracto de velocidade intermédia funciona melhor para a degradação β-catenina. Euextrato nterphase promove semelhante degradação β-catenina robusto, embora seja mais trabalhoso para se preparar. <ol><li> Adicionar leupeptina, pepstatina, aprotinina mistura (LPA, um inibidor da protease) a 10 ug / ml (diluído a partir de uma solução 10 mg / ml em DMSO) e citocalasina D em 20 ug / ml (diluído a partir de uma solução estoque de 10 mg / ml em DMSO) para os restantes 20 ml de 0,1 x MMR. </li><li> Adicionar a 0. X MMR contendo LPA e citocalasina D para os ovos lavados, agite bem, e incubar por 5 min a 16 ° C. </li><li> Transferir os ovos para 16 ° C previamente arrefecidos 50 ml de tubos de centrífuga, permita que os ovos de resolver, e remover o tampão residual a partir do topo. Para evitar a exposição ao ar, retiram uma pequena quantidade de solução tampão para a pipeta de transferência antes de retirar os ovos para transferência. Continuar a transferir os ovos adicionais para os tubos de centrifugação e remover o tampão residual a partir do topo do tubo até que os ovos de encher o tubo da centrífuga para o topo, o que vai maximizar o rendimento deextrair. </li><li> Para embalar os ovos, tubos de centrifugação de centrifugação a 400 xg durante 60 seg a 4 ° C utilizando um rotor de ângulo fixo. Remover o tampão residual a partir do topo dos tubos de centrífuga. </li><li> Para a rotação de esmagamento, girar tubos a 15.000 xg durante 5 min a 4 ° C. </li></ol></li><li> Coleta camada citoplasmática de Extrato NOTA: O método descrito abaixo difere do método clássico de perfurar a parede do tubo da centrífuga de forma a recolher o citoplasma. Este protocolo foi adaptado para a simplificação e para utilização com determinados tubos de centrifugação, que são reutilizáveis. Não houve diferenças perceptíveis na cinética de degradação β-catenina encontram-se com qualquer um dos métodos. Neste ponto extracto deve ser mantido frio durante todo o processo, e todos os passos devem ser realizados a 4 ° C. <ol><li> Limpar um buraco na camada lipídica utilizando P1000 ponta da pipeta. </li><li> Recolher a fase citoplasmática (entre a camada pigmentada escura ea light camada lipídica), utilizando uma nova ponta de pipeta P1000 em tubos de centrífuga limpas pré-refrigeradas (Figura 1). Para o extrato de alta qualidade que robustamente degrada β-catenina, minimizar a quantidade de camada pigmentada e lipídica que é retirado com a camada citoplasmática. </li><li> Rotação extraída citoplasma a 15.000 xg durante 10 min a 4 ° C e novamente recolher o citoplasma. Repita a rotação e extração 1X. NOTA: O extrato deve ser &quot;cor de palha&quot;. Se há contaminação substancial com as camadas pigmentadas e lipídicas, neste ponto, pode-se repetir a rotação mais uma vez, embora rotações excessivo irá diminuir a capacidade do extracto para degradar β-catenina. </li><li> Adicionar LPA e citocalasina D para o extracto a concentrações finais de 10 ug / ml cada. NOTA: Usando o método descrito proporciona uma concentração razoavelmente consistente de proteína total de cerca de 50 mg / ml (52,41 ± 5,40 mg / ml, n = 3), em preparações separadas, por exemplo Xenopusextractos de g. </li><li> (Opcional) para ensaios de tradução, adicionar tampado mRNA (0,1 mg / ml), RNAsin (1,5 U / ml), e mix de regeneração de energia (2.2.1) e incubar a reação à temperatura ambiente por 2 horas (para mais informações consulte sálica et ai. 2 e Sive et ai. 33). Use extrato traduzido imediatamente para ensaios de degradação β-catenina ou snap-congelamento em nitrogênio líquido para uso posterior. NOTA: extrato recentemente preparado tem uma alta capacidade de traduzir mRNA adicionado exogenamente, mas, infelizmente, essa capacidade se perde uma vez que o extrato é congelado. Tampado ARNm podem ser facilmente preparados utilizando kits disponíveis comercialmente. </li><li> Extrato Snap-congelamento em nitrogênio líquido. NOTA: Os extratos são armazenados em pequenas (200 mL) alíquotas para uso único, porque eles perdem rapidamente sua capacidade de degradar β-catenina se novamente congelados. Para armazenamento a longo prazo, o extracto pode ser armazenado em azoto líquido. Para armazenagem a curto prazo, o extracto pode ser armazenada a -80 ° C, embora a capacidade de of extracto de degradar β-catenina pode ser reduzido drasticamente com o armazenamento prolongado à temperatura de -80 ° C (mais de 2 meses). </li></ol></li></ol> 2. Preparando Extrato para β-catenina Degradação Assay <ol><li> Esgotamento de Extrato Xenopus Observação: Uma grande vantagem do extracto de Xenopus é a capacidade para esgotar rapidamente os componentes de uma via e precisamente adicionar novamente uma quantidade definida de uma proteína, a fim de determinar os seus efeitos dependentes da dose. <ol><li> Use preparada na hora extrato do ovo de Xenopus ou rapidamente descongelar extrato congelado e colocar no gelo. Realize todas as manipulações no frio. </li><li> Adicionar extracto para 1/10 do volume de anticorpo peletizada ou grânulos de afinidade (por exemplo, 20 ml de esferas sedimentadas a 200 ml de extracto). De modo a minimizar a diluição do extracto, retirar o máximo de líquido a partir das esferas quanto possível, antes da adição do extracto usando pontas de carregamento de gel, com pontas afiladas longos. </li><li> Gire extrato-mistura de esferas, a 4 ° C durante 1 hora. </li><li> Rotação mistura-extracto de talão em 12.600 xg em microcentrifuga a 4 ° C durante 30 seg. Alternativamente, se as esferas magnéticas são utilizadas, aplicam-se o campo magnético para recolher as esferas. </li><li> Transferência esgotados extrato para um tubo de microcentrífuga fresco no gelo. Tenha cuidado para não transferir quaisquer contas com o extrato. </li><li> Confirme eficiência de esgotamento por immunoblotting tanto extrato empobrecido e miçangas. </li><li> Prepare extrato para ensaio de degradação β-catenina, como descrito em 2.2. </li></ol></li><li> Otimizando Xenopus Extrato para β-catenina Degradação NOTA: degradação β-catenina em Xenopus extrato do ovo é um processo dependente de energia que se esgota rapidamente os estoques de ATP endógenos. Consequentemente, um sistema de regeneração de energia é necessária para manter a degradação β-catenina robusta. <ol><li> Prepare uma mistura de 20x de regeneração de energia (ER), constituído por 150 mM fosfato de creatina, ATP 20 mM, 600 mg / ml creatinofosfoquinase,e 20 mM MgCl2. ER devem ser divididos em alíquotas e armazenado a -80 ° C. Evitar ciclos de congelamento / descongelamento repetidos usando pequenas alíquotas congeladas. </li><li> Descongelar rapidamente Xenopus extrato do ovo, esfregando o tubo congelado entre as mãos. Colocar o tubo em gelo imediatamente antes de todo o extracto tenha derretido. </li><li> Adicionar 10 ml de mistura de regeneração de energia (20x ER) em uma alíquota (200 mL) de Xenopus extrato do ovo. Misture bem por rapidamente sacudindo o tubo e pulso vórtex. Pulso-spin e coloque imediatamente em gelo. </li><li> (Opcional) O volume de β-catenina pode ser ligeiramente aumentada no extracto de ovo de Xenopus, por adição de ubiquitina (1,25 mg / ml final). Cicloheximida (0,1 mg / ml final), também pode ser adicionado para minimizar a tradução dos transcritos endógenos. </li><li> Alíquota os volumes apropriados para o ensaio de degradação em tubos de microcentrífuga de pré-arrefecidas em gelo. Para os ensaios de degradação radiomarcados β-catenina, retirar 2-5 extrair ml para cada ponto de tempo. &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 3. Radiolabeled ensaio de degradação β-catenina em Xenopus extrato do ovo Nota: Todos os passos devem ser executados em gelo, a menos que indicado de outra forma. <ol><li> Preparando Radiolabeled β-catenina <ol><li> Preparar mesmo em sintetizado in vitro [35 S] metionina-proteína radiomarcada utilizando kits disponíveis comercialmente. NOTA: A geração de 35 S-marcado (semi-vida de 87 dias) as proteínas são facilmente e eficientemente produzido usando disponíveis comercialmente em kits acoplada in vitro de transcrição-tradução. É importante que a proteína traduzida é suficientemente marcado de modo que alterações no volume de proteína pode ser facilmente visualizada. </li><li> Para confirmar a marcação radioactiva bem sucedida, realizar SDS-PAGE/autoradiography com 0,5 mL da proteína traduzida. Quantificar a intensidade da banda de β-catenina radiomarcado utilizando o ImageJ, ImageQuant, ou um progr software quantitativa alternativasou. NOTA: A banda radiolabeled proteína β-catenina deve ser claramente visível no filme dentro de algumas horas (4-6 horas). </li><li> Encaixe-congelar a proteína radiomarcada em nitrogênio líquido para o armazenamento até o uso. Nota: O armazenamento prolongado (&gt; 2 meses) e múltiplos de congelação / descongelação (maior que 2) pode impactar severamente a capacidade do radiomarcado β-catenina para degradar de forma robusta em Xenopus extracto de ovo. Tipicamente, a estabilidade das proteínas radiomarcadas diminui significativamente depois de 1 mês de armazenamento à temperatura de -80 ° C; assim, relativamente recentemente preparada radiomarcado β-catenina dá melhores resultados obtidos nestes ensaios de degradação. </li></ol></li><li> Realizando β-catenina Degradação Assay <ol><li> Adicionar 1-3 ul (dependendo da potência do sinal de banda radiomarcada) in vitro traduzida β-catenina (e outras proteínas, moléculas pequenas, etc, que estão a ser testados) em 20 ul de mistura de reacção em gelo de Xenopus. Misture bem por quickly sacudindo o tubo e um curto pulso de centrifugação; este é um passo importante como Xenopus extrato do ovo é muito viscoso e mistura incompleta irá afetar a consistência dos resultados. Rotação do pulso e colocar no gelo. </li><li> Inicie o β-catenina reacção de degradação, deslocando os tubos à temperatura ambiente. </li><li> No ponto de tempo designado, remover 1-5 ml de amostra e misturar imediatamente com tampão de amostra de SDS (volume de 5x) para parar a reacção. Para garantir que a reação de degradação está completamente terminado, o tubo de filme várias vezes e vortex vigorosamente. </li><li> Realize SDS-PAGE/autoradiography. Executar 1 ml equivalentes (~ 50 mg de proteína) do extrato para cada ponto de tempo / pista. Degradação de β-catenina em Xenopus extracto de ovo deve ser evidenciado pela diminuição dependente do tempo na intensidade da radiomarcado β-catenina banda Figura 2. Quantificar os resultados utilizando o ImageJ, ImageQuant, ou outro software de imagem preferido, se necessário. </li><li> (Optional) Soak gel de SDS-poliacrilamida em solução (ácido acético a 10% e 30% de metanol, que fixa em água destilada) antes de secagem para reduzir o fundo de radioactividade e aumentar a qualidade da imagem. </li></ol></li></ol> 4. Β-catenina-luciferase Degradação Ensaio no extrato do ovo Xenopus Execute todas as etapas no gelo, salvo indicação em contrário. <ol><li> Preparação β-catenina-luciferase <ol><li> Sintetizar não-radioactivamente, marcado com luciferase β-catenina utilizando o sistema acoplado de transcrição-tradução com uma mistura de aminoácidos completa. </li><li> Confirmar produção do marcado com luciferase β-catenina pela medição da actividade da luciferase 0,5-1 ul de reacção. Avaliar fundo luminescência através da medição da luminescência de uma mistura de reacção não traduzida. NOTA: Vários kits comerciais estão disponíveis para medir a atividade de luciferase. Luminescência de longa duração, no entanto, funciona particularmente bem para o assa degradaçãoy. </li></ol></li><li> Realizando β-catenina-luciferase Degradação Ensaio <ol><li> Descongele e prepare Xenopus extrato do ovo como em 2.2. </li><li> Adicionar em traduziu-vitro fusão β-catenina-luciferase (de 4.1) para preparar mistura de reacção Xenopus (de 2,2) em gelo e misture bem como em 3.2.1. NOTA: A actividade da luciferase β-catenina, que é adicionado ao extracto é tipicamente entre 20 - 50.000 unidades de luminescência relativa (RLU) / ml de extracto (com base em medições obtidas a partir de 4.1.2). Sinal de partida deve ser de aproximadamente 100.000 RLU (2-5 ml da β-catenina-luciferase fusão in vitro-traduzido). </li><li> Deslocar o extrato de RT para iniciar a reacção de degradação. </li><li> Retirar uma aliquota da reacção no momento indicado e encaixe por congelação em azoto líquido. NOTA: As amostras triplicadas são normalmente removidas para análise em cada ponto de tempo. Extracto congelado pode ser armazenado a -80 ° C until eles estão prontos para serem analisados. </li><li> Descongelar as amostras em gelo, as amostras de transferência para placas de 96 poços brancos padrão sobre gelo, e processo para a actividade da luciferase. </li></ol></li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biochemical+screen+for+identification+of+small-molecule+regulators+of+the+Wnt+pathway+using+Xenopus+egg+extracts.">A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).</li><li>Hinkson, I. V., Elias, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+state+of+protein+turnover:+It's+about+time.">The dynamic state of protein turnover: It's about time.</a> Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).</li><li>Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+Hereditary+Colorectal+Cancer.">Lessons from Hereditary Colorectal Cancer.</a> Cell. 87, 159-170 (1996).</li><li>Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+regulation+of+[beta]-catenin+stability+by+Tcf3+and+CK1epsilon.">Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon.</a> J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).</li><li>Lee, E., Salic, A., Kr&#252;ger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+APC+and+Axin+derived+from+experimental+and+theoretical+analysis+of+the+Wnt+pathway.">The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway.</a> PLoS Biology. 1, (2003).</li><li>Seeling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+beta-catenin+signaling+by+the+B56+subunit+of+protein+phosphatase+2A.">Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A.</a> Science. 283, 2089-2091 (1999).</li><li>Guger, K. A., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Catenin+has+Wnt-like+activity+and+mimics+the+Nieuwkoop+signaling+center+in+Xenopus+dorsal-ventral+patterning.">beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning.</a> Dev Biol. 172, 115-125 (1995).</li><li>Cselenyi, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRP6+transduces+a+canonical+Wnt+signal+independently+of+Axin+degradation+by+inhibiting+GSK3's+phosphorylation+of+&#946;-catenin.">LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of &#946;-catenin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).</li><li>Jernigan, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gbetagamma+activates+GSK3+to+promote+LRP6-mediated+beta-catenin+transcriptional+activity.">Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity.</a> Science Signaling. 3, (2010).</li><li>Major, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wilms+tumor+suppressor+WTX+negatively+regulates+WNT/beta-catenin+signaling.">Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling.</a> Science. 316, 1043-1046 (2007).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females.">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+fractionation+of+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+DNA+damage+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Rubinfeld, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+GSK3&#946;+to+the+APC-&#946;-Catenin+Complex+and+Regulation+of+Complex+Assembly.">Binding of GSK3&#946; to the APC-&#946;-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly.</a> Science. 272, 1023-1026 (1996).</li><li>Salic, A., King, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecule+inhibitors+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway+in+Xenopus+egg+extracts.">Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes.">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li><li>Tan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+pathway+parameters+for+mammalian+cells.">Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Xenopus extrato do ovo é um sistema bioquímico robusta para investigar rotatividade β-catenina. A concentração de β-catenina no Xenopus extracto de ovo é de ~ 25 nM 2. Sob condições ideais, o extracto de ovo é capaz de degradar β-catenina, a uma taxa de 50-100 nM / h e é metade do máximo a 200 nm 24. Há vários passos críticos para a reconstituição bem sucedida de degradação β-catenina usando Xenopus extrato do ovo. Estes incluem: 1) a geração de alt...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51425">Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract</a>. At the time of publication there were some instances where an incorrect volume notation was used. These instances were corrected from:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 ml pelleted beads to 200 ml extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 ml extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 ml of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/ml of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 ml of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).
to:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 &#181;l pelleted beads to 200 &#181;l extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 &#181;l extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 &#181;l of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 &#181;l equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/&#181;l of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 &#181;l of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).

Erratum: Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis extrato do ovo tem sido amplamente utilizado para estudar muitos processos biológicos celulares, incluindo a dinâmica do citoesqueleto, montagem e importação nuclear, apoptose, metabolismo ubiquitina, a progressão do ciclo celular, transdução de sinal, e turnover de proteína 1-17. O sistema de extrato de ovos de Xenopus é passível de análise bioquímica de uma legião de processos celulares porque extrato do ovo representa essencialmente citoplasma não diluído que contém todos os componentes citoplasmáticos essenciais necessários para executar esses processos e permitir investigação. Grandes quantidades de extracto de ovo, podem ser preparados ao mesmo tempo para manipulações bioquímicas que requerem grandes quantidades de material (por exemplo, a purificação de proteínas ou de triagem de alto rendimento) 18-20. Outra vantagem é que a concentração de proteínas específicas em Xenopus extracto de ovo pode ser ajustada com precisão por adição de proteína recombinante e / ou de imunodepleção endogproteínas enous em contraste com a transfecção do plasmídeo de DNA em que a expressão da proteína de interesse é difícil de controlar. Além disso, a ausência de proteínas recombinantes disponíveis pode ser eliminada pela adição de transcritos que codificam a proteína de interesse, tomando vantagem da elevada capacidade do extracto de ovo de Xenopus recentemente preparada para traduzir o mRNA exogenamente adicionado. A regulação da degradação de proteínas é fundamental para o controle de muitas vias celulares e processa 21. Xenopus extrato do ovo tem sido amplamente utilizado para estudar a degradação de proteínas como o sistema permite várias maneiras de monitorar turnover de proteína, sem influências de confusão de transcrição e tradução. A via de sinalização Wnt é uma via de sinalização altamente conservada, que desempenha um papel crítico no desenvolvimento e na doença. O volume de negócios de β-catenina, o principal efetor da via Wnt, é altamente regulado, e um aumento do estado de equilíbrio level de β-catenina é fundamental para a ativação de genes alvo de Wnt. A importância da degradação β-catenina é realçada pelo facto de que as mutações na via de Wnt que inibem a degradação β-catenina em ~ 90% de todos os casos esporádicos de cancro colorrectal 22. degradação β-catenina por componentes da via Wnt podem ser fielmente recapitulado em Xenopus extracto de ovo para estudar o mecanismo da sua rotação, assim como para identificar novos moduladores de pequenas molécula do seu degradação 2, 19, 20, 23-29. Os métodos para a preparação do extracto de ovo de Xenopus para o estudo do ciclo celular têm sido descritos nas publicações anteriores JoVE 30-32. O actual protocolo descreve uma modificação destes métodos e é optimizado para a degradação de [35 S]-radiomarcado β-catenina e marcaram-luciferase β-catenina emExtrato de ovos de Xenopus. O ensaio de degradação radiolabeled permite a visualização direta dos níveis de proteína através de auto-radiografia. [35 S]-metionina incorporada na proteína de interesse, utilizando uma reacção de tradução in vitro, que pode então ser directamente adicionado a uma reacção de degradação. Além disso, o ensaio de retorno da proteína marcada radioactivamente não requer um anticorpo contra a proteína de interesse ou um epitopo marcador, o qual pode influenciar a estabilidade da proteína. Porque até mesmo pequenas mudanças nos níveis de proteína, como reflectida em alterações na intensidade da banda de proteína marcada radioactivamente, são prontamente visualizados por auto-radiografia, o [35 S]-radiomarcado ensaio de degradação representa um método muito útil para a visualização da proteína volume 2. Fusão de β-catenina a luciferase de vaga-lume (adiante designado simplesmente como &quot;luciferase&quot;) permite medições quantitativas precisas e fáceis de níveis de proteína, a fimpara determinar as propriedades cinéticas de rotação β-catenina 19, 20. Uma grande vantagem do ensaio de luciferase é que ela proporciona um sistema forte quantitativa que pode ser facilmente dimensionada para cima. O protocolo seguinte fornece métodos simples para ensaiar a degradação β-catenina e um método robusto e eficiente, e eficaz para o rastreio de alto rendimento de novos moduladores β-catenina.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:709px;" width="710">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Material</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:243px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)</td>
			<td style="width:132px;">ProSpec</td>
			<td style="width:119px;">hor-272-A</td>
			<td>Reconstituted with distilled water before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CG10-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Research Products International</td>
			<td style="width:119px;">S23020-5000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC42352-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:132px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC17360-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L2884-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aprotinin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1153-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pepstatin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4265-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C8273-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3 mL syringe: Luer Lock tip</td>
			<td style="width:132px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">27G1 needle</td>
			<td style="width:132px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Steady-Glo Luciferase assay system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2520</td>
			<td>Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">L4600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">L3260</td>
			<td>Generally higher yield than reticulocyte lysate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35]</td>
			<td style="width:132px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEG772007MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Creatine phosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">27920-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Creatine phosphokinase</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3755-35KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dual-Glo luciferase assay system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2920</td>
			<td>Same storage conditions as Steady-Glo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0556214D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sorvall SS-34 fixed angle rotor</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">115 V 50/60 Hz Minicentrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-090-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mMessage mMachine Sp6 kit</td>
			<td style="width:132px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Firefly Luciferase antibody</td>
			<td style="width:132px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab16466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-GSK3 antibody</td>
			<td style="width:132px;">BD Transduction Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">610201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
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			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
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			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
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			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FLUOStar Optima</td>
			<td style="width:132px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sorvall RC-6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">16&#176;C Incubator</td>
			<td style="width:132px;">Percival Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of &#946;-catenin degradation in xenopus egg extract

Xenopus laevis extracto de ovo é, um sistema robusto bem caracterizado para estudar a bioquímica de diversos processos celulares. Xenopus extracto de ovo foi utilizada para estudar a rotatividade de proteínas, em muitos contextos celulares, incluindo o ciclo de célula e de transdução de sinal de caminhos 1-3. Aqui, é descrito um método para o isolamento de Xenopus extracto de ovo que foi optimizada para promover a degradação do componente da via Wnt crítico, β-catenina. Dois métodos diferentes são descritas para avaliar a degradação das proteínas β-catenina no Xenopus extracto de ovo. Um método é visualmente informativo ([35 S]-radiomarcado proteínas), enquanto o outro é mais facilmente dimensionado para ensaios de elevado rendimento (firefly proteínas de fusão de luciferase-marcada). As técnicas descritas podem ser utilizadas para, mas não estão limitados a, avaliar retorno da proteína β-catenina e identificar componentes moleculares que contribuem para a sua rotação. Além disso, a capacidade para purificar grandes quantidades de extracto de ovo de Xenopus homogénea combinada com a leitura quantitativa e fácil de proteínas marcadas-luciferase permite que este sistema possa ser facilmente adaptado para o rastreio de alto rendimento para moduladores da degradação β-catenina.

Um esquema de degradação β-catenina no Xenopus extracto de ovo é mostrado na Figura 2A. 35S-marcado β-catenina foi incubada em Xenopus extracto de ovo, aliquotas (1 ml de extracto equivalente) foram removidos em tempos apropriados, e as amostras foram submetidas a SDS-PAGE seguido por autorradiografia. degradação β-catenina por componentes da via Wnt é mediada pelo sistema de ubiquitina-proteassoma 2, e a degradação de [35 S]-radiomarcado β-...

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Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Um método é descrito para a análise de degradação de proteínas utilizando radiolabeled e proteínas luciferase de fusão em Xenopus extrato do ovo e sua adaptação para high-throughput screening para modulares de degradação de proteínas.

Reconstituição de β-catenina degradação na<em&gt; Xenopus</em&gt; Extrato de ovo

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

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Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Unit 1

Translation: RNA to Protein

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12.0K visualizações.  Vanderbilt University Medical Center.  Um método é descrito para a análise de degradação de proteínas utilizando radiolabeled e proteínas luciferase de fusão em Xenopus extrato do ovo e sua adaptação para high-throughput screening para modulares de degradação de proteínas. 

Vídeo: Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparação e fracionamento de Xenopus laevis Egg Extractos

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Biologia

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Assembléia Nuclear Usando Extractos Egg fracionado Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Estudo da Checkpoint Dano ao DNA usando<em&gt; Xenopus</em&gt; Os extratos de ovos

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Produção de<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrai identificar RNAs associada aos microtúbulos

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Transplantes faciais em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Os embriões

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

O<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Cut-aberto vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Com Fluorometria

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

Quantificação de Orofacial nos fenótipos<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).