O autor agradece a Robert Holdcraft para assistência técnica. Este estudo foi financiado em parte por um CSREES USDA Especial Grant (2009-34155-19957) e fundos de hatch (NJ08192).

1. Indução locais de voláteis: danos herbívoro <ol><li> Dois ramos de plantas de mirtilo são ensacados com uma luva de poliéster fiado. </li><li> Seis lagartas da mariposa (2 º -3 º ínstares) são colocados dentro dos sacos e permitiu que se alimentar de plantas durante 2 dias antes da coleta de voláteis. Plantas controle não recebem qualquer lagartas. </li><li> Emissões voláteis são coletados como descrito abaixo (protocolo n º 7) no 3 º dia (Figura 1). Mangas de poliéster permanecem nas plantas para evitar a fuga dos insetos. </li></ol> 2. Indução locais de voláteis: danos mecânicos <ol><li> Danos mecânicos às plantas é causado por perfuração buracos para imitar a quantidade de área foliar removida por mariposa cigana. </li><li> Cinco folhas por planta são feridos com dois furos de 7 mm, localizada na base e parte superior das folhas no final do dia 1 e 2. O tratamento controle não recebe danos mecânicos. </li><li&gt; Emissões voláteis são coletados como descrito abaixo no dia 3. </li></ol> 3. Indução locais de voláteis: MeJA <ol><li> Mirtilo plantas são tratadas com 10 mL de uma solução a 1 mM ou 1,5 de MeJA em uma solução a 0,1% Tween-20. </li><li> MeJA é aplicada através de um 2-oz spray. Plantas controle são pulverizadas com 10 mL de uma solução a 0,1% Tween-20. </li><li> As plantas são tratadas às 16:00 hr, e mantidos na estufa por 15 horas dentro de um diâmetro de 17 cm e 35 cm de câmara de Plexiglas alta antes de coleções volátil. </li><li> Emissões voláteis são coletados conforme descrito abaixo. </li></ol> 4. Indução sistêmica de voláteis: sinalização interna <ol><li> A menor ramo de uma planta de mirtilo é ensacado com uma luva de poliéster fiado e danificado, colocando seis (2 º -3 º ínstares) lagartas mariposa cigana dentro do saco. </li><li> O ramo danificado continua fora da câmara de coleta volátil, enquanto o branches acima do ramo danificado são colocados no interior da câmara (Figura 2). </li><li> Lagartas são permitidos para se alimentar no ramo de fundo para dois dias. </li><li> Começando no dia 3, voláteis são coletados a partir da porção intacta de plantas danificadas. </li><li> Voláteis são coletados durante 7 dias consecutivos. Plantas controle são tratados de forma semelhante, mas não receberam danos herbívoro. </li></ol> 5. Conectividade Vascular <ol><li> Este estudo determinou o grau de conectividade vascular entre os diferentes ramos dentro de uma planta de mirtilo. </li><li> A parte final de um ramo inferior de uma planta é cortada para apoiar uma pick água floral contendo 6 mL de uma solução de Rodamina B (Sigma-Aldrich) corante (0,25% w / v), conforme descrito no Orians et al 11. </li><li> Movimento do corante através da planta é monitorada diariamente por sete dias. </li><li> Após 7 dias, a quantidade de coloração vermelha é avaliada visualmente a partir de posições diferentes da planta. </li></ol> 6. Exposição a HIPVs: sinalização externa <ol><li> Ramos dentro de uma planta ou são expostas a partir de um ramo de HIPVs adjacentes ou não receberam a exposição a HIPVs. </li><li> Para expor ramos para HIPVs, um ramo inferior é ensacado com uma luva de poliéster e seis (2 ª instares -3 º) lagartas mariposa cigana são colocados dentro de sacos (Figura 3). </li><li> A planta é enjaulado dentro de uma câmara Plexiglas semelhantes aos descritos acima. Insetos podem se alimentar de plantas durante 2 dias, de modo que ramos adjacentes estão expostos a voláteis emitidos do ramo induzido. </li><li> Após a exposição (dia 3), ramos expostos são colocados dentro da câmara de coleta volátil, deixando de fora ramo insetos feridos (como visto na Figura 2). </li><li> Voláteis da HIPV expostas ramos são recolhidos, conforme descrito abaixo, ea quantidade de área foliar consumida do ramo inferior são medidos usando Scion Image Software. </li></ol> 7. Exposição a HIPVs: priming <ol><li> Para determinar se as plantas são &quot;preparados&quot; após a exposição HIPV, as plantas são tratadas como no protocolo n º 5. </li><li> Metade das plantas estão expostas a partir de um ramo de HIPVs induzida adjacentes, enquanto a outra metade é exposto a galhos danificados. </li><li> No dia 3, quatro primeiros 2 º ínstar as lagartas mariposa cigana são colocados em cada planta e voláteis são coletados como descrito abaixo (Figura 4). </li><li> Depois de coleções voláteis, folhas danificadas por lagartas inicialmente da mariposa, assim como aqueles que estão danificados no dia 3, são excisadas e as quantidades de consumo de área foliar são medidos. </li></ol> 8. Coleta de voláteis <ol><li> Emissões HIPV são amostrados na estufa usando um sistema push-pull. A parte acima do solo de vasos de plantas (tronco, galhos e folhas), incluindo lagartas no tratamento danos herbívoro, são colocados dentro de uma 4 L volacâmara de coleta de azulejos. A guilhotina de 2 peças suporta a base de plantas. Ar purificado entra no topo de cada câmara a uma taxa de 2 L / min. </li><li> Voláteis são recolhidos em armadilhas cheias de 30 mg de Alltech Super-Q adsorvente puxando ar das câmaras a uma taxa de 1 L / min. </li><li> O aparelho coleta de voláteis é composto por quatro câmaras, permitindo coletas simultâneas de compostos voláteis de quatro plantas diferentes (Figura 1). </li><li> Coleções são realizados durante o dia 9:00-17:00 h. </li><li> Após a coleta, todas as folhas das plantas são colhidas, secas em estufa a 60 ° C, e pesadas, e as câmaras são lavados com água de torneira e etanol 70%. </li></ol> 9. Análise de compostos voláteis <ol><li> Os voláteis coletadas de Super-Q armadilhas são eluídos com diclorometano (150 mL) e 400 ng de n-octano é adicionado como padrão interno. </li><li> Separação e quantificação de compostos é feita em uma impressora Hewlett Packard 6890 SeriesCromatógrafo a Gás (GC) (Figura 5), ​​equipado com um detector de ionização de chama (FID) e uma Agilent HP-1 coluna (10 mx 0,53 milímetros x 2,65 mm), e usando como Ele gás portador (fluxo constante = 5 ml / min , velocidade = 39 cm / seg). O programa começou a temperatura a 40 ° C mantida por 1 min, aumentou em 14 ° C / min a 180 ° C (2 min), depois a 40 ° C / min até 200 ° C, e mantidos a 200 ° C por 2 min . </li><li> Identificação tentativa de compostos é realizada em um GC Varian 3400 acoplado a um espectrômetro de massa Finnigan MAT 8230 (MS), equipado com uma coluna Supelco MDN-5S (30 mx 0,32 mm x 0,25 mm), e com Ele como gás de transporte. O MS é operado em ionização de elétrons (EI) e total de íons modo cromatograma (TIC) em 250 ° C (temperatura da fonte). O programa foi iniciado a 35 ° C (1 min), aumentou a 4 ° C / min a 170 ° C, em seguida, a 15 ° C / min a 280 ° C. </li><li> Compostos são tentativamente identificados por comparação dos dados espectrais com os da biblioteca NIST e by índice de retenção GC, e comparando seus tempos de retenção com os de compostos disponíveis comercialmente. </li></ol> 10. Resultados representativos: Vinte e dois compostos voláteis foram identificados a partir de folhas de mirtilo (Figura 6). Figura 7 mostra um cromatógrafo representante de folhas de mirtilo em bom estado e folhas danificadas pela alimentação de mariposa cigana. Danos mecânicos e alimentação por lagartas mariposa cigana aumento das emissões de compostos voláteis localmente a partir de folhas de mirtilo comparados aos controles (Figura 8). Em comparação com a alimentação da lagarta, o tratamento MeJA induzida 11 dos 17 compostos induzida pela mariposa cigana (Figura 9). Houve, no entanto, nenhuma evidência de indução sistêmica de compostos voláteis das folhas não danificadas do gypsy moth-danificados plantas sete dias após o dano inicial de alimentação (ou seja, a falta de sinalização interna) (Figura 10). Além disso, após uma semana, muito lento movimentomento do corante vermelho foi observada entre os ramos de plantas de mirtilo (Figura 11). Houve alta conectividade vascular entre as folhas dentro de um único ramo. No entanto, houve intermediário a baixa conectividade entre os dois ramos alinhados verticalmente dentro de um tiro, e baixa conectividade entre os dois ramos em lados opostos de um tiro. Não houve diferença entre os montantes dos voláteis emitidos a partir de ramos expostos a HIPVs versus os não expostos ao HIPVs (Figura 12). No entanto, HIPVs atuar como um sinal externo de defensivos em blueberries. Lagartas da mariposa alimentado com folhas previamente expostas ao HIPVs consumido material da folha 71% menor que aqueles alimentados com o controle não exposto folhas (Figura 13). Além disso, as quantidades de compostos voláteis emitidos por quantidade de área foliar consumida em HIPV-ramos foram expostos quatro vezes maior em comparação com ramos não expostos (Figura 14), indicando que deixa de HIPV ex-<html> ramos foram colocados mais responsivos a herbivoria (isto é, eles foram preparados). <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Um sistema push-pull é usado para coletar voláteis de plantas de mirtilo. As plantas são colocadas dentro de câmaras de vidro e ar limpo é passado sobre eles. Um filtro contendo um material adsorvente foi anexado ao lado de cada câmara para voláteis emitidos armadilha da planta. Um vácuo é usado para puxar o ar do interior da câmara através do filtro. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Para estudar a resposta sistêmica voláteis de plantas de mirtilo, blueberry ramos mais baixos eram danificadas por lagartas da mariposa (câmara de direito) ou (câmara de esquerda) não danificadas esquerda. Depois de 2 dias (no dia 3), a partir de compostos voláteis não danificadas ramos superiores das plantas danificadas e não danificadas foram coletadas. <html> ONTEÚDO &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Para testar se as folhas dos galhos danificados responder a HIPVs de ramos danificados, eu ensacados um dos ramos em cada uma das plantas de mirtilo. Eu, então, colocado lagartas mariposa cigana dentro dos sacos de metade das plantas. Os sacos Eu costumava permitir o movimento de voláteis de dentro para fora dos sacos. As plantas foram colocadas dentro de câmaras de Plexiglas para expor ramos sem danos para HIPVs. Voláteis foram coletados a partir de galhos expostos. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Para testar se as folhas de ramos danificados são &quot;preparados&quot; após a exposição ao HIPVs, experimentos foram repetidos como descrito na Figura 3, mas lagartas mariposa cigana foram colocados em HIPV-expostos e não expostos ramos dentro de cada câmara de coleta volátil. g &quot;alt =&quot; Figura 5 &quot;/&gt; Figura 5. Depois de coleções voláteis, as amostras são injetadas em um cromatógrafo a gás (GC) para identificar e quantificar os voláteis emitidos por plantas de mirtilo. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Pelo menos 22 compostos são emitidos a partir de folhas de mirtilo. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Figura 7. Cromatógrafos típica de blueberry sem danos folhas e folhas danificadas por lagartas mariposa cigana. Voláteis são emitidos em quantidades muito baixas de folhas sem danos blueberry. No entanto, quando as folhas estão danificadas por lagartas mariposa cigana, a emissão de voláteis aumentou dramaticamente. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig8.jpg" alt="Figura 8"/> Figura 8. O gráfico mostra os montantes de cada um dos 22 compostos voláteis emitidos pelas folhas não atacadas, mechanically-danificados folhas e folhas danificadas por lagartas mariposa cigana. Danos artificiais para imitar a quantidade de área foliar removida por lagartas aumento de emissões voláteis das folhas de mirtilo, mas a resposta foi diferente da resposta voláteis de folhas para alimentação mariposa cigana. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig9.jpg" alt="Figura 9"/> Figura 9. Testado se o caminho JA regula emissão de voláteis em folhas de mirtilo. As plantas foram pulverizadas com diferentes quantidades de MeJA. Descobri que concentrações crescentes de exógena aplicada MeJA aumento das emissões de compostos voláteis de folhas de mirtilo. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig10.jpg" alt="Figura 10"/> Figura 10. O gráfico mostra a quantidade total de compostos voláteis emitidos a partir de ramos de mirtilo e controle de ramos danificados a partir de plantas da mariposa danificado (resposta sistêmica). Voláteis foram coletados por um atal de 7 dias consecutivos. Eu não encontrei nenhuma indução sistêmica de compostos voláteis até 7 dias após o dano inicial de galhos mais baixos das plantas. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig11.jpg" alt="Figura 11"/> Figura 11. Usei rodamina-B (corante vermelho) para determinar o grau de conectividade entre os ramos vascular nas plantas de mirtilo. Descobri que aprox. 80%, 20%, 5% e 0% de folhas de ramos contendo o corante, ramos diretamente acima do ramo que contém o corante, filiais em todo o ramo que contém corante, e sucursais situadas em um tiroteio diferentes dentro de uma planta de mirtilo, respectivamente, foram totalmente coradas com o corante. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig12.jpg" alt="Figura 12"/> Figura 12. O gráfico mostra a quantidade de compostos voláteis emitidos a partir de ramos expostos a ramos HIPVs e não expostos. Eu achei que a exposição a HIPVs não afetou as emissões voláteis em neighchato ramos de mirtilo sem danos. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig13.jpg" alt="Figura 13"/> Figura 13. O gráfico mostra a quantidade de alimentação por lagartas da mariposa em ramos de mirtilo expostos a ramos HIPVs e não expostos. Lagartas em HIPV expostas ramos consumiram menos quantidade de folhagem em comparação com aqueles em ramos não expostos. <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig14.jpg" alt="Figura 14"/> Figura 14. Quando eu calculada a taxa de emissão por unidade de área consumida, descobri que HIPV expostas ramos tinham aumentado as taxas de emissão de compostos voláteis em comparação com ramos não impressionados, indicando que a exposição a HIPVs preparado folhas em ramos de mirtilo para uma resposta aumentada volátil.

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	<li>Dicke, M., Van Loon, J. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multitrophic+effects+of+herbivore-induced+plant+volatiles+in+an+evolutionary+context.">Multitrophic effects of herbivore-induced plant volatiles in an evolutionary context.</a> Entomol. Exp. Appl. 97, 237-237 (2000).</li><li>Mumm, R., Dicke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+natural+plant+products+and+the+attraction+of+bodyguards+involved+in+indirect+plant+defense.">Variation in natural plant products and the attraction of bodyguards involved in indirect plant defense.</a> Can. J. Zool. 88, 628-628 (2010).</li><li>Hopke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore-induced+volatiles:+the+emission+of+acyclic+homoterpenes+from+leaves+of+Phaseolus+lunatus+and+Zea+mays+can+be+triggered+by+a+&#946;-glucosidase+and+jasmonic+acid.">Herbivore-induced volatiles: the emission of acyclic homoterpenes from leaves of Phaseolus lunatus and Zea mays can be triggered by a &#946;-glucosidase and jasmonic acid.</a> FEBS Lett. 352, 146-146 (1994).</li><li>Rodriguez-Saona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+electrophysiological+responses+of+the+emerald+ash+borer,+Agrilus+planipennis,+to+induced+volatiles+of+Manchurian+ash,+Fraxinus+mandshurica.">Behavioral and electrophysiological responses of the emerald ash borer, Agrilus planipennis, to induced volatiles of Manchurian ash, Fraxinus mandshurica.</a> Chemoecology. 16, 75-75 (2006).</li><li>Rodriguez-Saona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore+induced+volatiles+in+the+perennial+shrub,+Vaccinium+corymbosum,+and+their+role+in+inter-branch+signaling.">Herbivore induced volatiles in the perennial shrub, Vaccinium corymbosum, and their role in inter-branch signaling.</a> J. Chem. Ecol. 35, 163-163 (2009).</li><li>Karban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage-induced+resistance+in+sagebrush:+volatiles+are+key+to+intra-+and+interplant+communication.">Damage-induced resistance in sagebrush: volatiles are key to intra- and interplant communication.</a> Ecology. 87, 922-922 (2006).</li><li>Frost, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-plant+signalling+by+volatiles+overcomes+vascular+constraints+on+systemic+signalling+and+primes+responses+against+herbivores.">Within-plant signalling by volatiles overcomes vascular constraints on systemic signalling and primes responses against herbivores.</a> Ecol. Lett. 10, 490-490 (2007).</li><li>Heil, M., Bueno Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-plant+signaling+by+volatiles+leads+to+induction+and+priming+of+an+indirect+plant+defense+in+nature.">Within-plant signaling by volatiles leads to induction and priming of an indirect plant defense in nature.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5467-5467 (2007).</li><li>Turlings, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+herbivore-induced+plant+odors+by+host-seeking+parasitic+wasps.">Exploitation of herbivore-induced plant odors by host-seeking parasitic wasps.</a> Science. 250, 1251-1251 (1990).</li><li>Makovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatiles+involved+in+the+nonhost+rejection+of+Fraxinus+pennsylvanica+by+Lymantria+dispar+larvae.">Volatiles involved in the nonhost rejection of Fraxinus pennsylvanica by Lymantria dispar larvae.</a> J. Agric. Food Chem. 44, 929-929 (1996).</li></ol>

Eu não tenho nada a revelar

O push-pull aparelho de coleta de voláteis descrito aqui representa um método padrão para coleções headspace de voláteis de plantas. Este aparelho foi utilizado para determinar a resposta voláteis de folhas de mirtilo à herbivoria por lagartas mariposa cigana e também me permitiu fornecer novas evidências para o papel de HIPVs na planta intra-sinalização. Os resultados aqui apresentados mostram que a alimentação da lagarta, exógena aplicada MeJA, mecânicos e ferindo aumento d...

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Voláteis câmaras coleção </td><td> Analytical Research Systems, Inc. </td><td> VCC-G6X12DT-1P </td><td> Gainesville, FL </td></tr><tr><td> Compressor de ar, 20 gal, livre de óleo, 2 hp </td><td> Ocidental </td><td> 3JR71 </td><td> Vendido por Grainger, Inc. </td></tr><tr><td> Air sistema de entrega </td><td> Analytical Research Systems, Inc. </td><td> VCS-ADS-4AFM4C </td><td> Gainesville, FL </td></tr><tr><td> Air sistema de coleta </td><td> Analytical Research Systems, Inc. </td><td> VCS-MVCS-4CX1P </td><td> Gainesville, FL </td></tr><tr><td> Bomba de vácuo 100-150V, ¼ hp </td><td> Gast Manufacturing, Inc. </td><td> <a href="http://www.grainger.com/Grainger/GAST-Vacuum-Pump-4F740">4F740</a> </td><td> Vendido por Grainger, Inc. </td></tr><tr><td> Metil jasmonato </td><td> Sigma-Aldrich &lt;/ Td&gt; <td> J2500 </td><td> St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 93773 </td><td> St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Rodamina-B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td> St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Garrafas plásticas de spray, 2 oz </td><td> Setco Inc. </td><td></td><td> Cranbury, NJ </td></tr><tr><td> Spun mangas de poliéster </td><td> Rockingham Oportunidades Corp </td><td></td><td> Reidsville, NC </td></tr><tr><td> Super-Q volátil armadilhas coleção </td><td> Analytical Research Systems, Inc. </td><td> VCT-1/4X3-SPQ </td><td> Gainesville, FL </td></tr><tr><td> Scion Software Imagem </td><td> Scion Corporação </td><td></td><td> Frederick, MD </td></tr><tr><td> Diclorometano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270997 </td><td> St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Cromatógrafo a gás HP 6890 </td><td> Hewlett Packard </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cromatógrafo a gás Varian 3400 </td><td> Varian </td><td&gt; </td><td></td></tr><tr><td> n-octano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 296988 </td><td> St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Massa MAT espectrômetro de 8230 </td><td> Finnigan </td><td></td><td> San Jose, CA </td></tr><tr><td> HP-1 coluna GC </td><td> Agilent Technologies </td><td></td><td> Palo Alto, CA </td></tr><tr><td> MDN-5S coluna GC </td><td> Supelco, Inc. </td><td></td><td> Bellefonte, PA </td></tr></table>

herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling

Voláteis herbívoro induzida por planta (HIPVs) são comumente emitidos a partir de plantas após 1,2 ataque de herbívoros. Estes são principalmente HIPVs regulamentada pela defensiva ácido jasmônico hormônio vegetal (JA) e seu metil-jasmonato voláteis derivativos (MeJA) 3,4,5. Nos últimos três décadas pesquisadores têm documentado que HIPVs pode repelir ou atrair herbívoros, atraem os inimigos naturais de herbívoros e, em alguns casos podem induzir ou defesas de plantas prime antes do ataque de herbívoros. Em um recente artigo 6, I informou que a alimentação por lagartas da mariposa, a aplicação exógena MeJA e danos mecânicos induzem as emissões de compostos voláteis de plantas de mirtilo, embora de forma diferente. Além disso, ramos de mirtilo responder a HIPVs emitida a partir de ramos vizinhos da mesma planta, aumentando os níveis de JA e resistência a herbívoros (ou seja, as defesas de plantas direto) e pelas emissões priming volátil (isto é, as defesas de plantas indiretos). Similar encontrarSeres têm sido relatados recentemente para sagebrush 7, 8 álamo, e feijão 9 .. Aqui, eu descrevo um método push-pull para coletar voláteis blueberry induzida por herbívoros (mariposa cigana) de alimentação, aplicação MeJA exógena, e danos mecânicos. A unidade de recolha volátil consiste de uma câmara de coleta 4 L volátil, uma guilhotina de 2 peças, um sistema de entrega de ar que purifica o ar que entra, e um sistema de vácuo conectada a uma armadilha cheia de Super-Q adsorvente para coletar voláteis 5,6,10 . Voláteis coletadas em Super-Q armadilhas são eluídos com diclorometano e depois separados e quantificados por cromatografia gasosa (GC). Este método de coleta de voláteis foi usada n meu estudo de 6 a investigar a resposta volátil dos galhos danificados à exposição a substâncias voláteis a partir de ramos herbívoras danificados dentro de plantas de mirtilo. Estes métodos são descritos aqui. Brevemente, sem danos ramos de mirtilo estão expostos a HIPVs from ramos vizinhos dentro da mesma planta. Usando as mesmas técnicas descritas acima, voláteis emitidos a partir de ramos após a exposição ao HIPVs são coletados e analisados.

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Herbivore-induced Blueberry Volatiles and Intra-plant Signaling

Um método push-pull para a recolha de voláteis de plantas é descrito. O método permite uma comparação dos voláteis induzidos pela alimentação herbívora, metil-jasmonato exógena, e danos mecânicos. Esta técnica também é usada para investigar a resposta volátil dos galhos danificados à exposição a substâncias voláteis a partir de ramos herbívoras danificados dentro de plantas de mirtilo.

Herbívoro induzida Voláteis Blueberry e planta-Intra Sinalização

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2.  These HIPVs are mainly regulated by the defensive ...

herbivore-induced-blueberry-volatiles-and-intra-plant-signaling

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K visualizações.  Rutgers University. Um método push-pull para a recolha de voláteis de plantas é descrito. O método permite uma comparação dos voláteis induzidos pela alimentação herbívora, metil-jasmonato exógena, e danos mecânicos. Esta técnica também é usada para investigar a resposta volátil dos galhos danificados à exposição a substâncias voláteis a partir de ramos herbívoras danificados dentro de plantas de mirtilo.

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Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Técnicas de imagem Ca 2 + Sinalização no esperma humano

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Biologia

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

Translocação polarizada de proteínas fluorescentes em Xenopus Ectodérmicas em resposta à sinalização Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

Visualização dos Vascular Ca 2 + Sinalização Disparado por parácrina ROS Derivado

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Bioensaio eletroantenográfica como uma ferramenta de triagem para voláteis da planta hospedeira

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the brain, liver, retina, cochlea and vasculature. In experimental settings, intercellular Ca2+-waves can be elicited by applying a mechanical stimulus to a single cell. This leads to the release of the intracellular signaling molecules IP3 and Ca2+ that initiate the propagation of the Ca2+-wave concentrically from the mechanically stimulated cell to the neighboring cells. The main molecular pathways that control intercellular Ca2+-wave propagation are provided by gap junction channels through the direct transfer of IP3 and by hemichannels through the release of ATP. Identification and characterization of the properties and regulation of different connexin and pannexin isoforms as gap junction channels and hemichannels are allowed by the quantification of the spread of the intercellular Ca2+-wave, siRNA, and the use of inhibitors of gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-wave in monolayers of primary corneal endothelial cells loaded with Fluo4-AM in response to a controlled and localized mechanical stimulus provoked by an acute, short-lasting deformation of the cell as a result of touching the cell membrane with a micromanipulator-controlled glass micropipette with a tip diameter of less than 1 &mu;m. We also describe the isolation of primary bovine corneal endothelial cells and its use as model system to assess Cx43-hemichannel activity as the driven force for intercellular Ca2+-waves through the release of ATP. Finally, we discuss the use, advantages, limitations and alternatives of this method in the context of gap junction channel and hemichannel research.

Intercellular Ca2+-waves are driven by gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-waves in cell monolayers in response to a local single-cell mechanical stimulus and its application to investigate the properties and regulation of gap junction channels and hemichannels.

A estimulação mecânica induzida por cálcio Propagação de Ondas em monocamadas de células: O Exemplo de Bovinos endotélio corneano

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabólica Labeling e Membrana Fracionamento para Comparative Analysis proteômica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensão de células

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolamento e Cultura de rato adulto Cardiomyocytes de sinalização celular e<em&gt; In vitro</em&gt; A hipertrofia cardíaca

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

A medição da taxa metabólica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Usando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - Combinando optogenética com Citometria de Fluxo

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...