Name: inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration
Uploaded: 2020-06-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration at JoVE.com

O autor agradece a Doug por seu constante encorajamento e apoio inabalável, bem como aos membros do laboratório Melton por seus comentários úteis e comentários sobre o manuscrito. O autor também gostaria de agradecer ao Escritório de Recursos Animais de Harvard (OAR) por seus cuidados dedicados aos animais.

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes da IACUC (Protocolo #: 11-32) e AAALAC na Universidade de Harvard.
1. Preparação de soluções e configuração para anestesia e recuperação
<ol><li>Prepare uma solução fresca de 0,1% de tricaine para anestesia e solução de sal de sódio sulfameraína de 0,5% para recuperação. Tornar as soluções usando água adequada para a criação axolotl37 de acordo com protocolos aprovados da IACUC na instituição de pesquisa relevante (modificação da solução de Holtfreter, por exemplo). Certifique-se de que as soluções estão bem misturadas e que o volume suficiente é preparado para submergir todo o axolotl.<ol>
<li>Para preparar 0,1% de solução tricaina, misture 1 g de tricaine e 1 g de bicarbonato de sódio com 1 L de água. A solução pode ser ampliada de acordo com esta receita.</li>
		<li>Para preparar 0,5% solução de sal de sódio sulfamerazina, misture 5 g de sal de sódio sulfamerazina com 1 L de água. A solução pode ser ampliada de acordo com esta receita. A solução de sulfamerazina é um anti-biótico que evitará infecção bacteriana durante a recuperação cirúrgica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Higienize a área cirúrgica pulverizando-a com Clidox-S ou 70% de etanol. Esterilizar ferramentas cirúrgicas (fórceps, tesoura dissecando, tesoura de mola) por autoclavagem. Se realizar múltiplas cirurgias, certifique-se de esterilizar as ferramentas cirúrgicas com um esterilizador de contas quentes entre os animais.</li>
	<li>Para configurar a área de recuperação, coloque uma placa de Petri de 15 cm ou qualquer recipiente que se encaixe no axolotl em cima de um balde cheio de gelo molhado. Encha a placa de Petri com um baixo nível de 0,5% de solução de sal de sódio sulfamerazina, o suficiente para que o axolotl não fique totalmente submerso. A recuperação do gelo pós-cirurgia irá retardar o movimento do animal enquanto ele acorda da anestesia, permitindo que a área suturada se cure relativamente intacta. NOTA: Esta configuração pode ser personalizada pelos pesquisadores, dependendo dos materiais disponíveis.</li>
</ol>2. Realizando o procedimento cirúrgico de retalho de pele completo
<ol><li>Anestesiar o axolotl submerse-o em um recipiente de 0,1% de solução tricaina. Isso levará aproximadamente 15-20 minutos. Certifique-se de que o axolotl está de fato totalmente anestesiado, realizando uma pitada de cauda. Se não houver resposta do axlotl, prossiga com a cirurgia. NOTA: Use axlotls mais antigos e maiores para esta cirurgia (pelo menos 15 cm de tamanho). Certifique-se de que o axlotl permanece bem hidratado durante toda a cirurgia, molhando a pele periodicamente com água do sistema axolotl usando uma pipeta plástica. Certifique-se de preparar aseticamente o local cirúrgico irrigando a área com PBS estéril antes da cirurgia. O animal também deve ser colocado em uma cortina cirúrgica estéril para o procedimento.</li>
	<li>Realize uma amputação de membro na extremidade distal dos elementos esqueléticos zeugopodial utilizando a tesoura dissecando (Figura 1.1).</li>
	<li>Utilizando a tesoura de mola, faça uma pequena incisão (aproximadamente 2 mm) na porção ventral da pele (Figura 1.2).</li>
	<li>Usando os fórceps, retire cuidadosamente a pele para aproximadamente a linha média dos elementos esqueléticos zeugopodial, expondo os tecidos subjacentes dos membros (músculo, osso, etc.) (Figura 1.3). Certifique-se de não danificar a pele. Veja nota após o passo 2.8.</li>
	<li>Ampute os tecidos de membros subjacentes expostos na linha média do zeugopode usando tesoura cirúrgica (Figura 1.4).</li>
	<li>Empurre o tecido muscular com a tesoura cirúrgica e corte o osso exposto. NOTA: Isso é necessário para garantir uma melhor cicatrização e também para aumentar o sucesso da cirurgia, pois o osso saliente pode ser irregular contra a aba suturada e interromper a integridade de uma aba de pele intacta mais tarde.</li>
	<li>Utilizando os fórceps, puxe cuidadosamente a pele extra de espessura total sobre o plano de amputação para cobrir os tecidos subjacentes expostos e a sutura no lugar, conectando-se com a pele de espessura total ventral (Figura 1.5).</li>
	<li>Suturar os lados esquerdo e esquerdo restantes da aba da pele nas porções ventrais subjacentes da pele intacta. Isso pode ser feito suturando os lados da aba de forma "cruz cruzada" (recomendada) (Figura 1.6-1.9), ou simplesmente suturando diretamente na pele ventral. Use as fórceps e a tesoura de mola curvada para sutura. Certifique-se de que nenhum tecido subjacente exposto possa ser visto e que as suturas estejam amarradas (amarradas pelo menos três vezes). NOTA: É fundamental que a pele intacta não esteja danificada nas etapas 2.4, 2.7-2.8. Descobrimos que os danos na pele de espessura total foram correlacionados com cirurgias mal sucedidas, pois as áreas de dano ainda podem formar uma pequena epiderme ferida. Se possível, tente usar um par de fórceps mais maçante ao entregar a aba de pele de espessura total.</li>
	<li>Realize uma amputação no membro contralateral (controle animal interno opcional) amputando-o no nível médio do zeugopod com uma tesoura cirúrgica. Empurre o tecido muscular com uma tesoura cirúrgica e corte o osso exposto. NOTA: Um controle interno do membro contralateral pode ser feito para avaliar melhor o sucesso da cirurgia durante a etapa 4 no mesmo animal. No entanto, a amputação do mesmo membro em um animal separado também pode ser usada para servir como controle.</li>
</ol>3. Recuperação e cuidado pós-operatórios
<ol><li>Uma vez que a cirurgia esteja completa, coloque um Kimwipe ou uma toalha de papel estéril na parte inferior do recipiente ou placa de Petri para molhá-la. Coloque o animal no recipiente em gelo molhado e enrole delicadamente as extremidades expostas do Kimwipe ou toalha de papel ao redor do topo do animal para mantê-lo bem hidratado com solução de sulfamerazina. Deixe no gelo molhado por 30 minutos a 1 hora para garantir o movimento mínimo durante a recuperação da anestesia.</li>
	<li>Coloque o animal em um recipiente estático com solução de sulfamerazina de 0,5%. Os axolotes devem permanecer nesta solução durante as primeiras 24 horas, a fim de prevenir a infecção.</li>
	<li>Coloque o axlotl em água normal do sistema e monitore a saúde diariamente. Certifique-se de que nenhuma sutura caia todos os dias, pois isso pode resultar em uma pequena epiderme ferida formando que confundirá os resultados. NOTA: Certifique-se de que o recipiente de habitação tenha amplo espaço para o axololo se mover e minimizar as chances de que o membro suturado no axolotl possa entrar em contato com as laterais do recipiente. Isso ajudará a garantir que as suturas permaneçam no lugar, especialmente durante a primeira semana pós-cirurgia.</li>
</ol>4. Avaliar o sucesso da cirurgia sob um microscópio estéreo
NOTA: Recomendamos verificar animais sob um microscópio estereo pelo menos uma vez por semana para avaliar a integridade da retalho da pele completa e o sucesso da cirurgia.
<ol><li>Anestesiar o axlotl em 0,1% de tricaine como no Passo 2.1. Certifique-se de que há amplo espaço no recipiente para que o axolotl se mova.</li>
	<li>Se inspecionar durante as duas primeiras semanas pós-cirurgia, inspecione o membro suturado usando um estereoscópio para garantir que nenhuma sutura tenha surgido e que uma epiderme de ferida fina clara não seja visível em lugar nenhum. Se inspecionar na terceira semana pós-cirurgia ou posterior, certifique-se de que um blastema não tenha se formado e compare com a forma como o membro amputado de controle normal (seja do mesmo animal ou de um animal diferente) progrediu durante a regeneração (ou seja, se um blastema se formou).</li>
	<li>Quando feito, devolva o axolotl às condições normais de água do sistema e da pecuária.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Spallanzani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prodromo Di Un'opera Da Imprimersi Sopra Le Riproduzioni Animali. , (1768).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. , (2018).</li><li>Leigh, N. 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Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo descreve um protocolo para a realização de cirurgias de retalhos de pele completas em membros axolotl para inibir a formação de epiderme de feridas. Embora esta cirurgia seja relativamente simples e tecnicamente reprodutível em comparação com outros métodos de inibição da formação de epiderme de feridas, existem várias etapas críticas que podem impactar o sucesso da cirurgia. Primeiro, ao puxar a aba de pele intacta sobre os tecidos subjacentes expostos, é primordial que a pele de espessura total não seja danificada de forma alguma. Danos na aba da pele ainda podem levar à formação de uma pequena epiderme de ferida, o que pode resultar em um pequeno crescimento semelhante a uma explosão. Em segundo lugar, garantir que as suturas não caiam durante o atendimento pós-operatório, pois isso também pode levar à formação de uma pequena epiderme ferida. Até este ponto, minimizar o contato potencial entre o membro suturado e quaisquer superfícies é importante, especialmente durante a primeira semana pós-cirurgia. Várias maneiras de prevenir isso implicam habitação e anestesiar o axolotl em um recipiente grande o suficiente para que o axolotl tenha muito espaço para se mover após a cirurgia.
Esta cirurgia também tem várias limitações. Talvez o mais notável seja que o sucesso das cirurgias só pode ser avaliado de duas maneiras: usar o escopo de dissecação durante as duas primeiras semanas de cirurgia para procurar a ausência de uma epiderme ferida e/ou verificar se uma blastema se forma dentro de 3 semanas. Embora esses métodos sejam eficazes, eles são relativamente baixos rendimentos. O desenvolvimento de futuros axolotis de repórter transgênicos para marcadores específicos de epiderme de feridas pode ajudar na triagem mais rápida para cirurgias bem sucedidas versus mal sucedidas. Além disso, esta cirurgia é mais difícil de realizar em animais mais jovens, pois a pele intacta é mais frágil. Recomenda-se, portanto, o uso de axlotls sub-adultos ou adultos.
Embora esta cirurgia tenha sido originalmente desenvolvida em N. viridiscens19, ela foi facilmente adaptada para axolotls25,39 e provavelmente pode ser aplicada a outras espécies de salamandra também. Em suma, a aplicação dessa técnica em futuros estudos regenerativos de membros capacitará os pesquisadores a desenvolver mais ferramentas para abordar a biologia da epiderme ferida e identificar os mecanismos subjacentes que conduzem sua função no início da formação de blastema.

Desde que Lazzaro Spallanzani o relatou em 17681, a regeneração de membros da salamandra tem sido um dos fenômenos regenerativos naturais mais bem estudados que tem apaixonado biólogos por séculos. A regeneração bem sucedida dos membros depende da formação, do crescimento e da padronização subsequente de uma estrutura celular indiferenciada conhecida como blastema. Pesquisadores têm feito avanços significativos na compreensão da composição celular do blastema, bem como quais tecidos de apoio e tipos celulares são necessários para sua formação2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . No entanto, os mecanismos coordenados de sinalização entre diferentes tecidos e tipos celulares que levam ao início da formação de blastema permanecem mal compreendidos.
Um requisito fundamental para a formação e regeneração bem sucedida de blastema é a epiderme da ferida, um epitélio transitório e especializado que cobre o plano de amputação dentro de 12 horas após a amputação10. Após a amputação, as células epiteliais da pele intacta proximal para a lesão migram rapidamente sobre o plano de amputação para formar um epitélio de ferida fina14. À medida que o blastema se forma nas semanas seguintes, a epiderme da ferida precoce desenvolve-se em uma estrutura de sinalização epitelial mais espessa chamada a tampa epitelial apical (AEC)15. Enquanto a pele de espessura total normal contém uma camada epitelial e dérmica separada por uma lamina basal, a epiderme/AEC da ferida consiste apenas de uma camada epitelial e carece de uma lamina basal16,17. A ausência da lamina basal e da derme permite o contato direto entre as células epiteliais feridas e os tecidos subjacentes, o que facilita a sinalização bidirecional entre os dois compartimentos que é fundamental tanto para a formação de blastema quanto para manutenção17,18.
Estudos experimentais clássicos elaboraram vários métodos cirúrgicos inovadores para sondar a função epiderme/AEC da ferida através da inibição de sua formação. Estes métodos incluíram sutura19 ou enxerto de espessura total da pele20,21 sobre o plano de amputação, suturando imediatamente o membro amputado na cavidade corporal22, e remoção diária contínua ou irradiação da epiderme da ferida precoce e AEC23,24. Ao todo, esses experimentos não só estabeleceram a importância da epiderme/AEC da ferida, mas também determinaram seus papéis na histolise do tecido precoce, bem como mantiveram a proliferação progenitora celular e o crescimento do blastemal13 durante toda a regeneração.
No entanto, esses estudos anteriores foram em grande parte limitados à coloração histológica, bem como pulsos tritiados de timmidina para rastrear a proliferação celular. De fato, revisitar esses experimentos clássicos com tecnologias modernas de sequenciamento e técnicas funcionais em salamandras só foi feito recentemente e levou à descoberta de papéis adicionais para a epiderme da ferida na modulação da inflamação e degradação/deposição do ECM durante os estágios iniciais da regeneração25. Com a liberação de várias sequências de genoma salamandra e transcriptome26,27,28,29,30,31,32,33,34, bem como o crescente número de métodos funcionais disponíveis em espécies de salamandra111,35,36,37,38 , os pesquisadores estão agora bem posicionados para começar a desvendar os mecanismos moleculares que conduzem a formação, função e desenvolvimento de epiderme de feridas.
Infelizmente, vários desses métodos clássicos utilizados para inibir a formação de epiderme de feridas são tecnicamente desafiadores, apresentando dificuldades para a reprodutibilidade entre réplicas biológicas no mesmo experimento. Por exemplo, a manutenção de enxertos de pele pode ser um desafio, pois os enxertos podem eventualmente cair do membro hospedeiro e a remoção da epiderme da ferida/AEC diariamente é difícil sem danificar os tecidos subjacentes. Além disso, a sutura do membro amputado na cavidade corporal é desafiadora e também requer lesões adicionais no local da inserção. Por outro lado, suturar a pele de espessura total imediatamente sobre o plano de amputação é relativamente simples, tecnicamente reproduzível, e introduz danos mínimos nos tecidos. Este método cirúrgico de retalho de pele completa (FSF) foi previamente desenvolvido por Anthony Mescher em 1976 em newts adultos (Notophthalmus viridiscens). Ele demonstrou que a cirurgia FSF inibiu a formação e função da epiderme da ferida, proibindo tanto a migração de células epiteliais sobre o plano de amputação quanto o contato direto entre as células epiteliais e os tecidos subjacentes.
Aqui, este procedimento cirúrgico é mostrado passo a passo usando o membro axolotl. Juntamente com as tecnologias moleculares e sequenciais modernas, essa técnica pode ser muito útil para os pesquisadores aprofundarem nossa compreensão da formação e função da epiderme da ferida/AEC durante a regeneração dos membros.

<table><tbody><tr><td>Curved spring scissors</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-40</td><td>Need two pairs</td></tr><tr><td>Nylon monofilament sutures (9-0)</td><td>Roboz</td><td>SUT-1000-21</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Sulfamerazine sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr></tbody></table>

inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration

Experimentos clássicos em biologia regenerativa salamandra ao longo do último século estabeleceram há muito tempo que a epiderme da ferida é uma estrutura de sinalização crucial que se forma rapidamente após a amputação e é necessária para a regeneração dos membros. No entanto, os métodos para estudar sua função precisa no nível molecular nas últimas décadas foram limitados devido à escassez de técnicas funcionais precisas e informações genômicas disponíveis em sistemas de modelo salamandra. Empolgante, a recente infinidade de tecnologias de sequenciamento, juntamente com a liberação de vários genomas de salamandra e o advento de métodos de teste genéticos funcionais, incluindo o CRISPR, torna possível re-visitar esses experimentos fundamentais em resolução molecular sem precedentes. Aqui, descrevo como realizar a cirurgia de retalho de pele completa (FSF) desenvolvida clássicamente em axolotls adultos, a fim de inibir a formação de epiderme ferida imediatamente após a amputação. A epiderme da ferida normalmente se forma através da migração distal de células epiteliais na pele proximal para o plano de amputação para selar a ferida do ambiente externo. A cirurgia envolve a sutura imediata da pele de espessura total (que inclui camadas epidérmicas e dérmicas) sobre o plano de amputação para dificultar a migração de células epiteliais e o contato com os tecidos mesenquimais danificados subjacentes. Cirurgias bem sucedidas resultam na inibição da formação de blastema e regeneração de membros. Combinando este método cirúrgico com análises moleculares e funcionais contemporâneas a jusante, os pesquisadores podem começar a descobrir os fundamentos moleculares da função de epiderme da ferida e da biologia durante a regeneração dos membros.

Este protocolo cirúrgico permitirá a inibição completa da formação de epiderme da ferida (Figura 1) e, finalmente, regeneração de membros. Uma cirurgia bem sucedida resulta em nenhuma formação de blastema em aproximadamente 2-3 semanas, dependendo do tamanho do animal, enquanto os membros regeneradores de controle devem formar um blastema normalmente.
Os pesquisadores devem inspecionar o membro suturado a olho nu a cada 2-3 dias para garantir que as suturas não tenham surgido e que um blastema não esteja se formando. Se uma ou mais das suturas aparecerem, uma epiderme ferida ainda pode se formar resultando em uma pequena ou grande blastema e uma cirurgia mal sucedida (Figura 2). Além disso, os pesquisadores devem inspecionar o membro suturado pelo menos uma vez por semana sob um estereoscópio para garantir que uma epiderme de ferida fina não seja evidente em nenhum lugar da superfície de amputação. Para comparação, os pesquisadores também devem examinar o membro regenerador de controle que deve ter uma epiderme ferida sobre o plano de amputação e formar um blastema ao longo de 2-3 semanas. A epiderme ferida aparecerá fina e clara, enquanto a pele normal aparecerá mais opaca e rosa pálida (quase branca), amarelo claro ou verde escuro em axolotls leucísticos, albinos ou selvagens, respectivamente.
Se os pesquisadores desejam coletar tecido antes dos estágios de formação de blastema em 2-3 semanas, eles devem inspecionar os membros suturados antes da coleta de amostras para garantir que as suturas permanecessem no local e que uma pequena epiderme ferida não se formasse. Além disso, a seção sagitalmente através do tecido suturado do membro e a realização de análises histológicas a qualquer momento também pode verificar a presença da derme a partir da aba de pele completa circundando todo o plano de amputação e a ausência de uma epiderme ferida (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig01.jpg"> Figura 1: Esquema dos passos da cirurgia completa do retalho da pele. As etapas do protocolo estão numeradas e diagramadas aqui. As linhas pontilhadas denotam os planos de amputação nas etapas 1 e 3 do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig02.jpg"> Figura 2: Exemplos de cirurgias de retalhos de pele completa bem sucedidas e mal sucedidas. Imagem representativa de brightfield de um membro que foi submetido a uma cirurgia bem sucedida (esquerda), uma cirurgia mal sucedida (direita) e um membro regenerador de controle (sem cirurgia) aos 25 dias após a amputação (dpa). A cirurgia bem sucedida tem um plano de amputação plano onde o retalho de pele foi suturado, enquanto a cirurgia mal sucedida tem uma pequena blastema se desenvolvendo. Pontas de flecha denotam o plano de amputação e linhas pontilhadas brancas estão lá para ajudar na visualização da ausência de um blastema na cirurgia bem sucedida e presença de blastemas na cirurgia mal sucedida e controlar membros regeneradores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig03.jpg"> Figura 3: Coloração histológica de membros regenerados normais e FSF sutured. (A-B') Imagens representativas de brightfield de seções manchadas picro-mallory de regeneração (A-A') e membros axolotl sutured (B-B') em 7 dpa. Os insets em A e B são mostrados em A' e B', respectivamente. O colágeno-pesado linhas de camada dérmica e cobre todo o plano de amputação em membros suturados. O avião de amputação é denotado por pontas de flecha em A-B. As barras de escala representam 500 μm. Este número foi adaptado de Tsai et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Este artigo descreve como realizar um método cirúrgico para inibir a formação de epiderme de feridas durante a regeneração do membro axolotl, suturando imediatamente a pele de espessura total sobre o plano de amputação. Este método permite que os pesquisadores investiguem os papéis funcionais da epiderme da ferida durante os estágios iniciais da regeneração dos membros.

Inibição da Formação de Epiderme ferida através de cirurgia de retalho de pele completa durante a regeneração do membro axolotl

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

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Research

JoVE Journal

Biology

3.0K visualizações.  Harvard University. Este artigo descreve como realizar um método cirúrgico para inibir a formação de epiderme de feridas durante a regeneração do membro axolotl, suturando imediatamente a pele de espessura total sobre o plano de amputação. Este método permite que os pesquisadores investiguem os papéis funcionais da epiderme da ferida durante os estágios iniciais da regeneração dos membros.

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Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Biologia do Desenvolvimento

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) throughout life, which proliferate to reform the ependymal tube and differentiate into lost neurons after spinal cord injury. Deciphering how these NSCs retain pluripotency post-development and proliferate upon spinal cord injury to reform the exact pre-injury structure can provide valuable insight into how mammalian spinal cords may regenerate as well as potential treatment options. Performing gene knock-outs in specific subsets of NSCs within a restricted time period will allow study of the molecular mechanisms behind these regenerative processes, without being confounded by development perturbing effects. Described here is a method to perform gene knock-out in axolotl spinal cord NSCs using the CRISPR-Cas9 system. By injecting the CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation, target genes are knocked out in NSCs within specific regions of the spinal cord at a desired timepoint, allowing for molecular studies of spinal cord NSCs during regeneration.

Presented here is a protocol to perform time- and space-restricted gene knock-out in axolotl spinal cords by injecting CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation.

Gene direto knock-out de células-tronco neurais da medula espinhal Axolotl via eletroporação de complexos de proteína-gRNA CAS9

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Genética

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as axolotls, to regenerate entire limbs as adults. Here, we outline techniques used to generate chimeric axolotls with Cas9-mutagenized haploid forelimbs that can be used for exploring gene function and the fidelity of limb regeneration. We combine several embryological and genetic techniques, including haploid generation via in vitro activation, CRISPR/Cas9 mutagenesis, and tissue grafting into one protocol to produce a unique system for haploid genetic screening in a model organism of regeneration. This strategy reduces the number of animals, space, and time required for the functional analysis of genes in limb regeneration. This also permits the investigation of regeneration-specific functions of genes that may be required for other essential processes, such as organogenesis, tissue morphogenesis, and other essential embryonic processes. The method described here is a unique platform for conducting haploid genetic screening in a vertebrate model system.

This goal of this protocol is to produce chimeric axolotls with haploid forelimbs derived from Cas9-mutagenized donor tissue using embryonic tissue grafting techniques.

Geração de Axolotis Quiméricos com Membros Haploides Mutantes através de enxerto embrionário

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, proliferation and remodeling. Murine wounds have a histologically well-defined and easily recognizable wound bed over which these different phases of the healing process are measurable. Within the field, it is common to use an arbitrarily defined &#8220;middle&#8221; of the wound for histological analyses. However, wounds are a three-dimensional entity and often not histologically symmetrical, supporting the need for a well-defined and robust method of quantification to detect morphometric defects with a small effect size. In this protocol, we describe the procedure for creating bilateral, full-thickness excisional wounds in mice as well as a detailed instruction on how to measure morphometric parameters using an image processing program on select serial sections. The two-dimension measurements of wound length, epidermal length, epidermal area, and wound area are used in combination with the known distance between sections to extrapolate the three-dimension epidermal area covering the wound, overall wound area, epidermal volume and wound volume. Although this detailed histological analysis is more time and resource consuming than conventional analyses, its rigor increases the likelihood of detecting novel phenotypes in an inherently complex wound healing process.

This protocol describes how to generate bilateral, full-thickness excisional wounds in mice and how to subsequently monitor, harvest, and prepare the wounds for morphometric analysis. Included is an in-depth description of how to use serial histological sections to define, precisely quantify and detect morphometric defects.

Modelo de cura da ferida excisional de Murine e Análise de Ferida Morfômica Histológica

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, ...

Apical Resection Mouse Model to Study Early Mammalian Heart Regeneration

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring cardiomyocytes lost due to injury and disease. In contrast to the robust cardiac regeneration of certain lower vertebrates, adult mammalian hearts typically show minimal capacity for heart regeneration and repair. However, recent studies have sparked considerable scientific interest with the finding that, between postnatal day 1 to 7 (P1 to P7), the neonatal mouse heart retains significant regenerative potential after apical resection (i.e., surgical amputation and exposure of left ventricular apex). One major controversy over this finding might be due to the diverse surgery-related procedures used in efforts to replicate or expand upon this important finding. These instructions dynamically present the materials and methodology for apical resection in a mouse model. The salient steps of this rodent survival surgery involve hypothermia anesthesia, thoracotomy, surgical amputation of heart ventricular apex, and suture and recovery of mice. The approach described could expand the application of the apical resection mouse model for cardiovascular research.

A step-by-step video protocol of apical resection is demonstrated in this study. Apical resection is a recently highlighted surgical approach in mammalian heart regeneration research. This study may promote the application of apical resection as a standard methodology in research into the mechanism underlying heart regeneration.

A ressecção apical mouse modelo para estudar precoce Regeneração Mammalian Coração

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring ...

Medicina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

Na eletroporação in vivo de Morpholinos no Adulto Regeneração Zebrafish Cauda Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Biologia

Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma mexicanum). Most clinical spinal cord injuries occur as high energy blunt traumas, inducing contusion injuries. However, most studies in the axolotl spinal cord have been conducted with sharp traumas. Hence, this study aims to produce a more clinically relevant regenerative model. Due to their impressive ability to regenerate almost any tissue, axolotls are widely used as models in regenerative studies and have been used extensively in spinal cord injury (SCI) studies. In this protocol, the axolotls are anesthetized by submersion in a benzocaine solution. Under the microscope, an angular incision is made bilaterally at a level just caudal to the hind limbs. From this incision, it is possible to dissect and expose the spinous processes. Using forceps and scissors, a two-level laminectomy is performed, exposing the spinal cord. A custom trauma device consisting of a falling rod in a cylinder is constructed, and this device is used to induce a contusion injury to the spinal cord. The incisions are then sutured, and the animal recovers from anesthesia. The surgical approach is successful in exposing the spinal cord. The trauma mechanism can produce contusion injuries to the spinal cord, as confirmed by histology, MRI, and neurological examination. Finally, the spinal cord regenerates from the injury. The critical step of the protocol is removing the spinous processes without inflicting damage to the spinal cord. This step requires training to ensure a safe procedure. Furthermore, wound closure is highly dependent on not inflicting unnecessary damage to the skin during incision. The protocol was performed in a randomized study of 12 animals.

This manuscript presents protocols for surgically inflicting controlled blunt and sharp spinal cord injuries to a regenerative axolotl (Ambystoma mexicanum).

Ferimento da medula espinal da contusão através de um Laminectomy Microsurgical no Axolotl regenerative

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma ...

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. Previous research has demonstrated the regenerative ability of the heart of the adult Xenopus tropicalis, an anuran amphibian with a diploid genome and a close evolutionary relationship with mammals. Additionally, studies have shown that following ventricular apex resection, the heart can regenerate without scarring in X. tropicalis. Consequently, these previous results suggest that X. tropicalis is an appropriate alternative vertebrate model for the study of adult heart regeneration. A surgical model of cardiac regeneration in the adult X. tropicalis is presented herein. Briefly, the frogs were anesthetized and fixed; then, a small incision was made with iridectomy scissors, penetrating the skin and pericardium. Gentle pressure was applied to the ventricle, and the apex of the ventricle was then cut out with scissors. Cardiac injury and regeneration were confirmed by histology at 7-30 days post resection (dpr). This protocol established an apical resection model in adult X. tropicalis, which&#160;can be employed to elucidate the mechanisms of adult heart regeneration.

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

Xenopus tropicalis is an ideal model for regenerative research as many of its organs possess a remarkable regenerative capacity. Here, we present a method for constructing a heart injury model in X. tropicalis via apex resection.

Modelo de Ressecção Apical no Coração de Xenopus tropicalis Adulto

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

Um modelo murino de uma ferida de queimadura reconstruída com um enxerto de pele aogenética

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Usando a fixação em placas para estudar a cicatrização óssea e a regeneração de membros em axolotes

Stabilizing a Femur Osteotomy with a Plate Fixation in Ambystoma mexicanum

The axolotl (Ambystoma mexicanum) is a promising model organism for regenerative medicine due to its remarkable ability to regenerate lost or damaged organs, including limbs, brain, heart, tail, and others. Studies on axolotl shed light on cellular and molecular pathways ruling progenitor activation and tissue restoration after injury. This knowledge can be applied to facilitate the healing of regeneration-incompetent injuries, such as bone non-union. In the current protocol, the femur osteotomy stabilization using an internal plate fixation system is described. The procedure was adapted for use in aquatic animals (axolotl, Ambystoma mexicanum). &#8805;20 cm snout-to-tail tip axolotls with fully ossified, mouse-size comparable femurs were used, and special attention was paid to the plate positioning and fixation, as well as to the postoperative care. This surgical technique allows for standardized and stabilized bone fixation and could be useful for direct comparison to axolotl limb regeneration and analogous studies of bone healing across amphibians and mammals.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Explorando a regeneração em axolotes por meio de insights sobre mecanismos celulares e moleculares, cicatrização óssea e implicações para terapi

A protocol for femoral osteotomy surgery with the use of internal plate fixation in mature axolotls is presented. The procedure can be used to perform comparative studies on limb regeneration and fracture healing in aquatic amphibians.

Estabilização de uma osteotomia de fêmur com fixação de placa em Ambystoma mexicanum

The axolotl (Ambystoma mexicanum) is a promising model organism for regenerative medicine due to its remarkable ability to regenerate lost or damaged ...