A fotoconversão fornece um método in vivo rastreável para a análise quantitativa da saída de leucócitos para uma visão mecanicista sobre a residência leucócito e a dinâmica de saída de múltiplos sítios teciduais em estados doentes. Bem, aqui demonstramos a utilidade do rastreamento de leucócitos de tumores cutâneos. A aplicação deste ensaio a outros tecidos e doenças é limitada apenas pela capacidade de administrar a luz.
A principal vantagem dessa técnica é que permitir a quantificação de populações endógenas, em vez de transferir populações de células imunes como saída de tecidos inflamados in vivo. Para induzir a inflamação, após confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo do dedo, use uma micropipette para administrar 20 microlitradores de ftalato de dibutil ou DBP, para o lado ventral do pina auditivo de um rato transgênico Kaede anestesiado. Depois de permitir que o DBP seque, puxe a orelha através de uma fenda em um pedaço de papel alumínio e use fita dupla face para fixar a orelha fixamente à folha com o lado dorsal voltado para cima.
Então, posicione que você está diretamente sob uma fonte de luz de 405 nanômetros e fotoconvertido por três minutos a 100 miliwatts de potência. Para infecção por vaccinia, use uma micropipette para administrar 5 vezes 10 a 6ª placa formando unidades do vírus da vaccinia em 10 microliters de PBS no fone de ouvido de um rato transgênico Kaede anestesiado e cutuque o pinna 25 vezes. 24 horas depois, fotoconverta o pinna como apenas demonstrado.
No momento experimental apropriado, colmam o pináculo e os linfonodos cervicais e inguinais e use dois pares de pinças para descascar o lado ventral e dorsal de cada pinna. Em seguida, coloque os linfonodos e os pedaços de pinna, com o interior da orelha virado para baixo, em poços individuais de uma placa de 24 poços contendo 1 miligrama por mililitro de Colagenase D e 80 unidades por mililitro de Dna diluído em HBSS contendo cálcio e magnésio. Use duas agulhas de calibre 29 para provocar a abertura de cada cápsula de linfonodo e coloque a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos.
No final da incubação, pressione os tecidos de pináculo e linfonodos digeridos através de coador de células de nylon de 70 micron para obter suspensões celulares únicas de cada tecido. Quando os tumores crescerem para o tamanho experimental apropriado, raspe qualquer pele recém-recreada ao redor do local do tumor e puxe o tumor através de um buraco circular cortado em um pedaço de papel alumínio. Posicione o tumor diretamente abaixo da fonte de luz de 405 nanômetros e fotoconverte por 5 minutos a 200 miliwatts de potência.
24 horas após a fotoconversão, colher os tumores e linfonodos braquiais e inguinais de cada animal e usar uma tesoura para picar os tumores dentro de poços individuais de uma placa de 24 poços contendo Colagenase D e DNase no HBSS. Coloque os linfonodos em poços separados e provoque abrir as cápsulas como apenas demonstrado. Depois de incubar os tumores por uma hora e os linfonodos por meia hora a 37 graus Celsius, pressione os tecidos digeridos através de 70 coadors de micron separados para obter suspensões celulares únicas de cada tecido.
Para analisar as suspensões de células únicas por citometria de fluxo, primeiro coletar o baço ou o sangue de um rato transgênico Kaede e lise os glóbulos vermelhos com tampão de potássio de cloreto de amônio. Divida as células em um Kaede FITC não convertido e uma população de Kaede PE convertida e resuspenda as células kaede pe de cor única em um mililitro de PBS em um poço de uma placa de 24 poços, em seguida, fotoconvertir as células por 5 minutos sob uma fonte de luz de 405 nanômetros a 100 miliwatts de potência. Em seguida, use as células de Kaede PE fotoconvertidas e as células Kaede FITC não convertidas para definir as tensões fotomultiplier para 70 a 80% da faixa total de cada canal fluorescente.
Uma vez definidas as tensões para as proteínas Kaede, compense todas as outras manchas de anticorpos primários usando contas de compensação rotuladas por fluorohore único, de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, execute as amostras no citômetro de fluxo de acordo com os protocolos de análise citométrica de fluxo padrão. Suspensões de células únicas geradas a partir da pele do ouvido ou linfonodos cervicais de drenagem imediatamente após a exposição à fotoconversão revelam uma eficiência de conversão de 78% de todos os leucócitos positivos CD45 na pele, sem células convertidas observadas nos linfonodos drenantes.
Quantificação dos números de leucócitos positivos CD45 infiltrados em orelhas fotoconvertidas zero e 24 horas após a conversão, revela que a exposição à luz violeta causa um aumento estatisticamente significativo na infiltração de leucócitos. Este aumento na infiltração de leucócitos positivos cd45, no entanto, é pequeno em relação à infiltração induzida por um potente estímulo inflamatório, como o vírus da vaccinia. A fotoconversão também aumenta a permeabilidade vascular no pináculo do ouvido medida pelo ensaio de Miles, indicando juntos que os efeitos da luz violeta na inflamação tecidual devem ser considerados ao otimizar a dose, o tempo de exposição e a interpretação dos dados.
A análise citométrica de fluxo de células tumorais dissociadas de animais fotoconvertidos revela uma conversão significativa de células positivas cd45 intratumoral de Kaede FITC positivo para Kaede PE positivo, enquanto as células linfonodas de drenagem permanecem inconvertidas. A eficiência da fotoconversão dos leucócitos positivos CD45 variou significativamente entre tipos e tamanhos tumorais, com leucócitos positivos CD45 dentro de pequenos tumores de melanoma demonstrando a fotoconversão mais eficiente. À medida que os volumes tumorais aumentam, a eficiência de conversão diminui para cerca de 50% Notavelmente, a melanina tem um impacto impressionante na eficiência da fotoconversão com uma fotoconversão máxima de células positivas CD45 observadas dentro de tumores produtores de melanina de apenas cerca de 30% em tumores menores, que cai para 10% à medida que os volumes tumorais se aproximam de 400 milímetros cúbicos.
O exame de tumores drenando linfonodos 24 horas após a fotoconversão revela a presença de células imunes positivas de Kaede de vários fenótipos, demonstrando assim a emigração leucócito do tumor fotoconvertido. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da Imunologia descobrirem a cinética do estado estável e a rotatividade inflamada de leucócitos no tecido periférico. Ao tentar esse procedimento, é importante garantir que apenas o tecido de interesse seja fotoconvertido, pois a fotoconversão inadvertida do tecido circundante comprometerá seus resultados.
Indivíduos novos nesse método devem otimizar o tempo de exposição para conversão de seu tecido, bem como a duração dos tempos antes da coleta de tecidos ocorrer com base na dinâmica do leucócito de interesse.
