Um protocolo visualizado fornece um quadro de referência para pesquisas mais amplas sobre defesas e formigas que crescem fungos. A principal vantagem dessa abordagem é que ela ajudará os pesquisadores a reconhecer comportamentos defensivos fundamentais para garantir um entendimento comum para o trabalho futuro. Uma referência para pesquisas em formigas que crescem fungos provavelmente será particularmente útil para jovens pesquisadores que não estão familiarizados com esses comportamentos.
Alguns desses comportamentos são pouco frequentes, então pesquisadores experientes podem nunca tê-los observado. Este guia facilitará comparações entre estudos e espécies de formigas, ilustrando comportamentos defensivos importantes, juntamente com definições consistentes. Além disso, a compreensão de comportamentos em condições controladas ajudará a estudar em habitats naturais, onde as condições são difíceis de controlar.
Para começar, isole as cepas de Escovopsis das colônias de laboratórios Acromyrmex echinatior, colocando fragmentos de jardim de fungos, com formigas removidas, em uma placa de Petri com lã de algodão úmido por vários dias, até que escovopsis germine e esporule. Transfira esporos para pratos de ágar de dextrose de batata e incubar a aproximadamente 23 graus Celsius por duas semanas. Usando uma agulha estéril, remova esporos maduros das placas.
Em seguida, inocular os esporos em novas placas em condições estéreis, e incuba-los a aproximadamente 23 graus Celsius por duas semanas. Quando a hifa crescer para cobrir toda a placa e em esporos marrons maduros, inocular os esporos em novas placas em condições estéreis. Usando três colônias originais de A.Echinatior, obtenha um total de 36 subcoordenas com 12 subcoordenas de cada colônia-mãe.
Quatro horas antes da introdução da formiga, adicione um pedaço do tamanho de uma colher de chá do jardim de fungos da colônia original, algumas folhas de bramble, e um pedaço de lã de algodão encharcada de água à caixa. Para as subcoocupações que devem ser infectadas, preencha um laço de inoculação com esporos de Escovopsis. Em seguida, inocular os esporos batendo suavemente em uma pequena parte do jardim do fungo 10 a 20 vezes.
Para as subcoalcias de controle, imite a aplicação de esporos de Escovopsis tocando no jardim do fungo com um laço de inoculação estéril de 10 a 20 vezes. Para as observações pós-infecção de 72 horas, deixe metade das subcoocupações imperturbáveis por 72 horas após a introdução da Escovopse. Para as observações pós-infecção de zero hora, adicione imediatamente duas ninhadas, quatro trabalhadores menores e quatro grandes trabalhadores da colônia dos pais para cada caixa 30 minutos antes da gravação.
Em seguida, adicione a mesma mistura de trabalhadores às observações pós-infecção de 72 horas 30 minutos antes da gravação. Realize a gravação de vídeo por quatro horas para cada sub-colônia. Depois de gravar todas as 36 subcoo colônias, revise a filmagem e marque os comportamentos de interesse de cada indivíduo em cada subcoarmes.
Os clipes a seguir fornecem uma descrição dos principais comportamentos distintos a serem observados durante as observações. Ao revisar o vídeo, observe se uma formiga pára o movimento das pernas para iniciar o auto-preparo. Verifique se as antenas passam pelos limpadores de antena nas pernas dianteiras.
Em seguida, a formiga deve limpar suas pernas e limpadores de antena com suas partes da boca. Além disso, observe se uma formiga pára qualquer movimento da perna em um ponto fixo no jardim do fungo. Observe se as antenas estão estacionárias e paralelas, apontadas para o fungo e quase se tocando perto da ponta das mandíbulas.
Então, o glossa deve emergir para lamber o fungo. Uma ou mais formigas também podem se preparar. Durante esse comportamento, as formigas param todos os movimentos e ficam juntas, mantendo contato físico.
Em seguida, a formiga de preparação deve apontar suas antenas para a formiga receptora e tocar levemente o receptor. Note que as partes superior e inferior da boca dos indivíduos de preparação estão abertas com o glossa emergindo para lamber a formiga receptora. Observe quando a formiga parar de se movimentar para iniciar o preparo da glândula metapleural.
A formiga deve inclinar-se para um lado e alcançar uma de suas pernas dianteiras para trás para esfregar a abertura da glândula, enquanto lambe a outra perna dianteira com o glossa. Então, a formiga repetirá o comportamento com as pernas opostas. Quando uma formiga pára os movimentos das pernas em um ponto fixo no jardim do fungo, note que as antenas estão imóveis e paralelas, apontando para um ponto fixo do jardim do fungo.
Então, a formiga pegará esporos escovopsis visíveis e os levará para fora do ninho. Uma formiga também pode parar os movimentos das pernas em um ponto fixo no fungo, apontar suas antenas vagamente para um pedaço de fungo e tocar a peça do fungo com suas antenas. Depois disso, a formiga vai desprender o pedaço de fungo do resto da cultura fúngica.
Outro comportamento potencial pode ser observado quando uma formiga pára os movimentos das pernas em um ponto fixo no jardim do fungo. A formiga dobrará seu gasteiro e se dirigirá um para o outro para aplicar uma gota de fluido fecal em suas partes da boca. Uma de cada vez, a formiga puxará suas pernas dianteiras através das mandíbulas, e a antena através dos limpadores de antena.
O principal objetivo deste estudo foi criar um catálogo de clipes curtos ilustrando comportamentos de defesa de doenças em formigas cortantes de folhas. Os comportamentos descritos no protocolo foram pontuados em um cenário experimental de infecção. Nas colônias de controle, trabalhadores menores prepararam a horta mais do que os grandes trabalhadores.
Nas colônias infectadas, houve uma tendência não significativa para o aumento do fungus em relação às colônias de controle. Um aumento não significativo no aliciamento fecal foi associado à infecção, mas não foi detectada diferença entre trabalhadores menores e grandes. A doação de esporos e a doação de fungos foram ambos de baixa frequência, sem diferença significativa observada entre colônias e controles infectados.
Uma tendência para a retirada de fungos aumentar com o tempo, uma vez que a infecção é observada. Poucas das colônias infectadas com infecções em estágio inicial tinham esporos visíveis restantes após o período de observação de quatro horas. Curiosamente, em condições de infecção em estágio posterior, as formigas não eram capazes de remover completamente esporos em nenhuma das colônias.
Os resultados deste experimento são, portanto, um exemplo ilustrativo de como a compilação de clipes pode ser usada para estudos comportamentais, para calcular frequências médias para comportamentos menores e grandes dos trabalhadores. Documentamos comportamentos que contribuem para defesas em formigas que crescem fungos, e sistematicamente identificamos, descrevemos e capturamos esses comportamentos em filme. Nossos resultados reforçam pesquisas no campo sugerindo por que é difícil para um patógeno infectar colônias quando enfrenta um extenso conjunto de comportamentos e compostos antimicrobísis associados.
Fornecemos uma nova ferramenta para o trabalho futuro no campo, e esperamos que o catálogo comportamental se mostre valioso na garantia de consenso e definições simplificadas, observação e interpretação de comportamentos.
