Este trabalho foi apoiado pela subvenção de INSTITUTO NACIONAL DE ARTRITE E MÚSICA MUSCULOSALELÉTICA E PELE (R01AR069653 a Zhang LJ) e Institutos Nacionais de Apoio à Saúde (5T32AR062496-03 a CA).

Todos os experimentos com animais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCSD. 1. Isolamento primário e cultura de KC do mouse por pele neonatal <ol><li> Sacrifique o nascimento pós-natal de 0 a 2 neonatos da cepa do mouse tipo selvagem C57B / 6 por decapitação usando tesoura. Corte os membros logo acima das articulações do pulso e do tornozelo, depois corte a cauda completamente, deixando um pequeno orifício. </li><li> Para descascar a pele inteira, primeiro inserir tesoura afiada através do buraco na cauda e cortar a pele ao longo da linha dorsal do meio do corpo até a abertura no pescoço. Em seguida, use uma pinça para agarrar o corpo exposto e as outras fórceps para agarrar a pele e remova suavemente a pele inteira do corpo e sobre os tocos da perna com um movimento contínuo. <ol><li> Retire a pele como uma peça intacta e tenha cuidado para não quebrar a pele em pedaços, pois isso irá resultar em perda de células durante a etapa de dispase. </li></ol></li> &lt;Li&gt; Enxágue a pele descascada com 15 mL de PBS estéril em uma placa de Petri de 10 cm e, em seguida, coloque a pele de cada cachorrinho em um tubo de 2 mL preenchido com tampão de digestão com dispersão gelada, que contém 4 mg / mL de dispersão em meio de crescimento de KC (KC meio basal tem 0,06 mM de CaCl2, DG, e antibióticos / antimicóticos). NOTA: vários isolados de pele podem ser combinados e incubados em um tubo de 15 mL (até 5 peles por tubo) contendo 12 mL de solução de dispase. Incubar o tubo de pele durante a noite em um refrigerador de 4 ° C em um rotador. <ol><li> Certifique-se de que a pele não está dobrada no tubo, pois isso irá resultar em exposição insuficiente da região dobrada à solução dispase. </li></ol></li><li> No dia seguinte (após 12-18 h em dispase), transfira a pele juntamente com a solução de dispersão para uma placa de Petri. Transfira cada peça de tecido para uma nova placa de Petri com 15 ml de PBS estéril para lavar o excesso de dispase. </li><li> Usando dois pares de pinças, segure a pele do PBS,Levante a pele e transfira para uma nova placa de Petri com o lado epidérmico para baixo e a derme para cima. Estique cuidadosamente as dobras da pele de modo a que ela seja totalmente estendida na placa de Petri. </li><li> Coloque 500 μL de uma solução de digestão à base de tripsina para cada pele em uma nova placa de Petri. Usando fórceps, levante lentamente a derme para cima e afastar-se da epiderme, enquanto mantém pressionada a epiderme. Descarte a derme como material biológico perigoso. Transfira a epiderme separada e flutue em cada gota de solução de tripsina com a camada basal para baixo. <ol><li> Se a epiderme é dobrada na solução de tripsina, remova as dobras usando fórceps para garantir uma digestão eficiente de KCs basais do epitélio. </li></ol></li><li> Incube a pele em uma placa de Petri em solução de tripsina à temperatura ambiente (com a tampa coberta) em um agitador horizontal com agitação suave durante 20 min. </li><li> Adicione 2 mL de meio de crescimento de KC suplementado por epiderme (cerca de 1 polegada quadrada de tamanho porEpiderme) para a placa de Petri. Segure a epiderme usando fórceps e esfregue vigorosamente a epiderme para trás e para trás para liberar células únicas da folha epidérmica. <ol><li> Observe que o meio se torna cada vez mais turvo à medida que as células são separadas da epiderme. Incline a placa Petri para recolher e transferir a suspensão celular para um novo tubo, deixando a folha epidérmica restante no prato. </li></ol></li><li> Repita mais duas vezes o esfregamento da folha epidérmica após a adição de 2 mL de meio de crescimento KC e combine as suspensões celulares no mesmo tubo. </li><li> Pipetar a solução celular de forma ascendente e descendente suavemente algumas vezes para quebrar qualquer aglomerado celular usando a pipeta serológica apropriada e passá-lo através de um filtro de 100 μm para um novo tubo de centrífuga de 50 mL. </li><li> Centrifugar as células filtradas durante 5 min a 180 x g. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender gentilmente o sedimento celular em 1 mL de meio de crescimento KC frio / epiderme. </li><li> Conte as células por um hemocitômetro. <br/&gt; NOTA: Os KCs podem se diferenciar espontaneamente em suspensão, de modo que as células devem ser banhadas o mais rápido possível após o isolamento para garantir o melhor desempenho das células. Recomendamos colocar as células no gelo enquanto conta, pois isso reduzirá a taxa de diferenciação espontânea de KC. </li><li> Semear as células a uma densidade de 5 x 10 4 / cm 2 em meio de crescimento KC em placas de cultura pré-revestida com um produto de matriz extracelular (ECM) que promove a fixação das células. NOTA: Usamos um comercial disponível (por exemplo, fator de fixação, que é um material de revestimento à base de gelatina (veja a Tabela de Materiais para detalhes). As células foram cultivadas em incubadora humidificada com 5% de CO 2 a 37 ° C e meio fresco Reabastecido todos os dias. <ol><li> Para o revestimento, revestir os pratos de cultura com o material de revestimento de fixação celular aquecido até a temperatura ambiente durante 10 min a 2 h antes da semeadura celular. Remova o fator de anexo imediatamente antesAdicionando a suspensão celular. </li></ol></li><li> Mude o meio 24 h após o revestimento inicial para remover as células não ligadas e mude o meio diariamente até as células chegarem à confluência desejada antes da experiência. </li></ol> 2. Isolamento primário KC do mouse da pele de cauda adulta <ol><li> Sacrifique um mouse adulto C57BL / 6 (de preferência entre 6-15 semanas de idade, masculino ou feminino) de acordo com os regulamentos da instalação animal. Corte a cauda do corpo da base da cauda e corte ~ 2 mm da ponta da cauda para que haja um orifício visível na ponta. </li><li> Para descascar a pele da cauda, ​​primeiro use uma lâmina afiada para cortar a pele da cauda da base até a ponta da cauda. Em seguida, use uma pinça para agarrar o osso da cauda exposto e as outras fórceps para agarrar a pele e remova suavemente a pele da cauda do osso com um movimento contínuo. Corte a pele descascada da linha média para que cada peça tenha menos de 2-3 cm de comprimento. </li><li> Enxágüe a pele de pele sagacidadeH 15 mL de PBS estéril em uma placa de Petri de 10 cm, em seguida coloque a pele de cada cauda em um tubo de 2 mL preenchido com tampão de digestão com dispersão gelada (4 mg / mL de dispersão em meio de crescimento de KC). NOTA: várias peças de pele também podem ser combinadas e incubadas em um tubo de 15 mL (até 5 caudas por tubo) contendo 12 mL de solução de dispersão. <ol><li> Incubar o tubo de pele durante a noite em um refrigerador de 4 ° C em um rotador. </li></ol></li><li> Execute os passos 1.4 a 1.13 para isolar a suspensão de célula única da epiderme da cauda. </li><li> Semente as células adultas com uma densidade de 10 x 10 4 / cm 2 (contada por um hematocitômetro) em meio de crescimento KC em pratos de cultura pré-revestidos com colágeno. NOTA: Utilizamos um kit de revestimento baseado em colágeno comercialmente disponível (veja a Tabela de Materiais para obter detalhes). As células foram cultivadas em incubadora humidificada com 5% de CO 2 a 37 ° C, e o meio fresco foi reabastecido todos os dias. Em geral, o cOs pratos ulture devem ser revestidos com colágeno durante 30 min a 1 h antes da semeadura celular. Observamos que há um aprimoramento significativo da aderência KC adulta ao prato quando revestido com colágeno em comparação com o fator de fixação, que é um material de revestimento à base de gelatina. </li><li> Mude o meio 24 h após o revestimento inicial para remover as células não ligadas e mude o meio diariamente até as células chegarem à confluência desejada antes da experiência. </li></ol> 3. Diferenciação in vitro de KCs por alto cálcio <ol><li> Para induzir a diferenciação terminal, adicionar CaCl 2-0,2 mM no meio de cultura. </li><li> Alternativamente, fome os KCs cultivados durante a noite sem suplementos de crescimento adicionados em meio basal de baixo teor de cálcio KC antes da adição de alto teor de cálcio. NOTA: A fome do fator de crescimento aumentará o comprometimento celular para a diferenciação precoce e a indução de marcadores de diferenciação precoce, como o K10 5 </Sup&gt;. </li></ol> 4. Mortalidade celular mediada por irradiação UVB e liberação de TNFα de KCs <ol><li> Cultive os KCs do mouse no meio de crescimento KC (em incubadora humidificada com 5% de CO 2 a 37 ° C) com mudança média diária até as células chegarem à confluência. Imediatamente antes da irradiação UVB, remova o meio de crescimento e substitua-o por 500 μL de PBS. Em seguida, submeta as células a 25 mJ / cm 2 UVB ou controle de simulação (não UVB). NOTA: A irradiação UVB é realizada usando lâmpadas UVB portáteis com duas lâmpadas de 8 W (312 nm) como descrito anteriormente 10 . Após a irradiação UVB, o PBS é aspirado e o meio fresco é adicionado. </li><li> Medir e quantificar a viabilidade celular pelo teste de viabilidade CCK-8 a 6, 8 e 24 h após o tratamento com UVB seguindo as instruções do fabricante 11 . </li><li> Recolher o meio condicionado dos KCs tratados com UVB nos pontos de tempo desejados e medir o TNFα liberadoNo meio condicionado pelo kit ELISA do TNF (Mono / Mono), seguindo as instruções 7 , 12 do fabricante. </li></ol>

<ol>
	<li>Mauro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+barrier+perturbation+abolishes+the+Ca2++and+K++gradients+in+murine+epidermis:+quantitative+measurement+using+PIXE.">Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE.</a> J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).</li><li>Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+calcium+reservoirs+in+mammalian+epidermis:+ultrastructural+localization+by+ion-capture+cytochemistry.">Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry.</a> J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).</li><li>Elias, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+epidermal+calcium+gradient+coincides+with+key+milestones+of+barrier+ontogenesis+in+the+rodent.">Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent.</a> J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).</li><li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture.">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li><li>Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctip2+is+a+dynamic+regulator+of+epidermal+proliferation+and+differentiation+by+integrating+EGFR+and+Notch+signaling.">Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).</li><li>Lai, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+bacteria+regulate+Toll-like+receptor+3-dependent+inflammation+after+skin+injury.">Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury.</a> Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).</li><li>Bernard, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+radiation+damages+self+noncoding+RNA+and+is+detected+by+TLR3.">Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3.</a> Nat Med. 18 (8), (2012).</li><li>Zhang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+Peptide+LL37+and+MAVS+Signaling+Drive+Interferon-beta+Production+by+Epidermal+Keratinocytes+during+Skin+Injury.">Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury.</a> Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).</li><li>Borkowski, A. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+3+activation+is+required+for+normal+skin+barrier+repair+following+UV+damage.">Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage.</a> J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).</li><li>Zillessen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+role+of+dipeptidyl+peptidase+4+(DPP4)+in+primary+human+(pre)adipocytes.">Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes.</a> Sci Rep. 6, 23074 (2016).</li><li>Wells, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage-inducible+C-type+lectin,+mincle,+is+an+essential+component+of+the+innate+immune+response+to+Candida+albicans.">The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans.</a> J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).</li><li>Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+actin+polymerization+is+the+driving+force+for+epithelial+cell-cell+adhesion.">Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion.</a> Cell. 100 (2), 209-219 (2000).</li><li>Zhuang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+receptor+p55+plays+a+pivotal+role+in+murine+keratinocyte+apoptosis+induced+by+ultraviolet+B+irradiation.">TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation.</a> J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).</li><li>Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+utilization+of+epidermal+keratinocytes+for+oncogene+research.">Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research.</a> Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).</li><li>Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+keratinocytes.">Isolation and culture of mouse keratinocytes.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+keratinocyte+culture.">Primary mouse keratinocyte culture.</a> Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).</li><li>Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+murine+epidermal+differentiation+markers+is+tightly+regulated+by+restricted+extracellular+calcium+concentrations+in+vitro.">Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro.</a> J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).</li><li>Yuspa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+for+proliferation+and+differentiation+in+keratinocytes.">Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes.</a> Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).</li><li>Fang, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+enhances+mouse+keratinocyte+differentiation+in+vitro+to+differentially+regulate+expression+of+papillomavirus+authentic+and+codon+modified+L1+genes.">Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes.</a> Virology. 365 (1), 187-197 (2007).</li><li>Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+cell+cycle+exit,+and+onset+of+terminal+differentiation+in+cultured+keratinocytes:+pre-programmed+pathways+in+control+of+C-Myc+and+Notch1+prevail+over+extracellular+calcium+signals.">Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals.</a> J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).</li><li>Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+1.2+mmol/l+calcium,+triamcinolone+acetonide,+and+retinoids+on+low-calcium+regulated+keratinocyte+differentiation.">Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation.</a> Br J Dermatol. 111, 64-72 (1984).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A epiderme da pele funciona como uma barreira crítica para separar e proteger o corpo do ambiente externo e danos causados ​​pela perda de água, patógenos, calor e radiação UV. Os KCs são a linhagem celular predominante da epiderme e a cultura primária de KC epidérmicas é uma ferramenta útil para estudar e compreender os processos biológicos de formação de barreiras e a resposta de KCs a insultos ambientais in vitro . Aqui descrevemos métodos para isolar e cultivar...

A pele é o maior órgão do corpo com a epiderme como a camada mais externa. A epiderme desempenha um papel crítico na formação de uma barreira epidérmica intacta para separar o corpo do meio ambiente e, assim, evita a perda de água e fornece proteção contra insultos ambientais, como alérgenos, agentes patogênicos e exposição a UVB. A epiderme desenvolve a partir de uma única camada de queratinócitos basais indiferenciados (KCs) em um epitélio estratificado de várias camadas, consistindo de uma camada basal, seguida por uma camada espinhosa, camada granular e estrato córneo. Os KCs basais, que consistem em células-tronco epidérmicas e células amplificadoras de trânsito, são proliferativos e indiferenciados. À medida que os KC basais saem do ciclo celular, as células comprometem-se a se diferenciar e migram gradualmente para a superfície da epiderme, acompanhada pela maturação das junções célula-célula e na formação de uma barreira de permeabilidade epidérmica (EPB). Os KCs na camada espinhosa expressam diferenciais iniciaisMarcadores de iões tais como queratina 10 (K10); À medida que os KCs migram para a camada granular, as células expressam marcadores de diferenciação tardia, como Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) e Involucrin (INV). No stratum corneum, os KCs se tornam corneócitos terminalmente diferenciados, que eventualmente são lançados através da descamação, à medida que novas células os substituem. O cálcio é considerado o agente mais fisiológico na epiderme e desencadeia a diferenciação in vitro e in vivo de maneira similar. Na epiderme de pele normal, os íons de cálcio formam um &quot;gradiente de concentração&quot; característico, aumentando a concentração para a superfície da pele 1 , 2 , 3 . A concentração de cálcio aumenta de níveis baixos nas subcamadas mais baixas (camadas basais e espinhosas) até um pico na camada granular superior e depois cai para níveis insignificantes na camada mais superficial (estrato córneo).<html> O gradiente de cálcio também se desenvolve coincidentemente com o surgimento de uma barreira de permeabilidade de componentes, que apóia que a sinalização de cálcio desempenha um papel crítico na diferenciação de KC. In vitro , baixo teor de cálcio (0,02-0,1 mM) mantém a proliferação de KCs basais como monocamada, enquanto que o alto teor de cálcio (&gt; 0,1 mM) induz um comprometimento rápido e irreversível das células para a diferenciação terminal, como demonstrado pela formação e indução da junção apertada De LOR e INV após alto tratamento de cálcio com os KC basais 4 , 5 . Além da formação de barreiras, os KC epidérmicos também são um componente importante do sistema imune inato da pele. Em resposta a patógenos ou padrões moleculares associados danificados (DAMPs) liberados após irradiação UVB ou lesões, os KCs podem produzir grandes quantidades de citocinas inflamatórias, como TNFα, IL6 e IFNβ, levando a ativação do sistema imunológico&gt; 6 , 7 , 8 , 9 . Embora seja necessária uma sinalização inflamatória adequada de KCs para a depuração de patógenos, a resposta inflamatória descontrolada pode desencadear o desenvolvimento de doenças de pele auto-inflamatórias, como psoríase e rosácea 6 , 8 . Em geral, os KCs desempenham um papel vital na manutenção da barreira da pele intacta e no início de uma resposta imune após invasão de patógenos ou insultos ambientais. Portanto, a cultura primária de KCs epidérmicos é uma técnica útil para estudar a biologia epitelial, a diferenciação de KC, bem como as respostas imunes inatas estimuladas por KC. O isolamento e a cultura dos KCs epidérmicos de ratos primários podem ser um processo desafiador devido à susceptibilidade e sensibilidade de KC a vários estimulantes externos. Aqui descrevemos um método para isolar e cultura KCs de pele neonatal de mouse ouPele de cauda de rato adulto. Para o isolamento KC adulto, não usamos a pele dorsal do mouse porque o isolamento de quantidades suficientes de KC viáveis ​​deste tecido pode ser difícil pelas seguintes razões: Primeiro, a pele dorsal adulta na fase de repouso do ciclo do cabelo (telógeno) consiste em um Epiderme fina com apenas 1-2 camadas de células, levando a um baixo rendimento celular e a uma separação ineficiente da epiderme da derme, que é o passo crítico para o sucesso do isolamento de KC. Em segundo lugar, a alta densidade folicular do cabelo que está presente na pele dorsal adulta contribui ainda mais para a dificuldade em separar a epiderme da derme. Em vez disso, usamos rotineiramente a pele da cauda como fonte de KCs para ratos adultos, pois esse epitélio é mais espesso com 3-5 camadas de KC epidérmico. Também possui uma menor densidade do folículo capilar, o que não interfere na separação epidérmica, permitindo o isolamento KC de qualquer pele de rabo de rato adulto, independentemente da idade e do estágio de ciclismo do mouse. A neona isoladaKCs são semeados para pratos de cultura revestidos com gelatina, enquanto que os pratos revestidos com colágeno são utilizados para semente KC adultos isolados devido à capacidade prejudicada das células adultas para aderir em comparação com as suas contrapartes neonatais. Para cultivar KCs de ratinho, o meio basal de baixo cálcio é suplementado com dGS, que contém o fator de crescimento epidérmico (EGF), a transferrina bovina, o fator de crescimento insulino-tipo1 (IGF1), a prostaglandina E2 (PGE2), a albumina de soro bovino (BSA) e a hidrocortisona. Entre 2-4 dias após o chapeamento inicial, a maioria dos KCs diferenciados podem ser lavados durante as mudanças diárias do meio, e as células aderentes restantes apresentam morfologia típica em paralelepípedos 4 , estão proliferando e não expressam o marcador de diferenciação inicial K10.

<table width="633">
	<tbody>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="width:171px;height:100px;">C57BL/6 neonates or adult wildtype mice</td>
			<td style="width:177px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">000664</td>
			<td style="width:167px;">Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">KC basal medium (EpiLife)</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">MEPICF500</td>
			<td style="width:167px;">basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">Defined Growth Supplement (dGS)</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">S0125</td>
			<td style="width:167px;">defined growth supplements for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Dispase powder</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">17105041</td>
			<td style="width:167px;">enzyme to dissociate the epidermis from dermis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">S006100</td>
			<td style="width:167px;">gelatin-based coating material</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Coating Matrix</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">R011K</td>
			<td style="width:167px;">Collagen-based coating material</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="width:171px;height:80px;">TrypLE</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">12604-013</td>
			<td style="width:167px;">A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">100 &#956;m Cell Strainer Nylon mesh</td>
			<td style="width:177px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">CCK-8 cell viability Kit</td>
			<td style="width:177px;">Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD</td>
			<td style="width:119px;">CK04-11</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:119px;">555268</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Corded Hand-Held UV Lamps</td>
			<td style="width:177px;">Spectronics, Westbury, NY</td>
			<td style="width:119px;">EB-280C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:171px;height:20px;">8-watt UV tubes</td>
			<td style="width:177px;">Spectronics, Westbury, NY</td>
			<td style="width:119px;">BLE-8T312</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Light Inverted Microscope for cell culture</td>
			<td style="width:177px;">ZEISS, Jena, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Axio Observer</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:171px;height:20px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:177px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">BX41</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary mouse keratinocytes from neonatal and adult mouse skin

O queratinócito (KC) é o tipo de célula predominante na epiderme, a camada mais externa da pele. Os KC epidérmicos desempenham um papel crítico no fornecimento de defesa da pele ao formar uma barreira da pele intacta contra insultos ambientais, como a irradiação UVB ou patógenos, e também iniciando uma resposta inflamatória sobre esses insultos. Aqui descrevemos métodos para isolar KCs de pele de rato neonatal e de pele de rabo de rato adulto. Também descrevemos condições de cultura usando suplementos de crescimento definidos (dGS) em comparação com o soro fetal bovino chelexado (cFBS). Funcionalmente, mostramos que os KCs neonatais e adultos são altamente responsivos à alta diferenciação terminal induzida por cálcio, formação de junção apertada e estratificação. Além disso, os KCs adultos cultivados são suscetíveis à morte celular desencadeada por UVB e podem liberar grandes quantidades de TNF após a irradiação UVB. Juntos, os métodos descritos aqui serão úteis aos pesquisadores para a configuração do modelo in vitroS para estudar biologia epidérmica no rato neonatal e / ou no rato adulto.

Alta diferenciação terminal induzida por cálcio de KC neonatal e adulto. O primário epidérmico do rato KCs plaqueadas e mantidas a 0,06 mM de CaCl2 cresceu como uma monocamada, e as células individuais tinham uma forma poligonal com espaço intercelular distintas, que mostra o aspecto de paralelepípedos quando confluentes (Figura 1A e Figura 2A). Elevando o CaCl 2-0,2 mM induziu uma ...

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Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Os queratinócitos epidérmicos formam uma barreira funcional da pele e são posicionados na linha de frente da defesa do hospedeiro contra insultos ambientais externos. Aqui descrevemos métodos para isolamento e cultura primária de queratinócitos epidérmicos de pele de rato neonatal e adulta e indução de diferenciação terminal e resposta inflamatória desencadeada por UVB de queratinócitos.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

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Research

JoVE Journal

Biology

30.5K visualizações.  UC San Diego.  Os queratinócitos epidérmicos formam uma barreira funcional da pele e são posicionados na linha de frente da defesa do hospedeiro contra insultos ambientais externos. Aqui descrevemos métodos para isolamento e cultura primária de queratinócitos epidérmicos de pele de rato neonatal e adulta e indução de diferenciação terminal e resposta inflamatória desencadeada por UVB de queratinócitos. 

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In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Biologia

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...