A principal vantagem deste ensaio de turbidez à base de placa é que ele é rápido e permite que vários inibidores de interação fibrinogen amilóide-beta sejam examinados de uma só vez sem configuração ou requisitos sofisticados. Os compostos da cabeça que estão no ensaio de turbidez fibrina podem ser ainda mais avaliados por sua capacidade de restaurar a anormalidade estrutural induzida por A-beta nos coágulos fibrinos analisados pela microscopia eletrônica de varredura. A demonstração visual da preparação do coágulo para a análise de microscopia eletrônica de varredura é fundamental, pois quaisquer variações na preparação podem contribuir para variações dentro dos resultados experimentais.
O foco desta demonstração aqui é nas interações de fibrinogênio A-beta. Este protocolo pode ser facilmente modificado para analisar outras interações com outras proteínas e os compostos com o coágulo de fibrina. Comece adicionando 1,5 micromolar de fibrinogênio recém-preparado em 200 microliters de buffer de formação de coágulos a cada A-beta negativo 42 contendo e controlando poços e incubando a placa em uma plataforma rotativa à temperatura ambiente.
Após 30 minutos, adicione simultaneamente 30 microliters de solução de trombina recém-preparada diretamente no centro do poço contendo fibrinogênio para iniciar a formação de coágulos e leia imediatamente a absorvência dos coágulos in vitro em 350 nanômetros, repetindo a medição a cada 30 a 60 segundos ao longo de 10 minutos. Para avaliar o efeito dos inibidores de interação fibrinogênio A-beta na estrutura do coágulo de fibrina, primeiro use fórceps para colocar a tampa limpa e de 12 milímetros do círculo de vidro siliconado desliza para poços individuais de uma placa de 12 poços e adicione 80 microlitros de fibrinogênio em cada deslizamento de cobertura, espalhando suavemente a solução para que sejam distribuídos uniformemente. Adicione 20 microliters de solução de trombina a cada poço para iniciar a formação de coágulos.
Cubra a placa para uma incubação de 30 a 60 minutos à temperatura ambiente, em seguida, submerga suavemente cada coágulo em dois mililitros de tampão de cacodilato de sódio gelado por dois minutos, coberto, à temperatura ambiente duas vezes, usando uma pipeta de um mililitro para remover cuidadosamente o tampão após cada lavagem. Após a última lavagem, verifique o estado da formação do coágulo no deslizamento da tampa e fixe os coágulos em dois a três mililitros de glutaraldeído gelado de 2%no gelo por 30 minutos. No final da incubação, remova suavemente o glutaraldeído de cada poço e lave os coágulos com tampão de cacodilato de sódio fresco, como demonstrado no gelo.
Para hidratar os coágulos fixos em uma série de cinco minutos de etanol gelado lava no gelo sem remover completamente o etanol entre as lavagens para manter os coágulos protegidos da exposição ao ar. Durante a última lavagem de 100% do etanol, transfira a tampa para um suporte de amostra de secador de ponto crítico, colocando pelo menos 1 arruela entre cada deslizamento de cobertura e coloque o suporte em uma câmara de secador de ponto crítico cheia de etanol. Após um ciclo de secagem de 30 minutos, use fita de carbono para montar os deslizamentos de cobertura em microscopia eletrônica de varredura individual e transfira as amostras para a câmara de revestimento de sputter de um revestimento de sputter a vácuo.
Em seguida, sputter casaco menos de 20 nanômetros de paládio de ouro ou outros materiais condutores nas amostras por 25 segundos a quatro angstroms por segundo e imagem as amostras em um microscópio eletrônico de varredura equipado com um detector de elétrons secundário tipo dois em quatro quilovolts. A formação de coágulos fibrinos causa dispersão da luz que passa pela solução, resultando em um aumento da turbidez que se nivela no final do período de leitura. Quando o fibrinogênio é incubado na presença de A-beta 42 a turbidez da solução diminui com a curva atingindo uma altura máxima de aproximadamente metade da de fibrinogênio sozinho.
Na presença de um bloqueador de interação A-beta 42 o efeito do beta-amilóide é amenizado e a turbidez é maior do que a do A-beta sozinho. O efeito do bloqueador não aparece devido à turbidez de fundo, pois o composto não altera a turbidez do coágulo fibrino quando o A-beta está ausente. Além disso, a formação de coágulos na presença de GPRP, um peptídeo conhecido por interferir na polimerização de fibrinas, demonstra uma turbidez significativamente reduzida em comparação com a formação de coágulos de fibrina na ausência do inibidor.
Fibrinogen gerado na presença de trombina e cloreto de cálcio formam apenas uma malha de fibrina com fios alongados e intercalados de fibrina, bem como feixes maiores. Quando a A-beta está presente, os fios de fibrina ficaram mais finos com vários aglomerados pegajosos nos agregados, indicando anormalidades estruturais induzidas por A-beta. Consistente com os resultados do ensaio de turbidez, a formação de coágulos na presença de um bloqueador de interação fibrinogênio A-beta restaura parcialmente a estrutura do coágulo de fibrina a partir das alterações induzidas por A-beta à medida que menos aglomerados são observados com este tratamento.
Os protocolos de análise de microscópio eletrônico de turbidez do coágulo foram otimizados para avaliar vários inibidores de interação fibrinogênio A-beta de forma rápida e reprodutível. E em breve os dados fornecerão informações valiosas sobre a formação de coágulos fibrinos que podem ser aplicadas a estudos posteriores tanto in vitro quanto in vivo.
