O autor agradece a Doug por seu constante encorajamento e apoio inabalável, bem como aos membros do laboratório Melton por seus comentários úteis e comentários sobre o manuscrito. O autor também gostaria de agradecer ao Escritório de Recursos Animais de Harvard (OAR) por seus cuidados dedicados aos animais.

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes da IACUC (Protocolo #: 11-32) e AAALAC na Universidade de Harvard.
1. Preparação de soluções e configuração para anestesia e recuperação
<ol><li>Prepare uma solução fresca de 0,1% de tricaine para anestesia e solução de sal de sódio sulfameraína de 0,5% para recuperação. Tornar as soluções usando água adequada para a criação axolotl37 de acordo com protocolos aprovados da IACUC na instituição de pesquisa relevante (modificação da solução de Holtfreter, por exemplo). Certifique-se de que as soluções estão bem misturadas e que o volume suficiente é preparado para submergir todo o axolotl.<ol>
<li>Para preparar 0,1% de solução tricaina, misture 1 g de tricaine e 1 g de bicarbonato de sódio com 1 L de água. A solução pode ser ampliada de acordo com esta receita.</li>
		<li>Para preparar 0,5% solução de sal de sódio sulfamerazina, misture 5 g de sal de sódio sulfamerazina com 1 L de água. A solução pode ser ampliada de acordo com esta receita. A solução de sulfamerazina é um anti-biótico que evitará infecção bacteriana durante a recuperação cirúrgica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Higienize a área cirúrgica pulverizando-a com Clidox-S ou 70% de etanol. Esterilizar ferramentas cirúrgicas (fórceps, tesoura dissecando, tesoura de mola) por autoclavagem. Se realizar múltiplas cirurgias, certifique-se de esterilizar as ferramentas cirúrgicas com um esterilizador de contas quentes entre os animais.</li>
	<li>Para configurar a área de recuperação, coloque uma placa de Petri de 15 cm ou qualquer recipiente que se encaixe no axolotl em cima de um balde cheio de gelo molhado. Encha a placa de Petri com um baixo nível de 0,5% de solução de sal de sódio sulfamerazina, o suficiente para que o axolotl não fique totalmente submerso. A recuperação do gelo pós-cirurgia irá retardar o movimento do animal enquanto ele acorda da anestesia, permitindo que a área suturada se cure relativamente intacta. NOTA: Esta configuração pode ser personalizada pelos pesquisadores, dependendo dos materiais disponíveis.</li>
</ol>2. Realizando o procedimento cirúrgico de retalho de pele completo
<ol><li>Anestesiar o axolotl submerse-o em um recipiente de 0,1% de solução tricaina. Isso levará aproximadamente 15-20 minutos. Certifique-se de que o axolotl está de fato totalmente anestesiado, realizando uma pitada de cauda. Se não houver resposta do axlotl, prossiga com a cirurgia. NOTA: Use axlotls mais antigos e maiores para esta cirurgia (pelo menos 15 cm de tamanho). Certifique-se de que o axlotl permanece bem hidratado durante toda a cirurgia, molhando a pele periodicamente com água do sistema axolotl usando uma pipeta plástica. Certifique-se de preparar aseticamente o local cirúrgico irrigando a área com PBS estéril antes da cirurgia. O animal também deve ser colocado em uma cortina cirúrgica estéril para o procedimento.</li>
	<li>Realize uma amputação de membro na extremidade distal dos elementos esqueléticos zeugopodial utilizando a tesoura dissecando (Figura 1.1).</li>
	<li>Utilizando a tesoura de mola, faça uma pequena incisão (aproximadamente 2 mm) na porção ventral da pele (Figura 1.2).</li>
	<li>Usando os fórceps, retire cuidadosamente a pele para aproximadamente a linha média dos elementos esqueléticos zeugopodial, expondo os tecidos subjacentes dos membros (músculo, osso, etc.) (Figura 1.3). Certifique-se de não danificar a pele. Veja nota após o passo 2.8.</li>
	<li>Ampute os tecidos de membros subjacentes expostos na linha média do zeugopode usando tesoura cirúrgica (Figura 1.4).</li>
	<li>Empurre o tecido muscular com a tesoura cirúrgica e corte o osso exposto. NOTA: Isso é necessário para garantir uma melhor cicatrização e também para aumentar o sucesso da cirurgia, pois o osso saliente pode ser irregular contra a aba suturada e interromper a integridade de uma aba de pele intacta mais tarde.</li>
	<li>Utilizando os fórceps, puxe cuidadosamente a pele extra de espessura total sobre o plano de amputação para cobrir os tecidos subjacentes expostos e a sutura no lugar, conectando-se com a pele de espessura total ventral (Figura 1.5).</li>
	<li>Suturar os lados esquerdo e esquerdo restantes da aba da pele nas porções ventrais subjacentes da pele intacta. Isso pode ser feito suturando os lados da aba de forma "cruz cruzada" (recomendada) (Figura 1.6-1.9), ou simplesmente suturando diretamente na pele ventral. Use as fórceps e a tesoura de mola curvada para sutura. Certifique-se de que nenhum tecido subjacente exposto possa ser visto e que as suturas estejam amarradas (amarradas pelo menos três vezes). NOTA: É fundamental que a pele intacta não esteja danificada nas etapas 2.4, 2.7-2.8. Descobrimos que os danos na pele de espessura total foram correlacionados com cirurgias mal sucedidas, pois as áreas de dano ainda podem formar uma pequena epiderme ferida. Se possível, tente usar um par de fórceps mais maçante ao entregar a aba de pele de espessura total.</li>
	<li>Realize uma amputação no membro contralateral (controle animal interno opcional) amputando-o no nível médio do zeugopod com uma tesoura cirúrgica. Empurre o tecido muscular com uma tesoura cirúrgica e corte o osso exposto. NOTA: Um controle interno do membro contralateral pode ser feito para avaliar melhor o sucesso da cirurgia durante a etapa 4 no mesmo animal. No entanto, a amputação do mesmo membro em um animal separado também pode ser usada para servir como controle.</li>
</ol>3. Recuperação e cuidado pós-operatórios
<ol><li>Uma vez que a cirurgia esteja completa, coloque um Kimwipe ou uma toalha de papel estéril na parte inferior do recipiente ou placa de Petri para molhá-la. Coloque o animal no recipiente em gelo molhado e enrole delicadamente as extremidades expostas do Kimwipe ou toalha de papel ao redor do topo do animal para mantê-lo bem hidratado com solução de sulfamerazina. Deixe no gelo molhado por 30 minutos a 1 hora para garantir o movimento mínimo durante a recuperação da anestesia.</li>
	<li>Coloque o animal em um recipiente estático com solução de sulfamerazina de 0,5%. Os axolotes devem permanecer nesta solução durante as primeiras 24 horas, a fim de prevenir a infecção.</li>
	<li>Coloque o axlotl em água normal do sistema e monitore a saúde diariamente. Certifique-se de que nenhuma sutura caia todos os dias, pois isso pode resultar em uma pequena epiderme ferida formando que confundirá os resultados. NOTA: Certifique-se de que o recipiente de habitação tenha amplo espaço para o axololo se mover e minimizar as chances de que o membro suturado no axolotl possa entrar em contato com as laterais do recipiente. Isso ajudará a garantir que as suturas permaneçam no lugar, especialmente durante a primeira semana pós-cirurgia.</li>
</ol>4. Avaliar o sucesso da cirurgia sob um microscópio estéreo
NOTA: Recomendamos verificar animais sob um microscópio estereo pelo menos uma vez por semana para avaliar a integridade da retalho da pele completa e o sucesso da cirurgia.
<ol><li>Anestesiar o axlotl em 0,1% de tricaine como no Passo 2.1. Certifique-se de que há amplo espaço no recipiente para que o axolotl se mova.</li>
	<li>Se inspecionar durante as duas primeiras semanas pós-cirurgia, inspecione o membro suturado usando um estereoscópio para garantir que nenhuma sutura tenha surgido e que uma epiderme de ferida fina clara não seja visível em lugar nenhum. Se inspecionar na terceira semana pós-cirurgia ou posterior, certifique-se de que um blastema não tenha se formado e compare com a forma como o membro amputado de controle normal (seja do mesmo animal ou de um animal diferente) progrediu durante a regeneração (ou seja, se um blastema se formou).</li>
	<li>Quando feito, devolva o axolotl às condições normais de água do sistema e da pecuária.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo descreve um protocolo para a realização de cirurgias de retalhos de pele completas em membros axolotl para inibir a formação de epiderme de feridas. Embora esta cirurgia seja relativamente simples e tecnicamente reprodutível em comparação com outros métodos de inibição da formação de epiderme de feridas, existem várias etapas críticas que podem impactar o sucesso da cirurgia. Primeiro, ao puxar a aba de pele intacta sobre os tecidos subjacentes expostos, é primordial que a pele de espessura total não seja danificada de forma alguma. Danos na aba da pele ainda podem levar à formação de uma pequena epiderme de ferida, o que pode resultar em um pequeno crescimento semelhante a uma explosão. Em segundo lugar, garantir que as suturas não caiam durante o atendimento pós-operatório, pois isso também pode levar à formação de uma pequena epiderme ferida. Até este ponto, minimizar o contato potencial entre o membro suturado e quaisquer superfícies é importante, especialmente durante a primeira semana pós-cirurgia. Várias maneiras de prevenir isso implicam habitação e anestesiar o axolotl em um recipiente grande o suficiente para que o axolotl tenha muito espaço para se mover após a cirurgia.
Esta cirurgia também tem várias limitações. Talvez o mais notável seja que o sucesso das cirurgias só pode ser avaliado de duas maneiras: usar o escopo de dissecação durante as duas primeiras semanas de cirurgia para procurar a ausência de uma epiderme ferida e/ou verificar se uma blastema se forma dentro de 3 semanas. Embora esses métodos sejam eficazes, eles são relativamente baixos rendimentos. O desenvolvimento de futuros axolotis de repórter transgênicos para marcadores específicos de epiderme de feridas pode ajudar na triagem mais rápida para cirurgias bem sucedidas versus mal sucedidas. Além disso, esta cirurgia é mais difícil de realizar em animais mais jovens, pois a pele intacta é mais frágil. Recomenda-se, portanto, o uso de axlotls sub-adultos ou adultos.
Embora esta cirurgia tenha sido originalmente desenvolvida em N. viridiscens19, ela foi facilmente adaptada para axolotls25,39 e provavelmente pode ser aplicada a outras espécies de salamandra também. Em suma, a aplicação dessa técnica em futuros estudos regenerativos de membros capacitará os pesquisadores a desenvolver mais ferramentas para abordar a biologia da epiderme ferida e identificar os mecanismos subjacentes que conduzem sua função no início da formação de blastema.

Desde que Lazzaro Spallanzani o relatou em 17681, a regeneração de membros da salamandra tem sido um dos fenômenos regenerativos naturais mais bem estudados que tem apaixonado biólogos por séculos. A regeneração bem sucedida dos membros depende da formação, do crescimento e da padronização subsequente de uma estrutura celular indiferenciada conhecida como blastema. Pesquisadores têm feito avanços significativos na compreensão da composição celular do blastema, bem como quais tecidos de apoio e tipos celulares são necessários para sua formação2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . No entanto, os mecanismos coordenados de sinalização entre diferentes tecidos e tipos celulares que levam ao início da formação de blastema permanecem mal compreendidos.
Um requisito fundamental para a formação e regeneração bem sucedida de blastema é a epiderme da ferida, um epitélio transitório e especializado que cobre o plano de amputação dentro de 12 horas após a amputação10. Após a amputação, as células epiteliais da pele intacta proximal para a lesão migram rapidamente sobre o plano de amputação para formar um epitélio de ferida fina14. À medida que o blastema se forma nas semanas seguintes, a epiderme da ferida precoce desenvolve-se em uma estrutura de sinalização epitelial mais espessa chamada a tampa epitelial apical (AEC)15. Enquanto a pele de espessura total normal contém uma camada epitelial e dérmica separada por uma lamina basal, a epiderme/AEC da ferida consiste apenas de uma camada epitelial e carece de uma lamina basal16,17. A ausência da lamina basal e da derme permite o contato direto entre as células epiteliais feridas e os tecidos subjacentes, o que facilita a sinalização bidirecional entre os dois compartimentos que é fundamental tanto para a formação de blastema quanto para manutenção17,18.
Estudos experimentais clássicos elaboraram vários métodos cirúrgicos inovadores para sondar a função epiderme/AEC da ferida através da inibição de sua formação. Estes métodos incluíram sutura19 ou enxerto de espessura total da pele20,21 sobre o plano de amputação, suturando imediatamente o membro amputado na cavidade corporal22, e remoção diária contínua ou irradiação da epiderme da ferida precoce e AEC23,24. Ao todo, esses experimentos não só estabeleceram a importância da epiderme/AEC da ferida, mas também determinaram seus papéis na histolise do tecido precoce, bem como mantiveram a proliferação progenitora celular e o crescimento do blastemal13 durante toda a regeneração.
No entanto, esses estudos anteriores foram em grande parte limitados à coloração histológica, bem como pulsos tritiados de timmidina para rastrear a proliferação celular. De fato, revisitar esses experimentos clássicos com tecnologias modernas de sequenciamento e técnicas funcionais em salamandras só foi feito recentemente e levou à descoberta de papéis adicionais para a epiderme da ferida na modulação da inflamação e degradação/deposição do ECM durante os estágios iniciais da regeneração25. Com a liberação de várias sequências de genoma salamandra e transcriptome26,27,28,29,30,31,32,33,34, bem como o crescente número de métodos funcionais disponíveis em espécies de salamandra111,35,36,37,38 , os pesquisadores estão agora bem posicionados para começar a desvendar os mecanismos moleculares que conduzem a formação, função e desenvolvimento de epiderme de feridas.
Infelizmente, vários desses métodos clássicos utilizados para inibir a formação de epiderme de feridas são tecnicamente desafiadores, apresentando dificuldades para a reprodutibilidade entre réplicas biológicas no mesmo experimento. Por exemplo, a manutenção de enxertos de pele pode ser um desafio, pois os enxertos podem eventualmente cair do membro hospedeiro e a remoção da epiderme da ferida/AEC diariamente é difícil sem danificar os tecidos subjacentes. Além disso, a sutura do membro amputado na cavidade corporal é desafiadora e também requer lesões adicionais no local da inserção. Por outro lado, suturar a pele de espessura total imediatamente sobre o plano de amputação é relativamente simples, tecnicamente reproduzível, e introduz danos mínimos nos tecidos. Este método cirúrgico de retalho de pele completa (FSF) foi previamente desenvolvido por Anthony Mescher em 1976 em newts adultos (Notophthalmus viridiscens). Ele demonstrou que a cirurgia FSF inibiu a formação e função da epiderme da ferida, proibindo tanto a migração de células epiteliais sobre o plano de amputação quanto o contato direto entre as células epiteliais e os tecidos subjacentes.
Aqui, este procedimento cirúrgico é mostrado passo a passo usando o membro axolotl. Juntamente com as tecnologias moleculares e sequenciais modernas, essa técnica pode ser muito útil para os pesquisadores aprofundarem nossa compreensão da formação e função da epiderme da ferida/AEC durante a regeneração dos membros.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Curved spring scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td>Need two pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon monofilament sutures (9-0)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>SUT-1000-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamerazine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>127-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration

Experimentos clássicos em biologia regenerativa salamandra ao longo do último século estabeleceram há muito tempo que a epiderme da ferida é uma estrutura de sinalização crucial que se forma rapidamente após a amputação e é necessária para a regeneração dos membros. No entanto, os métodos para estudar sua função precisa no nível molecular nas últimas décadas foram limitados devido à escassez de técnicas funcionais precisas e informações genômicas disponíveis em sistemas de modelo salamandra. Empolgante, a recente infinidade de tecnologias de sequenciamento, juntamente com a liberação de vários genomas de salamandra e o advento de métodos de teste genéticos funcionais, incluindo o CRISPR, torna possível re-visitar esses experimentos fundamentais em resolução molecular sem precedentes. Aqui, descrevo como realizar a cirurgia de retalho de pele completa (FSF) desenvolvida clássicamente em axolotls adultos, a fim de inibir a formação de epiderme ferida imediatamente após a amputação. A epiderme da ferida normalmente se forma através da migração distal de células epiteliais na pele proximal para o plano de amputação para selar a ferida do ambiente externo. A cirurgia envolve a sutura imediata da pele de espessura total (que inclui camadas epidérmicas e dérmicas) sobre o plano de amputação para dificultar a migração de células epiteliais e o contato com os tecidos mesenquimais danificados subjacentes. Cirurgias bem sucedidas resultam na inibição da formação de blastema e regeneração de membros. Combinando este método cirúrgico com análises moleculares e funcionais contemporâneas a jusante, os pesquisadores podem começar a descobrir os fundamentos moleculares da função de epiderme da ferida e da biologia durante a regeneração dos membros.

Este protocolo cirúrgico permitirá a inibição completa da formação de epiderme da ferida (Figura 1) e, finalmente, regeneração de membros. Uma cirurgia bem sucedida resulta em nenhuma formação de blastema em aproximadamente 2-3 semanas, dependendo do tamanho do animal, enquanto os membros regeneradores de controle devem formar um blastema normalmente.
Os pesquisadores devem inspecionar o membro suturado a olho nu a cada 2-3 dias para garantir que as suturas não tenham surgido e que um blastema não esteja se formando. Se uma ou mais das suturas aparecerem, uma epiderme ferida ainda pode se formar resultando em uma pequena ou grande blastema e uma cirurgia mal sucedida (Figura 2). Além disso, os pesquisadores devem inspecionar o membro suturado pelo menos uma vez por semana sob um estereoscópio para garantir que uma epiderme de ferida fina não seja evidente em nenhum lugar da superfície de amputação. Para comparação, os pesquisadores também devem examinar o membro regenerador de controle que deve ter uma epiderme ferida sobre o plano de amputação e formar um blastema ao longo de 2-3 semanas. A epiderme ferida aparecerá fina e clara, enquanto a pele normal aparecerá mais opaca e rosa pálida (quase branca), amarelo claro ou verde escuro em axolotls leucísticos, albinos ou selvagens, respectivamente.
Se os pesquisadores desejam coletar tecido antes dos estágios de formação de blastema em 2-3 semanas, eles devem inspecionar os membros suturados antes da coleta de amostras para garantir que as suturas permanecessem no local e que uma pequena epiderme ferida não se formasse. Além disso, a seção sagitalmente através do tecido suturado do membro e a realização de análises histológicas a qualquer momento também pode verificar a presença da derme a partir da aba de pele completa circundando todo o plano de amputação e a ausência de uma epiderme ferida (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig01.jpg"> Figura 1: Esquema dos passos da cirurgia completa do retalho da pele. As etapas do protocolo estão numeradas e diagramadas aqui. As linhas pontilhadas denotam os planos de amputação nas etapas 1 e 3 do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig02.jpg"> Figura 2: Exemplos de cirurgias de retalhos de pele completa bem sucedidas e mal sucedidas. Imagem representativa de brightfield de um membro que foi submetido a uma cirurgia bem sucedida (esquerda), uma cirurgia mal sucedida (direita) e um membro regenerador de controle (sem cirurgia) aos 25 dias após a amputação (dpa). A cirurgia bem sucedida tem um plano de amputação plano onde o retalho de pele foi suturado, enquanto a cirurgia mal sucedida tem uma pequena blastema se desenvolvendo. Pontas de flecha denotam o plano de amputação e linhas pontilhadas brancas estão lá para ajudar na visualização da ausência de um blastema na cirurgia bem sucedida e presença de blastemas na cirurgia mal sucedida e controlar membros regeneradores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig03.jpg"> Figura 3: Coloração histológica de membros regenerados normais e FSF sutured. (A-B') Imagens representativas de brightfield de seções manchadas picro-mallory de regeneração (A-A') e membros axolotl sutured (B-B') em 7 dpa. Os insets em A e B são mostrados em A' e B', respectivamente. O colágeno-pesado linhas de camada dérmica e cobre todo o plano de amputação em membros suturados. O avião de amputação é denotado por pontas de flecha em A-B. As barras de escala representam 500 μm. Este número foi adaptado de Tsai et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Este artigo descreve como realizar um método cirúrgico para inibir a formação de epiderme de feridas durante a regeneração do membro axolotl, suturando imediatamente a pele de espessura total sobre o plano de amputação. Este método permite que os pesquisadores investiguem os papéis funcionais da epiderme da ferida durante os estágios iniciais da regeneração dos membros.

Inibição da Formação de Epiderme ferida através de cirurgia de retalho de pele completa durante a regeneração do membro axolotl

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

inhibition-wound-epidermis-formation-via-full-skin-flap-surgery

Research

JoVE Journal

Biology

3.0K visualizações.  Harvard University. Este artigo descreve como realizar um método cirúrgico para inibir a formação de epiderme de feridas durante a regeneração do membro axolotl, suturando imediatamente a pele de espessura total sobre o plano de amputação. Este método permite que os pesquisadores investiguem os papéis funcionais da epiderme da ferida durante os estágios iniciais da regeneração dos membros.

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Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Biologia

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Longo prazo, de alta resolução de imagem Lapse Confocal Tempo de<em&gt; Cotilédone Arabidopsis</em&gt; Epiderme durante a germinação

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Métodos para a pele ferimento e Ensaios para Responses ferida no<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the resolution of peripheral tissue responses. While a variety of methods are used to quantify leukocyte egress from non-lymphoid, peripheral tissues, the cellular and molecular mechanisms that govern context-dependent egress remain poorly understood. Here, we describe the use of in situ photoconversion for quantitative analysis of leukocyte egress from murine skin and tumors. Photoconversion allows for the direct labeling of leukocytes resident within cutaneous tissue. Though skin exposure to violet light induces local inflammatory responses characterized by leukocyte infiltrates and vascular leakiness, in a head-to-head comparison with transdermal application of fluorescent tracers, photoconversion specifically labeled migratory dendritic cell populations and simultaneously enabled the quantification of myeloid and lymphoid egress from cutaneous microenvironments and tumors. The mechanisms of leukocyte egress remain a missing component in our understanding of intratumoral leukocyte complexity, and thus the application of the tools described herein will provide unique insight into the dynamics of tumor immune microenvironments both at steady state and in response to therapy.

Here, we demonstrate the methods for in vivo quantification of leukocyte egress from na&#239;ve, inflamed, and malignant murine skin. We perform a head-to-head comparison of two models: transdermal FITC application and in situ photoconversion. Furthermore, we demonstrate the utility of photoconversion for tracking leukocyte egress from cutaneous tumors.

Quantificar a saída de leucócitos através de vasos linfáticos da pele murino e tumores

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.

Y-27632 Enriquece o rendimento de melanócitos humanos de tecidos de pele adultos

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

Um modelo murino de uma ferida de queimadura reconstruída com um enxerto de pele aogenética

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds of genes&#8212;many not associated with the oral apparatus (OA)&#8212;that are differentially regulated in phases throughout the regeneration process. It was hypothesized that this systemic reorganization and mobilization of cellular resources towards growth of a new OA will lead to observable changes in movement and behavior corresponding in time to the phases of differential gene expression. However, the morphological complexity of S. coeruleus necessitated the development of an assay to capture the statistics and timescale. A custom script was used to track cells in short videos, and statistics were compiled over a large population (N ~100). Upon loss of the OA, S. coeruleus initially loses the ability for directed motion; then starting at ~4 h, it exhibits a significant drop in speed until ~8 h. This assay provides a useful tool for the screening of motility phenotypes and can be adapted for the investigation of other organisms.

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

We present a protocol for the characterization of motility and behavior of a population of hundred micron- to millimeter-sized cells using brightfield microscopy and cell tracking. This assay reveals that Stentor coeruleus transitions through four behaviorally distinct phases when regenerating a lost oral apparatus.

Análise dos padrões de motilidade do Stentor durante e após a regeneração do aparelho oral usando rastreamento celular

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

Otimizando o NIRS para avaliar a função vascular dos membros inferiores

Near-Infrared Spectroscopy During Reactive Hyperemia for the Assessment of Lower Limb Vascular Function

Vascular diseases of the lower limb contribute substantially to the&#160;global burden of cardiovascular disease and comorbidities such as diabetes. Importantly, microvascular dysfunction can occur prior to, or alongside, macrovascular pathology, and both potentially contribute to patient symptoms and disease burden. Here, we describe a non-invasive approach using near-infrared spectroscopy (NIRS) during reactive hyperemia, which provides a standardized assessment of lower limb vascular (dys)function and a potential method to evaluate the efficacy of therapeutic interventions. Unlike alternative methods, such as contrast-enhanced ultrasound, this approach does not require venous access or sophisticated image analysis, and it is inexpensive and less operator-dependent. This description of the NIRS method includes representative results and standard terminology alongside the discussion of measurement considerations, limitations, and alternative methods. Future application of this work will improve standardization of vascular research design, data collection procedures, and harmonized reporting, thereby enhancing translational research outcomes in the areas of lower limb vascular (dys)function, disease, and treatment.

Autor em destaque: Melhorando a função vascular e a capacidade física em doenças cardiovasculares por meio de novas intervenções e tecnologia NIRS

Here, we describe a non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess reactive hyperemia in the lower limb. This protocol provides a standardized assessment of vascular and microvascular responsiveness that may be used to determine the presence of vascular dysfunction as well as the efficacy of therapeutic interventions.

Espectroscopia de infravermelho próximo durante hiperemia reativa para avaliação da função vascular de membros inferiores 

Vascular diseases of the lower limb contribute substantially to the&#160;global burden of cardiovascular disease and comorbidities such as diabetes. ...

Methods Article

Inibição da Formação de Epiderme ferida através de cirurgia de retalho de pele completa durante a regeneração do membro axolotl