Name: nucleocapsid annealing-mediated electrophoresis (name) assay allows the rapid identification of hiv-1 nucleocapsid inhibitors
Uploaded: 2015-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
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This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unit&#224; per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).

1. Preparação de Material, Ácidos Nucleicos e Proteínas <ol><li> Nucleic Acids <ol><li> Autoclave os tubos de 1,5 ml e armazená-los em um recipiente estéril. Execute cada passo usando pontas com filtro estéreis para eliminar agentes contaminantes, ou seja, nucleases de consumíveis de laboratório. </li><li> Prepare de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 em água tratada com DEPC e filtrar a solução com um filtro de tamanho de poro de 0,22 um. </li><li> NOTA: O oligonucleótido chamado &quot;TRA&quot; corresponde à sequência de ARN curto (29-mero) 5&#39;-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3 &#39;15 enquanto CTAR é a sua sequência complementar de ADN 5&#39;-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-3&#39;. <ol><li> Solubiliza-se tanto TAR e CTAR no tampão Tris acima mencionado (1.1.2.) Para fazer soluções de reserva de 100 ^ M. Loja solução estoque CTAR a -20 ° C (alíquotas pode ser armazenado durante meses nestas condições). Para armazenamento a longo prazo de ARN, fazer alíquotas de 20 ul do TARsolução estoque, secar cada aliquota utilizando um concentrador de centrífuga de vácuo e armazená-las a -80 ° C. Recém antes do uso, ressuspender cada alíquota TAR em 20 l de água tratada com DEPC. NOTA: aliquotas de Trabalho TAR pode ser armazenado a -20 ° C durante duas semanas. </li></ol></li></ol></li><li> Proteína NC e (12-55) NC peptídeo <ol><li> Preparar a proteína recombinante NC de comprimento completo como relatado. 16 Armazenar a solução estoque em alíquotas a -20 ° C. Determinar a concentração de proteína exacta com um espectrofotómetro de UV-Vis, utilizando um coeficiente de extinção a 280 nm de 6410 M -1 cm -1. </li><li> Ressuspender o sintético (12-55) NC péptido em tampão Tris-HCl 10 mM pH 7,5 e armazenar a solução de stock em alíquotas a -20 ° C. Determinar a concentração de péptido correcta sobre um espectrofotómetro de UV-Vis, utilizando um coeficiente de extinção a 280 nm de 5700 M -1 cm -1. NOTA: O (12-55) NC péptido purificado por HPLC foi obtido e liofilizadoilized de uma solução que contém dois equivalentes de cloreto de zinco. </li></ol></li><li> Composto 1 <ol><li> Pesar cerca de 1 mg do composto liofilizado utilizando uma balança analítica e dissolvê-lo em 100 ul de DMSO a 100%, oportunamente pesados, para obter uma concentração elevada (≈10 mM) solução de estoque. Determinar a concentração exacta de um UV-Vis composto utilizando o seu coeficiente de extinção (a 354 nm: 11.387 M -1 cm -1). Guardar a solução estoque no escuro a -20 ° C antes de usar. </li></ol></li></ol> 2. Criação de aparelho de gel e Fundição do Gel <ol><li> Para configurar o gel, lavar duas placas (um longo e um curto) com etanol 70%, deixe-os secar e, em seguida, coloque dois espaçadores de 1 mm ao longo das longas bordas da placa por mais tempo; cobri-lo com a placa de curto, e certifique-se de alinhar as duas placas na parte inferior. </li><li> Para lançar o gel, siga as instruções fornecidas pelo suppLier (diferentes fornecedores usam aparelho ligeiramente diferente; grampos sanduíche e pilhas são fornecidos por cada aparelho de fundição). Em todos os casos, certifique-se de que grampos, pilhas e juntas são limpos, e remover os vestígios de acrilamida deixadas por usuários anteriores. </li><li> Coloque o sanduíche de gel montado no stand de fundição e siga as instruções específicas por parte do fornecedor. NOTA: Normalmente, uma junta de silicone limpo na parte inferior da ranhura de moldagem garante uma boa vedação e ajuda a evitar fugas quando vazar o gel. </li><li> Para verificar se há vazamentos, despeje a água destilada utilizando uma pipeta entre as placas de vidro. Adicione a água para encher o sanduíche e aguarde alguns minutos para se certificar de que não há fugas de informação. Se o sanduíche foi montado corretamente, retire a água e coloque um papel de filtro entre os dois vidros para secar os óculos. Retire o papel e agora o sanduíche está pronto para o vazamento do gel. </li><li> Pour gel à temperatura ambiente (TA, 25 ° C). Desde poliacrilamida é altamente neurotóxico, usar luvas. Nóse contínuas 12% em géis de poliacrilamida não desnaturante condições (nativas) para realizar ensaio NAME. <ol><li> Preparar a solução de gel a 12%: misturar 12 mL de 40% de acrilamida / bisacrilamida solução (19/1), 4 ml de 10x tampão TBE (10x: Tris-HCl 890 mM, borato 890 mM, EDTA 20 mM) e 24 ml de água MilliQ . Juntar 400 APS ul e 50 ul TEMED imediatamente antes da utilização. Misture a solução rapidamente e utilizar uma pipeta para derramar a solução para baixo entre as placas de vidro. Introduzir o pente entre as placas de vidro, evitando bolhas. Adicionar solução de gel para encher completamente a sanduíche. </li></ol></li><li> Deixe o gel polimerizar durante 45 minutos a 1 hora. Imediatamente antes do carregamento da amostra, remover o pente lentamente e lavar os poços cuidadosamente com água destilada. </li><li> Após as etapas de polimerização e poços de lavagem, siga as instruções específicas por parte do fornecedor para colocar o sanduíche de gel no aparelho de eletroforese em gel vertical. Se um sistema de refrigeração está presente, certifique-se de colocar o sistema de gel na correct posição do núcleo de arrefecimento. </li><li> Se o sistema for concebido para lidar com mais do que um gel, mas apenas um gel tem de ser executado, anexar uma sanduíche de gel como tampão de barragem para o arrefecimento do núcleo do outro lado para formar a câmara completa tampão superior. NOTA: se a barragem não for colocado corretamente, o tampão superior vai vazar possa interromper o gel de execução. </li><li> Prepare 2,5 L de TBE tampão de corrida (1x: Tris-HCl 89 mM, Borato 89 mM, EDTA 2 mM) em água desionizada. Jogo de intervalo de cerca de 500 ml de tampão TBE para a câmara tampão superior e colocar o restante na câmara tampão inferior. Verter a 500 ml de tampão TBE remanescente na câmara tampão superior. </li><li> Colocar a tampa no topo da câmara de amortecimento inferior, de modo que o ânodo e cátodo estão em posição adequada. </li><li> Conecte-se o núcleo de arrefecimento, se presente, a uma torneira de água usando mangueiras. Preencha o núcleo com água da torneira, que funcionará como um dissipador de calor durante a electroforese, e deixe a água da torneira circular pelo núcleo durante eleitosrophoresis. </li></ol> 3. Nucleocápside Annealing mediada Eletroforese (NAME) Assay <ol><li> Preparação de Buffers <ol><li> Preparar tampão TNMG (1x: Tris-HCl 10 mM, NaCl 20 mM, Mg (ClO 4) 2 1 mM, pH 7,5) em água tratada com DEPC e filtrar a solução com um filtro de tamanho de poro de 0,22 um. NOTA: tampão TNMG pode ser armazenado a 4 ° C até 7 dias. Para obter melhores resultados dobráveis ​​e recozimento, recomendamos a utilização de recém-feitos buffers. </li><li> Preparar o tampão de carregamento do gel contendo SDS (SDS GLB: Tris-HCl 100 mM, EDTA 4 mM, 50% w / v de glicerol, 2% w / v de SDS, 0,05% w / v de azul de bromofenol) em água tratada com DEPC. NOTA: GLB ajuda a controlar o quão longe as amostras de oligonucleotídeos estão rodando no sistema de gel e permite a afundar-se as amostras em gel. A adição de SDS para o GLB é um passo fundamental para o sucesso ideal de ensaio NAME. Se este passo não é seguido, não é possível distinguir banda ácidos nucleicos na gel sistema (Figura 2). </li></ol></li><li> Controles de preparação <ol><li> Dilui-se em série as soluções de reserva e utilizar oligonucleótidos acabadas de fazer 10 uM para preparar soluções de 10 ul de uma solução 1 | iM de TAR. Prepara-se da mesma maneira, separadamente, 10 ul de uma CTAR 1 uM em tampão 1x TNMG. Aqueça cada tubo a 95 ° C durante 5 minutos e, em seguida, deixar arrefecer até à temperatura ambiente, a fim de TAR e CTAR a assumirem as suas estruturas de haste-bojo de malha. </li><li> Prepare 1 PM solução de TAR híbrido / CTAR como controle. Misturar 1 ul de 10 mM TAR com 1 ul de 10 mM em CTAR TNMG 1x, num volume total de 10 ul. Os oligonucleótidos desnaturar por aquecimento do tubo a 95 ° C durante 5 minutos e deixa-se arrefecer lentamente até à temperatura ambiente, a fim de TAR para hibridar com a sua sequência complementar CTAR e para formar o TAR híbrido de cadeia dupla / CTAR. </li><li> Quando as soluções são arrefecidas até à temperatura ambiente, executar uma centrifugação de curta rotação. Adicione 3 l de GLB SDS, eac pipetah solução dentro do tubo 3 vezes e colocar o tubo no gelo. Manter as amostras de controlo firme sobre gelo até que o passo de carregamento. </li></ol></li><li> Amostras preparação para analisar proteínas NC e (12-55) do peptídeo NC <ol><li> Use 2,5 l de recém-feitos solução oligonucleotídeo 4 mm para cada amostra. Sempre preparar uma pequena quantidade em excesso de cada solução para evitar erros de pipetagem. Dobre 32,5 l de 4 mm de solução de TAR e, separadamente, de CTAR em tampão 1x TNMG como relatado para a preparação controles acima mencionado (passo 3.2.1.). </li><li> Diluir a solução estoque de ambos proteína NC e (12-55) NC peptídeo a 80 um solução com água MilliQ. </li><li> Quando soluções de alcatrão e CTAR são arrefecidos a RT, realizar uma centrifugação de curta rotação de ambos os tubos e iniciar a elaboração dos tubos de amostras. </li><li> Prepare 12 vazios 0,5 ml tubos autoclavada. Coloque 3 linhas de 4 tubos no rack para as amostras de laboratório. Cada linha indica, respectivamente, as amostras para analisar thfull-length proteína e NC, as amostras sem proteína e as amostras para analisar a (12-55) atividade peptídeo NC. </li><li> Sempre substituir dicas a qualquer momento um reagente diferente é usado. </li><li> Adicionar em cada tubo de 2,5 mL de TAR dobrado e 2,5 l de dobrado CTAR. Adicionar 4 ul de água tratada com DEPC para as amostras para a análise de NC e de (12-55) NC. Adicionam-se 5 ul de água tratada com DEPC para as outras amostras. </li><li> Adicionar 1 ml de 80 uM ou NC 1 ul de 80 uM (12-55) NC para as amostras para, respectivamente, ou NC (12-55) análise NC. </li><li> Adicionar imediatamente 3 l de GLB SDS ao tempo 0 amostras mínimo (avaliado como 0 &#39;na Figura 1), pipetar a solução dentro de cada tubo 3 vezes e, finalmente, colocar o tubo em gelo. Repita este passo para todas as amostras e controles. Manter as amostras estável em gelo até que o passo de carregamento. </li><li> Depois de 15 min, 30 min e 1 h de incubação à temperatura ambiente, adicionar 3 ul de SDS GLB, pipetar a solução dentro each tubo 3 vezes e colocar o tubo no gelo. Repita este passo para todas as amostras e controles, respectivamente, e manter em gelo até que a etapa de carregamento. </li><li> Remover a tampa do aparelho de gel. Carga de 13 ul de cada amostra para os poços formado como anteriormente descrito por vazamento do gel com um pente de formação de poços. Coloque as amostras, seguindo a ordem apresentados na Figura 1. </li><li> Substituir a tampa do aparelho de gel. Ligue os fios do aparelho de gel para o fornecimento de energia. Verifique se os eletrodos estão ligados nos slots corretos no fornecimento de energia. </li><li> Ligar a energia e executar o gel durante 2 horas e 30 minutos a uma voltagem constante de 200 V, até que o corante tenha migrado para a 1,5 cm acima do fundo do gel. </li></ol></li><li> A preparação das amostras para analisar a atividade de antraquinona em NC e (12-55) NC <ol><li> Dilui-se a solução stock do composto 1. Preparar 10 uL de 500 uM, a 250 uM, 50 uM, 5 uM de diluição do composto &lt;strong&gt; 1 em água MilliQ. </li><li> Prepare amostras de controlo conforme relatado acima (ponto 3.2.). </li><li> Use 2,5 l de recém-feitos solução oligonucleotídeo 4 mm para cada amostra. Sempre preparar uma pequena quantidade em excesso de cada solução para evitar erros de pipetagem. Fold 27,5 ul de solução de 4 uM TAR e, separadamente, de CTAR em tampão 1x TNMG como acima mencionado (passo 3.2.1.). </li><li> Diluir a solução estoque de ambos proteína NC e (12-55) NC peptídeo a 80 um solução em água. </li><li> Quando soluções de alcatrão e CTAR são arrefecidos a RT, realizar uma centrifugação de curta rotação de ambos os tubos e começar a preparação das amostras. </li><li> Prepare 20 vazios 0,5 ml tubos autoclavada. Coloque duas fileiras de 10 bisnagas no rack para as amostras de laboratório. </li><li> Sempre substituir dicas a qualquer momento um reagente diferente é usado. </li><li> Adicionar a cada tubo da primeira linha, com 2,5 l de TAR dobrado. Adicionar a cada tubo da segunda linha, com 2,5 l de dobrado CTAR. </li><li&gt; Adicionar 2 ul do composto adequado 1 diluição (concentração crescente a partir das 5 uM a diluição a 500 uM) para a TAR e CTAR. Substituir o composto com água nas amostras para a análise de NC e (12-55) NC na ausência de composto. Incubar as amostras durante 15 min à TA. </li><li> Após 15 minutos de incubação, misturar as amostras CTAR (tubos de segunda linha) com as amostras correspondente TAR (tubos de primeira linha). </li><li> Adicionar 1 ml de 80 uM ou NC 1 ul de 80 uM (12-55) a NC NC para as amostras ou (12-55) análise NC, respectivamente. </li><li> Após 15 minutos de incubação, adicionar 3 mL de GLB SDS, Pipeta cada tubo 3 vezes e colocar o tubo no gelo. Repita este passo, respectivamente, utilizando as amostras para NC e (12-55) a análise NC. Manter as amostras estável em gelo até que o passo de carregamento. </li><li> Remover a tampa do aparelho de gel. Carregar 13 ul de cada amostra para os poços. Coloque as amostras seguindo a ordem relatado na Fig3B ure. </li><li> Substituir a tampa do aparelho de gel. Ligue os fios do aparelho de gel para o fornecimento de energia. Verifique se os eletrodos estão ligados nos slots corretos no fornecimento de energia. </li><li> Ligar a energia e executar o gel durante 2 horas e 30 minutos a uma voltagem constante de 200 V, até que o corante tenha migrado para a 1,5 cm acima do fundo do gel. </li></ol></li><li> Preparação de Amostras: Modo de Oligo-pré-incubação vs modo NC-pré-incubação <ol><li> Dilui-se o composto 1 solução estoque. Preparar 10 uL de 500 uM, a 250 uM, 50 uM, 5 uM de diluição do composto 1 em água MilliQ. </li><li> Prepare amostras de controlo conforme relatado acima (ponto 3.2.). </li><li> Use 2,5 ul de solução de oligonucleótido 4 uM para cada amostra. Sempre preparar uma pequena quantidade em excesso de cada solução para evitar erros de pipetagem. Dobre 27,5 l de 4 mm de solução de TAR e, separadamente, de CTAR em tampão TNMG 1x como acima mencionado (passo 3.2.1.). </li><li> Diluir a solução estoque de ambos proteína NC e (12-55) NC peptídeo a 80 um solução em água. </li><li> Quando soluções de alcatrão e CTAR são arrefecidos a RT, realizar uma centrifugação de curta rotação de ambos os tubos e começar a preparação das amostras. </li><li> Substitua sempre dicas de cada vez que os reagentes são alterados ou se qualquer outro líquido ou solução contida no tubo de reacção é tocado. </li><li> A partir deste passo em certificar-se de rotular e separar claramente as amostras para os dois procedimentos de pré-incubação diferentes. <ol><li> Modo de oligo-pré-incubação <ol><li> Prepare 10 vazios 0,5 ml tubos autoclavada. Coloque 2 fileiras de 5 tubos no rack para as amostras de laboratório. </li><li> Adicionar em cada tubo da primeira linha 2.5 l de TAR dobrado. Adicionar em cada tubo da segunda linha 2.5 l de dobrado CTAR. </li><li> Adicionar 2 ul do composto adequado 1 diluição (concentração crescente a partir das 5 uM a diluição a 500 uM) para a TAR e CTAR.Substituir o composto com água nas amostras para a análise de NC na ausência de composto. Incubar as amostras durante 15 min à TA. </li><li> Após 15 minutos de incubação, retirar as amostras CTAR (segunda linha) e colocá-los com as amostras correspondente tar (primeira linha). </li><li> Adicionar 1 ml de 80 uM NC para cada amostra e incubar as amostras durante 15 min à TA. </li><li> Após 15 minutos de incubação, adicionar 3 mL de GLB SDS, Pipeta cada tubo 3 vezes e colocar o tubo no gelo. Manter as amostras estável em gelo até que o passo de carregamento. </li></ol></li><li> NC-pré-incubação modo <ol><li> Prepare 5 vazios 0,5 ml tubos autoclavados e colocá-los no rack para as amostras de laboratório. </li><li> Adicionar em cada tubo 4 ul da diluição apropriada do composto 1 (a partir do aumento da concentração de 5 uM para a diluição de 500 uM). Substituir o composto com água nas amostras para a análise de NC na ausência de composto. </li><li> Adicionar em cada tubo 1 ml de 80 μ; H NC e incubar as amostras durante 15 min à TA. </li><li> Misturar 15 ul de TAR dobrado com 15 ul de CTAR dobrada num tubo e usar esta solução TAR + CTAR no passo seguinte. </li><li> Após 15 min de incubação, adicionar a cada amostra 5 ul da solução de mistura TAR + CTAR e incubar as amostras durante 15 min à TA. </li><li> Após 15 minutos de incubação, adicionar 3 mL de GLB SDS, Pipeta cada tubo 3 vezes e colocar o tubo no gelo. Manter as amostras estável em gelo até que o passo de carregamento. NOTA: A partir do passo 3.5.8 em diante, a análise pode ser realizada com todas as amostras (retomar a partir de 3.5.7). </li></ol></li></ol></li><li> Remover a tampa do aparelho de gel. Carregar 13 ul de cada amostra para os poços. Coloque as amostras, seguindo a ordem relatado na Figura 4. </li><li> Substituir a tampa do aparelho de gel. Ligue os fios do aparelho de gel para o fornecimento de energia. Verifique se os eletrodos estão ligados nos slots corretos no suppl podery. </li><li> Ligar a energia e executar o gel durante 2 horas e 30 minutos a uma voltagem constante de 200 V, até que o corante tenha migrado para a 1,5 cm acima do fundo do gel. </li></ol></li></ol> 4. Retirar o Gel e Gel Coloração <ol><li> Após a eletroforese, desligue a fonte de alimentação e desconecte os cabos elétricos. Feche a torneira da água do sistema de arrefecimento e desligar as mangueiras a partir do núcleo. </li><li> Remover a tampa, e, se o sistema foi arrefecido, o núcleo de arrefecimento remover e deitar fora o tampão a partir de ambas as câmaras. </li><li> Suavemente desmontar a sanduíche de gel a partir do aparelho e remover todos os grampos a partir das placas de vidro. Para remover o gel das placas, empurrar um dos espaçadores para fora para o lado das placas e torcer-o suavemente para puxar para cima e para fora a placa de vidro superior. Segure dois cantos do gel e retire-o com cuidado para removê-lo a partir do vidro. </li><li> Colocar o gel num recipiente adequado com a solução de coloração de ácidos nucleicos desejada para30-45 minutos com agitação. </li><li> Após a coloração, colocar o gel sobre um sistema de imagem transiluminador para detectar ácidos nucleicos sinal de fluorescência no sistema de gel. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

NOME é um ensaio que permite avaliar rapidamente a inibição da actividade da chaperona da proteína da nucleocápside do HIV-1, um alvo interessante na busca de novas drogas anti-HIV. NC emparelha rápida e em ácidos nucleicos temperatura ambiente cuja dobrável estável de outro modo exigiria desnaturação térmica a alta temperatura seguido de recozimento cuidado. O ensaio pode ser realizado com qualquer um de comprimento completo ou NC com o truncado (12-55) NC: em ambos os casos, os dois ácidos nucleicos (RNA e a sua cópia complementar de DNA) são recozidos rapidamente. Esta observação é consistente com a literatura com o péptido truncado NC: recozimento é iniciada pela fusão eficiente da haste de CTAR seguido pela interacção do seu circuito complementar apical, que é um local de ligação mais fraca NC, com a sequência complementar de TAR circuito apical, 21 acabando por vários intermediários instáveis ​​para o híbrido recozido prorrogado. NC é um prot muito estávelein e alguns problemas enquanto NOME realizar poderia ocorrer. É muito importante, no entanto, adicionar SDS recém-preparadas no tampão de carregamento do gel utilizado para parar a reacção: se esta não for alcançada, o gel não apresentará as bandas de ácidos nucleicos nas posições correctas. Na verdade, NC é uma proteína de ligação de ácido nucleico, de modo que para visualizar correctamente TAR / CTAR heteroduplex por electroforese em gel de SDS deve estar presente no gel carregar Buffer para desnaturar a proteína e soltá-la do seu complexo apertado com os ácidos nucleicos. Esta é também uma possível solução de problemas do experimento, ou seja, a formação de bandas deslocadas durante o gel de execução. Este efeito é particularmente evidente quando a full-length NC foi empregada, como na Figura 2, e está relacionada com a presença da cauda do terminal N altamente básico, tendo um efeito de agregação forte em ácidos nucleicos. A presença da cauda de base de terminal faz com que a reacção de emparelhamento mais difícil de ser inibido, como mostran na Figura 3 utilizando o composto 1, um intercalator rosqueamento representativa, ou seja, um intercalator particularmente eficiente na estabilização das estruturas haste-laço de alcatrão e de CTAR. Na verdade, este tipo de interacção com os ácidos nucleicos é favorecido quando as protuberâncias e loops interromper a continuidade dupla hélice, o que permite uma mais fácil enfiamento dos substituintes volumosos em pares de bases. Estabilização do TAR e CTAR por esses ligantes de ácidos nucleicos foi anteriormente analisado pela determinação do aumento na temperatura de fusão dos dois oligonucleótidos. 14 Além disso, o aumento na temperatura de fusão correlaciona-se com a inibição do recozimento catalisada por HIV-1 NC, 14, levando à formação reduzida de heterodúplex TAR / CTAR e indicando que intercaladores de rosqueamento são uma classe interessante de ligantes para estruturas dinâmicas de ARN, tal como o elemento TAR. O mecanismo de ação chamado para estes compoUNDOS pode ser adicionalmente validado pela realização do ensaio NOME em diferentes formatos alternativos, como mostrado na Figura 4: no caso de intercaladores a inibição da heterodúplex recozido é aumentada quando o fármaco é incubado com os dois oligos dobradas. Os compostos que actuam com diferentes mecanismos de ação, tais como ligantes diretos da proteína NC, seria menos afetado pelos diferentes modo de pré-incubação. NOME ensaio realizado em dois métodos poderia, portanto, ser utilizados para rastrear bibliotecas de compostos para a identificação de inibidores de NC, e também para avaliar o mecanismo putativo de acção dos resultados positivos durante a procura de drogas anti-VIH dirigidos a NC. Claramente, a utilização destas técnicas por si só quando reclamar um mecanismo específico de acção dos inibidores identificados NC não é suficiente, e outros ensaios bioquímicos adequados são necessários para manter a hipótese de trabalho. 14 Finalmente, deve-se ressaltar que NAME usa altamenteenzimas purificadas ou recombinantes ou sintéticos, que dão informações valiosas sobre a inibição &quot;in vitro&quot; da NC pelos compostos testados. Esta é a &quot;força e fraqueza&quot; do ensaio: NAME pode bem complementar a triagem virtual e modelagem molecular abordagens nas etapas preliminares de programas de descoberta de drogas, possibilitando a construção rápida e analisar as relações estrutura-atividade e, eventualmente, redirecionando o projeto de síntese e de drogas. No entanto, como outros ensaios bioquímicos utilizados em projetos de desenvolvimento de medicamentos em HIV, NAME não vai dar informações sobre os efeitos de inibidores putativos em células infectadas por vírus.

A proteína da nucleocápside NCp7 (NC) do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) é uma pequena proteína, de base que está fortemente associado com o RNA genómico do vírus infeccioso madura, desempenhando um papel crucial na replicação do vírus como um cofactor de transcrição reversa durante , reconhecimento genoma, e acondicionamento. 1-3 NC actua como uma chaperona ácido nucleico catalisar a desestabilização de estruturas estáveis ​​de ácidos nucleicos e a ligação de sequências complementares. A sua actividade de ácido nucleico agregação reside principalmente nos 11 aminoácidos do domínio N-terminal enquanto que a actividade desestabilizar duplex tenha sido mapeada para as suas estruturas de dedo de zinco (12-55 peptídicos). 4 A proteína carregada positivamente diminui a barreira electrostática da reacção de recozimento e aumenta a taxa à qual duas sequências complementares separados se juntam. Os ácidos nucleicos dobradas em conformação estável exigem as atividades de acompanhante de NC para facilitate seu recozimento 5 Isto é particularmente importante na transcrição reversa, em que NC é crítica em eventos de transferência de cadeia:. na transferência de cadeia negativa, o ADN de cadeia negativa de paragem, apenas retrotranscrito, deve ser transferido e hibridado com uma sequência complementar na região R no &#39;final do genoma de RNA molde 3. 6 Embora termodinamicamente favorecida, esta reacção não ocorre extensivamente na ausência de NC, devido à presença da estrutura estável da activação trans região sensível (TAR) de RNA nas regiões I, que deve ser associado à sua cópia de DNA (CTAR DNA). 7 regiões CTAR e TAR são, de fato, altamente estruturadas com uma conformação stem-loop de característica. Proteína NC desnatura esses grampos, e promove a transferência de cadeia menos pelo aumento da taxa de hibridação intermolecular entre as cadeias complementares de ácidos nucleicos. O mecanismo da NC recozimento de TAR e CTAR foi exaustivamente investigado e dedescrito como ensaio TAR recozimento em vários trabalhos de pesquisa e o esquema proposto é retratado em excelentes críticas. 8-11 Resumindo, NC desestabiliza a estrutura secundária do RNA estável, como TAR-RNA, desestabiliza a estrutura secundária da sua sequência complementar, CTAR-DNA , e promove a reacção de emparelhamento de ARN / ADN que conduz à TAR / CTAR formação heteroduplex 10,11. Como resultado, o passo de transferência de cadeia durante a replicação do HIV é favorecida. 12 NC é um alvo atractivo para o desenvolvimento de novos agentes antivirais desde a interferência potencial induzida por moléculas pequenas no sentido de NC resultaria numa redução da transcrição reversa do genoma viral como consequência de uma actividade de NF comprometida. 2,13 Esta abordagem poderá em última análise, levar ao desenvolvimento de agentes anti-HIV bem sucedidas. No decurso de um rastreio para inibidores de NF 14 foi desenvolvido um ensaio baseando-se nas propriedades bem conhecidosde nucleocapsid desestabilizar eficiente e recozimento oligonucleotídeos complementares 10,11. Nós o chamamos de N ucleocapsid A nnealing- M ediated E lectrophoresis (NAME) ensaio. NOME ensaio utiliza NC para mediar o emparelhamento entre cópias estavelmente estruturadas de ácidos nucleicos complementares, no nosso caso do oligonucleótido correspondente à parte apical de uma sequência TAR-ARN com a sequência de ADN complementar (CTAR) para produzir o híbrido TAR / CTAR heteroduplex . A análise do TAR / CTAR reacção de emparelhamento na presença de NC podem ser investigados por electroforese em gel de poliacrilamida nativo (PAGE). Este protocolo demonstra como realizar o ensaio NOME recozer rapidamente a temperatura ambiente oligonucleótidos dobradas em estruturas em gancho de cabelo estável, como analisar o resultado da reacção e possível resolução de problemas do experimento. Marcação radioactiva do ácido nucleico não é solicitada, e DETECTIem bandas de oligonucleótidos pode ser realizada por métodos convencionais de coloração. O ensaio, que emprega, quer a proteína de comprimento total recombinante ou uma versão sintética truncada de NC, permite a identificação de inibidores de roscar intercaladores NC, uma actividade correlacionam-se com forte ligação ao RNA e DNA 14.

<table><tbody><tr><td>cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified.</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>Store the stock&amp;nbsp; solution at -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>Store the stock aliquot at -80 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>(12-55)NC peptide</td><td>EspiKem srl</td><td></td><td>Store the stock solution at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120 086</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>0.5 ml tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121 023</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tips 0.1-10 &amp;micro;l</td><td>Sarstedt</td><td>701,130,210</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tips 2-20 &amp;micro;l</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tips 200&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filter 0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Biosigma srl</td><td>51,798</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414631</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71725-50G</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-1L</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Perchlorate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>222283-100G</td><td>Store the 1&amp;nbsp;M solution at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49770-1L</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1329-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Tetramethylethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7460-500G</td><td>Prepare the 10% solution freshly before use</td></tr><tr><td>Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1)</td><td>Merck Millipore</td><td>1006401000</td><td>Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting</td></tr><tr><td>Tris ultrapure</td><td>Applichem</td><td>A1086,1000</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-treated water</td><td>Ambion</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>22,621,408</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS spectrometer Lambda 20</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-1803</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>SybrGreen II RNA Gel Staining</td><td>Lonza</td><td>50523</td><td>Make the 1/10,000 dilution in TBE 1x. Store it in the dark at 4&amp;nbsp;&amp;deg;C for two weeks.</td></tr><tr><td>Geliance 600 Imaging System</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nucleocapsid annealing-mediated electrophoresis (name) assay allows the rapid identification of hiv-1 nucleocapsid inhibitors

ARN ou ADN dobrado na dobragem tridimensional estável são alvos interessantes para o desenvolvimento de drogas anti-tumor ou anti-virais. No caso do HIV-1, as proteínas virais envolvidas na regulação da actividade do vírus reconhecem vários ácidos nucleicos. A proteína da nucleocápside NCp7 (NC) é uma proteína chave que regula diversos processos durante a replicação do vírus. NC é, de facto, uma chaperona desestabilizar as estruturas secundárias de ARN e ADN e facilitando o seu recozimento. A inactivação de NF é uma nova abordagem e um alvo interessante para a terapia anti-HIV. O N ucleocapsid A nnealing- M ediated E lectrophoresis (NAME) ensaio foi desenvolvido para identificar moléculas capazes de inibir a fusão e recozimento de RNA e DNA dobrado em conformações tridimensionais termodinamicamente estáveis, como as estruturas do hairpin de alcatrão e elementos CTAR de HIV, por a proteína da nucleocápside do HIV-1. O novo ensaio utiliza quer a recombinant ou a síntese de proteínas, oligonucleótidos e sem a necessidade da sua rotulagem anterior. A análise dos resultados é conseguida através de electroforese em gel de poliacrilamida padrão (PAGE) seguido de coloração de ácido nucleico convencionais. O protocolo relatado no presente trabalho descreve como realizar o ensaio NOME com a proteína de comprimento completo ou a sua versão truncada sem o domínio N-terminal de base, tanto competente como ácidos nucleicos acompanhantes, e a forma de avaliar a inibição da actividade por uma chaperona NC enfiando intercalator. Além disso, NOME pode ser realizada de dois modos diferentes, útil para obter indicações sobre o mecanismo putativo de acção dos inibidores identificados NC.

A Figura 1 mostra um resultado representativo do ensaio Nucleocápside recozimento Mediada por electroforese (NOME), realizada de i) com a proteína recombinante de comprimento total, ii) sem a proteína, isto é, misturando CTAR + TAR e incubando até 1 hora à temperatura ambiente, e iii ) o mesmo ensaio realizado com (12-55) NC, um péptido sintético sem os 11 aminoácidos do domínio N-terminal. O TAR pré-dobrada e CTAR foram misturados e a formação do heteroduplex TAR recozido / CTAR foi monitorizada na presença de todo o comprimento recombinante NC (faixas da esquerda da Figura 1), na ausência de proteína (pistas centrais da Figura 1 ), e na presença de (12-55) NC de péptidos truncados (as colunas da direita na Figura 1). Os controles são: dobrado CTAR, dobrado TAR, e recozido híbrido (TAR / CTAR), obtidos por meio de desnaturação térmica das estruturas de forma estável dobradas de TAR para CTAR seguido do seu annealin lento14 g. A capacidade de NC para desnaturar duas sequências de ácido nucleico estáveis ​​na hélice heterodúplex estendido é claramente evidente: a proteína de comprimento completo NC conduz imediatamente a uma formação do TAR / CTAR híbrido: 0 &#39;indica o tempo mínimo que passa entre a adição do NC as amostras e adição de tampão de carregamento de gel, o que pára a reacção; formação completa já é conseguido depois de 15 &#39;de tempo de incubação. O aumento da intensidade do heteroduplex recozido paralelo com a diminuição da intensidade das CTAR e TAR oligonucleótidos dobradas. A formação do heteroduplex é conseguida também na presença da forma truncada, ou seja, a (12-55) NC, confirmando a actividade biológica do péptido sintético. Na ausência da proteína ou do péptido a formação de heteroduplexes não é observada, e TAR e oligonucleótidos CTAR não irá hibridar à temperatura ambiente em heterodúplex (Figura 1). Emtodas as experiências, a formação rápida de produtos intermédios instáveis ​​complexos (&quot;intermédios&quot; na Figura 1) que diminuem ao longo do tempo é observada, de forma consistente com o mecanismo proposto de troca de cadeias através dos ganchos de CTAR TAR e até que os ácidos nucleicos correctas dobragem 17. Uma possível solução de problemas da experiência é a falta de SDS em gel carregar o buffer. Na ausência de SDS na GLB do resultado da reacção é mostrado na Figura 2 e comparada com os resultados com GLB + SDS. O TAR pré-dobrada e CTAR foram misturados e incubados durante 3 horas à temperatura ambiente por 3 h a 37 ° C com a proteína de comprimento completo NC recombinante. Após incubação, as amostras foram divididas em duas partes: a uma metade de gel tampão de carga, sem SDS (GLB) foi adicionada, enquanto a outra metade foi GLB com SDS (SDS GLB). As amostras foram carregadas no gel, e a posição das bandas de ácidos nucleicos foi visualizado depois de o gel ser executado pelacoloração com corante. Quando NC estava presente, mas as amostras foram carregadas com GLB, todos os ácidos nucleicos bandas foram deslocados para cima: este é esperado e indica uma forte ligação entre a proteína e os ácidos nucleicos. Os resultados com GLB SDS são mostrados no extremo direito do gel: a adição de SDS desnatura a proteína e liberta os ácidos nucleicos a partir do complexo estável com a proteína, o que permite a comparação com os controlos. O ensaio NOME é utilizado para avaliar a capacidade de enfiar intercaladores para estabilizar as estruturas de ácido nucleico dinâmicos e inibir a actividade de chaperona NC. 14 intercaladores de Threading são moléculas planares aromáticas substituídas por cadeias laterais volumosas localizados nos locais opostos do sistema de anel, tais como a antraquinona mostrado na Figura 3A. 18 Estes intercaladores são capazes de fio através da dupla hélice de ácidos nucleicos, finalmente, localizando as suas cadeias laterais em cada sulco da duplahélice 19,20. A Figura 3B mostra o resultado do ensaio NOME na presença de um composto, um intercalador de enfiamento conhecida, 18 na presença de NC de tamanho total ou do péptido truncado. Em ambos os casos, a formação do híbrido TAR / CTAR por NC é reduzida através do aumento da concentração do intercalador, enquanto, ao mesmo tempo, a quantidade de TAR e CTAR livre aumenta. A forma truncada da proteína a que falta o N-terminal da cauda (12-55NC) é mais sensível à inibição da sua actividade: esta diferença foi verificada com todos os compostos ensaiados até agora. O ensaio NOME pode ser realizada de duas maneiras, quer por pré-incubação do composto de ensaio com NC, seguido pela adição dos oligonucleótidos dobradas (modo NC-pré-incubação), ou por pré-incubação do composto de ensaio durante 15 minutos com os substratos de ácidos nucleicos dobradas , seguido por adição de NC e uma incubação adicional durante 15 minutos (oligo-prModo eincubation). Embora o tempo total de incubação, é a mesma nos dois modos diferentes, a pré-incubação com os oligonucleótidos dobradas antes da adição do NC permite mais tempo para o enfiamento dos intercaladores para o ácido nucleico dobrado. Isto resulta numa forte estabilização das suas estruturas dinâmicas e em uma inibição mais fácil de actividades chaperonas NC. A análise do ensaio NOME nos dois modos, por conseguinte, aumenta a diferenças no mecanismo de acção dos inibidores da NC, como mostrado na Figura 4: quando o composto 1 foi analisada por NAME no modo de oligo-pré-incubação (Figura 4, pistas do lado esquerdo) ele mostra uma inibição potente de recozimento NC-mediada, enquanto que a inibição observada é muito menor no modo de pré-incubação NC-(Figura 4, pistas do lado direito). Por favor, note que, para a determinação das concentrações inibitórias o rastreamento conjuntos de compostos relacionados com este ensaio e nestas condições, cada uma experimento devem ser realizados pelo menos em triplicado usando concentrações espaçados (especialmente em torno do valor de IC 50). 14 <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Ensaio NAME com full-length NC e com o (12-55) NC TAR e CTAR, cada 1 PM truncado Dobrado, foram incubadas com recombinante NC ou com (12-55) NC (oligos / NC = 1 / 8) para 0 min, 15 min, 30 min e 1 h. TAR e CTAR incubadas na ausência de proteína (0 min, 15 min, 30 min e 1 hora) foram usados ​​como controlo negativo. TAR dobrado, dobrado CTAR eo TAR híbrido / CTAR obtido após desnaturação térmica seguida de recozimento in vitro foram utilizados como controle. As reações foram, então, parou de usar GLB SDS. As amostras foram resolvidas num gel de poliacrilamida a 12% em TBE 1x; depois de ácidos nucleicos de electroforese no gel foram coradas e detectadas num transiluminador. <html><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Efeito da SDS em tampão de carga gel (GLB) ao analisar TAR / CTAR recozimento por NC TAR e CTAR, prefolded em TNMG 1x, foram incubadas com full-length recombinantes NC (oligos / NC = 1/8) para 3 h à temperatura ambiente ou a 37 ° C. GLB GLB SDS ou foram então adicionados às amostras incubadas com NC. Controles: TAR, CTAR eo TAR híbrido recozido / CTAR (cada 1 PM). A electroforese foi realizada utilizando um gel de poliacrilamida a 12% em TBE 1x; depois de ácidos nucleicos de electroforese no gel foram coradas e detectadas num transiluminador. Esta figura foi modificado a partir da Figura S4 de:. Sosic, A. et al projeto, síntese e avaliação biológica de TAR e ligantes CTAR como HIV-1 inibidores nucleocapsídio MedChemComm 4, 1.388-1.393, doi:. 10,1039 / c3md00212h (2013) . &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig3highres.jpg" /> Figura 3: (A) estrutura química do rosqueamento intercalador 1. (B) Efeito de enfiar intercalador 1 avaliada por ensaio NOME. Folded TAR e CTAR, cada 1 uM, foram incubadas na presença das concentrações indicadas do composto 1 com o comprimento total ou com o NC (12-55) CN, 8 uM cada. TAR dobrado, dobrado CTAR eo TAR heteroduplex prorrogado / CTAR foram utilizados como controle. As reações foram, então, parou de usar GLB SDS. As amostras foram resolvidas num gel de poliacrilamida a 12% em TBE 1x; depois de ácidos nucleicos de electroforese no gel foram coradas e detectadas num transiluminador. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig4highres.jpg" /> Figura 4: Oligo-pré-incubação modos versus NC-pré-incubação: efeitos sobre o ensaio de pré-incubação NOME Oligo-mod.e: TAR dobrado e dobrado CTAR, cada 1 uM, foram pré-incubadas com as concentrações indicadas do intercalador rosqueamento 1 para 15 min, e em seguida, durante mais 15 minutos na presença de todo o comprimento NC (8 uM) NC-pré-incubação. Modo: as concentrações indicadas do intercalador rosqueamento 1 foram pré-incubadas com o comprimento total NC (8 uM), durante 15 minutos, e, em seguida, durante mais 15 minutos na presença de TAR dobrado e dobrado CTAR, cada 1 uM. TAR dobrado, dobrado CTAR eo TAR heteroduplex prorrogado / CTAR foram utilizados como controle. Todas as reacções foram, finalmente, parou de usar GLB SDS. As amostras foram resolvidas num gel de poliacrilamida a 12% em TBE 1x; depois de ácidos nucleicos de electroforese no gel foram coradas e detectadas num transiluminador.

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Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocápside Annealing-Mediated Eletroforese (NAME) ensaio permite a identificação rápida de HIV-1 Nucleocápside Inibidores

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

8.9K visualizações.  University of Padova. This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

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In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

Em desencapsulamento vitro do HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imunologia e Infecção

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and host cell proteins on viral DNA synthesis. Here we address the lack of a cell-based, high-coverage, and high-resolution assay that is capable of defining retroviral reverse transcription intermediates within the physiological context of virus infection. The described method captures the 3'-termini of nascent complementary DNA (cDNA) molecules within HIV-1 infected cells at single nucleotide resolution. The protocol involves harvesting of whole cell DNA, targeted enrichment of viral DNA via hybrid capture, adaptor ligation, size fractionation by gel purification, PCR amplification, deep sequencing, and data analysis. A key step is the efficient and unbiased ligation of adaptor molecules to open 3'-DNA termini. Application of the described method determines the abundance of reverse transcripts of each particular length in a given sample. It also provides information about the (internal) sequence variation in reverse transcripts and thereby any potential mutations. In general, the assay is suitable for any questions relating to DNA 3'-extension, provided that the template sequence is known.

Here we present a deep sequencing approach that provides an unbiased determination of nascent 3&#39;-termini as well as mutational profiles of single-stranded DNA molecules. The main application is the characterization of nascent retroviral complementary DNAs (cDNAs), the intermediates generated during the process of retroviral reverse transcription.

Determinante 3'-Termini e sequências de moléculas de ADN Viral de Single-Stranded nascente durante o HIV-1 inverter transcrição em células infectadas

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Genética

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Triagem rápida de HIV transcriptase reversa e integrase Inibidores

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Crescimento Pairwise competição ensaio para determinar a replicação de Fitness de Imunodeficiência vírus humanos

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Medição de<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

Métodos de alternativas In Vitro para a determinação da integridade estrutural do capsídeo Viral

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious cycle further requires the formation of viral/host protein complexes with HIV-1 RNA to regulate the splicing and enable nucleocytoplasmic transport. The HIV-1 Rev protein accomplishes the nuclear export of HIV-1 mRNAs through multimerization with intronic cis-acting targets - the Rev response element (RRE). A nucleolar localization signal (NoLS) exists within the COOH-terminus of the Rev arginine-rich motif (ARM), allowing the accumulation of Rev/RRE complexes in the nucleolus. Nucleolar factors are speculated to support the HIV-1 infectious cycle through various other functions in addition to mediating mRNA-independent nuclear export and splicing. We describe an immunoprecipitation method of wild-type (WT) Rev in comparison to Rev nucleolar mutations (deletion and single-point Rev-NoLS mutations) in the presence of HIV-1 replication for mass spectrometry. Nucleolar factors implicated in the nucleocytoplasmic transport (nucleophosmin B23 and nucleolin C23), as well as cellular splicing factors, lose interaction with Rev in the presence of Rev-NoLS mutations. Various other nucleolar factors, such as snoRNA C/D box 58, are identified to lose interaction with Rev mutations, yet their function in the HIV-1 replication cycle remain unknown. The results presented here demonstrate the use of this approach for the identification of viral/host nucleolar factors that maintain the HIV-1 infectious cycle. The concepts used in this approach are applicable to other viral and disease models requiring the characterization of understudied pathways.

Here we describe Rev immunoprecipitation in the presence of HIV-1 replication for mass spectrometry. The methods described can be used for the identification of nucleolar factors involved in the HIV-1 infectious cycle and are applicable to other disease models for the characterization of understudied pathways.

Identificação de fatores nucleolares durante a replicação do HIV-1 através da imunoprecipitação de Rev e espectrometria de massas

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...

Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle (VLP)-Based Vaccines Using a Capture Assay

The virus-like particle (VLP) capture assay is an immunoprecipitation method, commonly known as a &#39;pull-down assay&#39; used to purify and isolate antigen-displaying VLPs. Surface antigen-specific antibodies are coupled to, and thus immobilized on a solid and insoluble matrix such as beads. Due to their high affinity to the target antigen, these antibodies can capture VLPs decorated with the cognate antigen anchored in the membrane envelope of the VLPs. This protocol describes the binding of antigen-specific antibodies to protein A- or G-conjugated magnetic beads. In our study, human immunodeficiency virus (HIV)-derived VLPs formed by the group-specific antigen (Gag) viral core precursor protein p55 Gag and displaying the envelope glycoproteins (Env) of HIV are examined. The VLPs are captured utilizing broadly neutralizing antibodies (bNAbs) directed against neutralization-sensitive epitopes in Env. The VLP capture assay outlined here represents a sensitive and easy-to-perform method to demonstrate that (i) the VLPs are decorated with the respective target antigen, (ii) the surface antigen retained its structural integrity as demonstrated by the epitope-specific binding of bNAbs used in the assay and (iii) the structural integrity of the VLPs revealed by the detection of Gag proteins in a subsequent Western blot-analysis. Consequently, the utilization of bNAbs for immunoprecipitation facilitates a prediction of whether VLP vaccines will be able to elicit a neutralizing B cell response in vaccinated humans. We anticipate that this protocol will furnish other researchers with a valuable and straightforward experimental approach to examine potential VLP-based vaccines.

Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle VLP-Based Vaccines Using a Capture Assay

Here, we present a protocol to detect neutralization epitopes on antigen-displaying virus-like particles (VLPs). Immunoprecipitation of the human immunodeficiency virus (HIV)-derived VLPs is performed using envelope glycoproteins-specific monoclonal antibodies coupled to protein G-conjugated magnetic beads. Captured VLPs are subsequently subjected to SDS-PAGE and Western blot-analysis employing viral core protein Gag-specific antibodies.

Detecção de epítopos sensíveis à neutralização em antígenos exibidos em vacinas baseadas em partículas semelhantes a vírus (VLP) usando um ensaio de captura

The virus-like particle (VLP) capture assay is an immunoprecipitation method, commonly known as a &#39;pull-down assay&#39; used to purify and isolate ...