A vantagem comum dessa técnica é que as memórias visuais podem ser estudadas de forma controlada em formigas de madeira fixas e não em movimento livre. Este método tem potencial para ser usado para investigar a base neural da aprendizagem visual em um modelo muito bem estabelecido para navegação de insetos. Para selecionar as formigas que estão motivadas a comer, coloque um slide com a gota de sacarose dentro de uma pequena caixa com flúo cobrindo as paredes.
Em seguida, coloque cada formiga selecionada na caixa e espere para ver se ela se alimenta da gota de sacarose. Se a formiga se alimentar da gota de sacarose, transfira-a imediatamente para uma caixa vazia. Depois disso, transfira cada formiga para um tubo separado e coloque brevemente o tubo no congelador para imobilizar as formigas.
Coloque a formiga imobilizada no suporte através do corte no papelão, agarrando-a pela articulação entre a cabeça e o tórax. Em seguida, use pinos de inseto para garantir que as antenas permaneçam na lateral da cabeça. Usando um elemento de aquecimento feito sob medida, derreta a cera para aderir a ponta de um pino de inseto à cabeça da formiga, paralelamente ao papelão.
Depois que a cera seque, remova os pinos de inseto das antenas e remova cuidadosamente a formiga do suporte. Em seguida, fixar o pino de inseto segurando a formiga em um cilindro de argila modeladora, e fixar um suporte plástico feito sob medida abaixo dele. Certifique-se de que a formiga mantém uma postura típica em pé e que todo o corpo, exceto a cabeça, pode se mover livremente.
Primeiro, posicione uma câmera com uma lente macro em cima da caixa de acrílico branco diretamente acima do suporte da formiga, e coloque a formiga no suporte dentro da caixa. Em seguida, conecte uma agulha e seringa cheia de sacarose, o estímulo incondicional, a um retângulo de papelão azul brilhante, o estímulo condicional, para uso como uma sugestão visual. Para treinamento emparelhado, comece a gravar a formiga 10 segundos antes de apresentar o estímulo condicional.
Se a formiga realizar o Maxilla Labium Extension Reflex, ou MaLER, durante este tempo, adie o teste por alguns segundos. Mova a seringa com o estímulo condicional na frente da formiga por 10 segundos. Em seguida, exale uma única gota de sacarose da seringa e alimente a formiga por cinco segundos.
Repita o procedimento de treinamento emparelhado 10 vezes com cinco minutos entre cada ensaio. Para treinamento não remunerado, inicie a gravação de vídeo 10 segundos antes do julgamento. Em seguida, apresente o estímulo condicional como descrito anteriormente.
Após 2,5 minutos, entregue o estímulo incondicional de sacarose diretamente às partes bucais da formiga com uma seringa sem o papelão azul. Após a conclusão dos testes de treinamento, inicie a gravação da câmera 10 segundos antes da fase de testes. Em seguida, apresente o estímulo condicional à formiga por 10 segundos.
Após o fim do teste, entregue o estímulo incondicional à formiga para confirmar que a formiga ainda está motivada a se alimentar. Usando a gravação feita durante o treinamento e testes, marque as respostas da formiga durante os 10 segundos de apresentação de estímulo condicional. Por fim, separe as respostas da formiga durante a apresentação de estímulo condicional em três categorias, extensão completa com movimento como se alimentasse, extensão total sem movimento ou extensão parcial do lábio maxilar ou palpações maxilais.
Neste protocolo, as formigas submetidas ao treinamento emparelhado realizaram cada vez mais MaLER em resposta ao estímulo condicional. Pelo contrário, formigas não remuneradas não apresentaram aumento significativo no MaLER durante o treinamento. Para examinar sua memória de curto e médio prazo, as formigas foram testadas 10 minutos ou uma hora após o último teste de treinamento.
Para ambos os testes, a proporção de formigas que realizavam MaLER em resposta ao estímulo condicional foi maior quando foram submetidas a treinamento pareado. As respostas do MaLER foram divididas em três categorias: FEM, FE e PE. Tipicamente, as formigas realizavam FEM ou PE com mais frequência do que a FE. No entanto, apenas algumas formigas demonstraram consistentemente o mesmo tipo de resposta. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear formigas cuidadosamente para reduzir os níveis de estresse e qualquer dano potencial, particularmente durante o aproveitamento.
Ao adaptar este procedimento, diferentes estímulos visuais podem ser usados para investigar as propriedades que as formigas de madeira usam para formar memórias visuais. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores do campo da neurociência de insetos e navegação explorarem memórias associativas visuais com formigas de madeira para microfa.
