Name: evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices
Uploaded: 2017-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
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Este trabalho foi apoiado pelo MRC, UE FP7, PHELIPE, Wellcome Trust e Parkinson UK. Também gostaríamos de agradecer a Sra. Johanna Buchler por sua contribuição de imagens confocal e os membros do laboratório para a sua entrada construtivo sobre o manuscrito e metodologia.

todos os experimentos utilizando ratos e ratos foram aprovados e realizados utilizando programação 1 procedimentos cobertos ao abrigo da lei do escritório Home animais (procedimentos científicos) 1986. A receita de fluido cerebrospinal artificial (ACSF) pode ser encontrada na tabela 1.
 1. preparação de fatias Hippocampal aguda <ol><li>remover o cérebro de rato tão rapidamente quanto possível, usando uma espátula e afiadas tesouras para cortar o crânio e coloque-o na gelada, oxigenado (95% O 2, 5% CO 2), ACSF alta-sacarose (~ 100 mL).</li>
	<li>Coloque o cérebro do rato sobre uma placa de Petri e remover o cerebelo e uma pequena parte do córtex frontal com um bisturi antes hemisecting para baixo da linha média do cérebro.</li>
	<li>Posicione os dois hemisférios do lado que foi apenas corte e cole cada Hemisfério para o palco de um vibratome.</li>
	<li>Cortar seções de 200-300 µm de espessura da região completa de interesse. No caso do hipocampo, aproximadamente 3 a 4 fatias por hemisfério devem ser obtidas.</li>
	<li>Com uma pipeta Pasteur plástica, transfira as fatias para uma câmara submersa no oxigenado (95% O 2, 5% CO 2) ACSF. Manter a 34 ° C por 30 min. 
	Nota: O tratamento de fatias com agentes farmacológicos ativos, tais como proteínas recombinantes Dkk1, pode ser executado nesta fase, adicionando os agentes para a câmara de fatia.</li>
	<li>Remover as fatias da câmara usando um pincel, coloque-os em uma placa de 24 e corrigir por 20 min a 1 h em paraformaldeído 4% (sacarose PFA)/4% à temperatura ambiente (RT). 
	Cuidado: PFA é tóxica, use proteção adequada.</li>
	<li>Lavar as fatias três vezes em 1X PBS (10 min cada). 
	Nota: O protocolo pode ser pausado aqui por 1-2 dias, enquanto as fatias são mantidas a 4 ° C em 1X PBS.</li>
</ol> 2. Imunofluorescência para marcadores sinápticos Nota: as receitas de todos os buffers usados podem ser encontradas na tabela 2.
<ol><li>Substituir a PBS com buffer de bloqueio/permeabilizing (tabela 2) em poços de fatia e incubar a RT para 4-6 h.</li>
	<li>Diluir o anticorpo policlonal cobaia contra vGlut1 a uma diluição de 1:2,000 no buffer de bloqueio/permeabilizacao. 
	Nota: vGlut1 é um marcador para visualização de terminal excitatório pré-sinápticos. Para identificação de pós-sinápticos excitatórios sinapse, usar um anticorpo policlonal contra PSD-95 e diluído 1: 500 na mesma solução. Use um volume mínimo de 300 µ l em cada poço. Para identificar a localização anatômica do hipocampo, use um anticorpo que pode também identificar a estrutura neuronal, como MAP2 ou tubulina. Resolver as concentrações corretas de todos os anticorpos primários para os marcadores sinápticos de escolha (pré e pós sináptica) e diluir em buffer fresco de bloqueio/permeabilizing.</li>
	<li>Incubar as fatias na solução de anticorpo primário durante a noite (ou 1-2 dias), a 4 ° C. utilizar uma plataforma de agitação com movimento vigoroso.</li>
	<li>Lavar as fatias três vezes em PBS (10 min cada).</li>
	<li>Diluído a 1: 500 anticorpos secundários apropriados em tampão de bloqueio. Por exemplo, quando usando o anticorpo de cobaia vGlut1, aplica um anticorpo secundário que reconhece o componente de cobaia (por exemplo, burro anti-Guiné-porco) conjugado com um fluoróforo específico. Ao usar o anticorpo de coelho PSD-95, aplicar um anticorpo secundário que reconhece o componente de coelho (por exemplo, burro anticoelho), conjugado com um fluoróforo específico diferente.</li>
	<li>Incubar as fatias nesta solução por 2-3 h no RT. Certifique-se de que as fatias são protegidas contra a luz, como anticorpos secundários são sensíveis à luz.</li>
	<li>Lavar as fatias três vezes em PBS (10 min cada).</li>
	<li>, Com cuidado, retire as fatias da placa 24 usando um pincel e colocá-los uniformemente em lâminas de vidro previamente rotulados. Adicionar uma gota de meio de montagem em cima de cada fatia e em seguida, coloque delicadamente uma lamela de vidro em cima as fatias. Evite a formação de bolhas de ar. Tome cuidado para usar suficiente meio de montagem (300-400 µ l), como uma quantidade insuficiente pode levar a secar fatias.</li>
	<li>Deixar secar por um período mínimo de 1-2 dias no RT e manter os slides, protegidos da luz.</li>
	<li>Armazenar os slides a 4 ° C, a curto prazo, mas para armazenamento a longo prazo, mantê-los em -20 ° C.</li>
</ol> 3. Análise e aquisição de imagens confocal <ol><li>usando laser confocal, microscopia eletrônica de varredura de imagem.
	<ol><li>Identificar a região do hipocampo para criação da imagem (por exemplo, o cornu ammonis 1 e 3 (CA1, CA3) ou o giro denteado (DG)) através de 10x ou 20x objetivo.</li>
		<li>Mudança para um 40 x ou x 63 objectivo de imersão de óleo para garantir que a anatomia da fatia está intacta, identificando neuritos contínuos e organizada estrutura. Use um marcador neuronal, como MAP2, como referência ( figura 1A).</li>
		<li>, Posteriormente, mudar para um 60 x objetivo de óleo-imersão (nd = ~1.3 - 1,4) e ajustar as configurações de cada canal para obter sinal ideal e contraste. Definir a intensidade de cada laser para evitar a saturação de qualquer pixels usando uma opção de alto / baixo contraste. 
		Nota: Estas configuração vai depender o microscópio usado, mas referir-se a Tabela de materiais para as configurações de energia do laser usado na Figura 2, Figura 3, e Figura 4. Para melhores resultados, use uma resolução de 1024 x 1024 pixels. As configurações devem permanecer constantes em todas as condições diferentes da mesma experiência. Zoom adicional pode ser aplicado, se necessário.</li>
		<li>Avaliar a profundidade onde a mancha é mesmo e adquirir pilhas de imagem de pelo menos 8 equidistantes (250 nm) aviões. Em seguida, tomar 3 pilhas adjacentes imagens representativas da mesma área de interesse por fatia. 
		Nota: A profundidade pode variar de uma fatia para outro, mas sempre deve ser aproximadamente 2-5 µm da superfície da fatia.</li>
		<li>Repetir a aquisição em pelo menos 3 fatias por condição e de 6 a 8 animais por grupo de tratamento.</li>
	</ol></li> <li>Análise de imagem. 
	Nota: Use um software de análise de imagem automático (consulte a Tabela de materiais). Observe que alguns sistemas requerem uma licença, enquanto outros estão livres, tais como ImageJ. O software utilizado deve analisar as imagens em 3D, tendo em conta todos os aviões da pilha fotografada. Consulte a Tabela de materiais para os detalhes do software utilizado na análise da imagem ( Figura 1).
	<ol><li>Uso um protocolo de limiar de intensidade custom-baseada para identificar todos os partitura sináptica e marcadores neuronais, que são otimizados manualmente e selecionados dentro do software [ver Tabela de materiais para o software específico utilizado neste protocolo]. 
		Nota: O software identifica uma intensidade mínima e máxima para cada fluoróforo e associa um percentual de intensidade para cada objeto reconhecido. Note-se que o percentual de intensidade variará de acordo com o fluoróforo usado e o anticorpo contra o marcador sináptico.</li>
		<li>Para marcadores sinápticos, certifique-se de que o tamanho filtra (&#62; 0.1µm 3 e &#60; 0.8µm 3) são selecionados dentro do software e aplicado à imagem. Ajuste os parâmetros para garantir que os objetos selecionados não se sobrepõem. Excluir qualquer objeto que são muito grande ou muito pequeno para ser considerado partitura sináptica (ver Figura 2B). 
		Nota: Uma vez otimizado, os mesmos valores de limiar são então aplicados a todas as imagens dentro de um determinado experimento.</li>
		<li>Quantificar o número médio, intensidade e volume de partitura sináptica individual (pré ou pós-sinápticos) usando os protocolos otimizados limiar selecionados dentro do software. Normalize o número de partitura para o volume do campo de imagem (mais ou menos 16.928 µm 3 no sistema usado aqui). Normalizar a intensidade sináptica partitura para a intensidade do marcador neuronal referência. 
		Nota: As sinapses são definidas como a localização co entre marcadores pré e pós-sináptica. Uma vez os protocolos de limiar para pré e pós sináptica partitura have foi estabelecida, o software deve identificar a localização co de partitura sináptica como a sobreposição de 1 pixel ou mais em um único plano. 
		Nota: Para a análise estatística, confirme que todos os conjuntos de amostras seguem normalidade e homogeneidade de variância, conforme determinado pelo Lilliefords e testes χ2, respectivamente. Amostras, mostrando uma distribuição normal e a homogeneidade da variância devem ser analisadas com testes paramétricos, conforme descrito abaixo. Por exemplo, análise de partitura sinápticos excitatórios deve ser realizada uma ANOVA One-Way com bloqueio e replicação. Cada experimento individual deve ser considerado como um bloco; Normalmente, existem três experimentos independentes, cada um com 1-3 ratos de cada condição.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg" /> Figura 1: análise de partitura sináptica através da análise de imagem software. (A) Screenshot da personalização de protocolo de limiar de intensidade. O exemplo dado é para o PSD-95, em que a partitura selecionada tem um tamanho definido de &#62; 0.1 µm 3 e &#60; 0,8 µm 3 e presentes minimizados objetos sobrepostos. Observe que a imagem mostrada é para um avião confocal permitir a fácil visualização de partitura sináptica e seleção do parâmetro exato. (B) Screenshot da análise de saída a partir do software (após a seleção do protocolo otimizado). Um exemplo de partitura sináptica cru números medições com base no volume. Esses valores são então exportados para um software de planilha eletrônica. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
 <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg" /> Figura 2: verificação da qualidade das configurações de fatia e parâmetro para partitura sináptica. (A) representante imagens confocal (objetiva de 40 x) da região de interesse: o CA1 stratum radiatum (sr) e estrato oriens (assim) de uma fatia hippocampal são identificados pela coloração MAP2. Barra de escala = 2 µm. (B) imagens Confocal (60 x objetivo e um adicional 1.3 X ampliação do software de aquisição) do CA1 stratum radiatum, com marcadores excitatórios-vGlut1 (verde) e PSD-95 (vermelho)-de fatias hippocampal. Observe a identificação de partitura claro pré e pós-sináptica. Maior do que 0,8 µm 3 partitura excluem-se da quantificação (setas brancas). Barra de escala = 2 µm (C) Confocal imagens (60 x objetivo e um adicional 1.3 X ampliação do software de aquisição) do CA1 stratum radiatum, com marcadores excitatórios-vGlut1 (verde)-do criostato-corte hippocampal seções do cérebro inteiro fixa-se no programa de acção. Observe a presença de grandes buracos e manchas irregulares, agrupados vGlut1. Barra de escala = 2 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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	<li>Malenka, R. C., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+and+LTD:+an+embarrassment+of+riches.">LTP and LTD: an embarrassment of riches.</a> Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).</li><li>Arendt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+degeneration+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic degeneration in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).</li><li>Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+cell+adhesion.">Synaptic cell adhesion.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694 (2012).</li><li>Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+of+an+excitatory+synapse.">The architecture of an excitatory synapse.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).</li><li>Dobie, F. A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+synapse+dynamics:+coordinated+presynaptic+and+postsynaptic+mobility+and+the+major+contribution+of+recycled+vesicles+to+new+synapse+formation.">Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation.</a> J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).</li><li>Jackson, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tau+increases+amyloid+beta+plaque+size+but+not+amyloid+beta-mediated+synapse+loss+in+a+novel+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer's disease.</a> Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).</li><li>Heck, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+automated+3D+detection+of+synaptic+contacts+reveals+the+formation+of+cortico-striatal+synapses+upon+cocaine+treatment+in+vivo.">A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).</li><li>Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+levels+of+PSD95+and+two+associated+proteins+and+increased+levels+of+BCl2+and+caspase+3+in+hippocampus+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment:+Insights+into+their+potential+roles+for+loss+of+synapses+and+memory,+accumulation+of+Abeta,+and+neurodegeneration+in+a+prodromal+stage+of+Alzheimer's+disease.">Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).</li><li>Harwell, C. S., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptophysin+depletion+and+intraneuronal+Abeta+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+from+huAPP+transgenic+mice.">Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 44 (2016).</li><li>Marzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+Synapse+Degeneration+by+Restoring+Wnt+Signaling+in+the+Adult+Hippocampus.">Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus.</a> Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).</li><li>Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+dysfunction+in+neurodevelopmental+disorders+associated+with+autism+and+intellectual+disabilities.">Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).</li><li>Janezic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficits+in+dopaminergic+transmission+precede+neuron+loss+and+dysfunction+in+a+new+Parkinson+model.">Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).</li><li>Caricasole, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Dickkopf-1,+a+negative+modulator+of+the+Wnt+pathway,+is+associated+with+neuronal+degeneration+in+Alzheimer's+brain.">Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's brain.</a> J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).</li><li>De Ferrari, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+genetic+variation+within+the+low-density+lipoprotein+receptor-related+protein+6+and+late-onset+Alzheimer's+disease.">Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).</li><li>Liu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+LRP6-mediated+Wnt+signaling+contributes+to+synaptic+abnormalities+and+amyloid+pathology+in+Alzheimer's+disease.">Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer's disease.</a> Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).</li><li>Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Secreted+Wnt+Antagonist+Dickkopf-1+Is+Required+for+Amyloid+beta-Mediated+Synaptic+Loss.">The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss.</a> J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).</li><li>Rosi, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Dickkopf-1+expression+in+transgenic+mouse+models+of+neurodegenerative+disease.">Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease.</a> J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).</li><li>Budnik, V., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+during+synaptic+development+and+plasticity.">Wnt signaling during synaptic development and plasticity.</a> Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).</li><li>Ciani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+tunes+neurotransmitter+release+by+directly+targeting+Synaptotagmin-1.">Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1.</a> Nat Commun. 6, 8302 (2015).</li><li>Dickins, E. M., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnts+in+action:+from+synapse+formation+to+synaptic+maintenance.">Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance.</a> Front Cell Neurosci. 7, 162 (2013).</li><li>Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+in+neuronal+differentiation+and+development.">Wnt signalling in neuronal differentiation and development.</a> Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).</li><li>Galli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+Wnt+signalling+triggers+striatal+synaptic+degeneration+and+impaired+motor+behaviour+in+adult+mice.">Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice.</a> Nat Commun. 5, 4992 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A avaliação precisa do número da sinapse é essencial para o campo da neurociência. Aqui, nós mostramos como avaliar a densidade das sinapses região CA1 stratum radiatum de fatias hippocampal como um sistema modelo. O significado no que diz respeito a métodos existentes é demonstrado em nosso recente artigo de pesquisa sobre o efeito da deficiência de Wnt no hipocampo, e onde também foram avaliados o número sinapse por single-seção EM10. A magnitude da perda de sinapse são semelhantes entre EM single-seção e o cérebro-fatia método descrito aqui10. Assim, esta constatação demonstra a precisão e a confiabilidade da técnica.
Importante, uma limitação tanto EM single-seção e imunocoloração sinapses, tal como apresentado aqui, é a incapacidade para estimar com precisão o número absoluto de sinapse para uma região específica do cérebro. Com efeito, é importante identificar quaisquer alterações morfológicas globais, como mudanças no volume total poderiam impactar número sináptico. Outra limitação é que certos anticorpos são menos eficientes na coloração de regiões do cérebro intacto, parcialmente devido à extrema densidade de conexões sinápticas. Nós experimentamos maior qualidade coloração de vGlut1 e gephyrin usando esta fatia preparação e fixação de PFA subsequente para um máximo de 1 h, comparado à fixação imediata do cérebro inteiro em PFA (Figura 2). Este último levou a coloração sináptica agrupados, com buracos no tecido. No entanto, a penetração de anticorpo vGlut1 ainda é restrito em ambos os métodos (um par de dezenas de mícrons). Nós não superar essa limitação, mesmo com aumento de anticorpos incubação, mas fornecendo a penetração de anticorpo é maior que a profundidade total que é fotografada, não deve haver nenhuma influência no resultado final. Além disso, especial deve ter cuidado para garantir que a mancha está mesmo em toda a pilha inteira adquirida.
Em nosso estudo, nós quisemos distinguir excitatórios de sinapses inibitórias. Consequentemente, nós escolhemos vGlut1/PSD-95 e vGAT/gephyrin, respectivamente, como estas proteínas são altamente expressa no hipocampo de rato adulto e são específicas para cada subtipo de sinapse4,5. Outros marcadores sinápticos excitatórios e inibitórios poderiam ter sido utilizados para identificar cada sinapse respectivo, tais como enriquecido em cada sinapse, incluindo receptores NMDA e Leandro para os receptores excitatórios e receptores GABAA para sinapses inibitórias. Outros neurotransmissores ou neuromodulators também podem ser identificados com nosso protocolo, garantindo que os anticorpos específicos estão disponíveis, como mostrado por sinapses dopaminérgicos no striatum22. Além disso, reduzindo a espessura de cada fatia de 120 µm pode parcialmente superar a baixa quantidade de amostras obtidas com fatias agudas, que é imperativo para estudos em estruturas do cérebro pequeno como a amígdala.
As aplicações futuras do nosso protocolo poderiam ser implementadas no estudo de áreas diferentes do cérebro e transtornos. Por exemplo, no corpo estriado (uma região do cérebro associada com a doença de Parkinson), uma combinação de vGlut2/PSD-95 ou vGlut1/PSD-95 pode ser usada para diferenciar entre as sinapses excitatórias de afferents provenientes do córtex ou tálamo, respectivamente22.
Em conclusão, temos mostrado um método confiável para examinar o número de sinapses nos tecidos do cérebro usando marcadores pré e pós-sináptica para definir uma sinapse. Passos críticos incluem a preparação de fatias hippocampal boas, um tempo de fixação de até 1 h em PFA, a aplicação de suficiente meio de montagem, o uso de anticorpos fiáveis, configurações de aquisição de imagem apropriada e a detecção de partitura sináptica rigorosas. Em última análise, este método é relativamente rápido e facilmente reproduzível por alguns laboratórios que têm acesso a um microscópio confocal.

O cérebro humano é composto de aproximadamente 1014 sinapses. Número de sinapse é fortemente regulamentado durante o desenvolvimento e maturação do sistema nervoso central (SNC). Durante todo o desenvolvimento, o número de sinapse é modulado por sinaptogênese e poda para formar redes neuronais funcionais. Aprendizagem e memória são suportados pelo Regulamento da sinapse número e força, um processo conhecido como potenciação sináptica e depressão1. Importante, a estabilização das sinapses maduras é essencial para manter as conexões de rede neuronal. Além disso, déficits na densidade de sinapse foram relatados nas fases iniciais das condições neurodegenerativas como a doença de Alzheimer (AD)2. Portanto, a capacidade de precisão de identificar e avaliar o número de sinapse é fundamental para a avaliação da patologia e fisiologia do cérebro.
A extrema densidade e natureza compacta de sinapses tornam desafiadora para estimar seu número exacto em áreas do cérebro intacto. Sinapses químicas no SNC são feitas de dois neurônios em aposição perto, separados por uma fissura sináptica3. O terminal pré-sináptica, ou bouton sináptica, emerge de um axônio e consiste de vesículas acumuladas, que contêm os neurotransmissores que definem a especificidade de uma sinapse — ou seja, glutamato e ácido gama - aminobutírico (GABA) para excitatórios e inibitório sinapses, respectivamente. As membranas das vesículas contêm vesiculares transportadores específicos para cada neurotransmissor: transporte vesicular glutamato (vGlut) para glutamato e transportador vesicular de GABA (vGAT) para GABA. O terminal pós-sináptica é uma estrutura altamente densa composta de várias proteínas, incluindo moléculas de adesão, receptores e proteínas de andaime. Nas sinapses excitatórias, proteína pós-sináptica de densidade-95 (PSD-95) é o mais abundante andaime proteína4, modulando excitatórios N-methyl-D-aspartate(NMDA-) e receptor de ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (Leandro) função, Considerando que gephyrin Ancora receptores inibitórios para o terminal pós-sináptica inibitória5. Total, a especificidade das proteínas para compartimentos pré e pós-sináptica auxílio na diferenciação e identificação dos subtipos de sinapse.
A avaliação do número de sinapse pode ser realizada com diferentes técnicas. O mais comum é o uso da microscopia de elétron (EM), que permite a análise da sinapse em áreas do cérebro intacto e compacto com alta ampliação e resolução. No entanto, esta técnica é muito cara, exige a preparação da amostra complicado e é muito demorada. Outras técnicas incluem o uso de matriz tomografia computadorizada6, que tem uma grande desvantagem em que requer equipamento especializado e caro para realizar a análise. Além disso, linhas transgênicas expressando marcadores sinápticos específicos são úteis na avaliação de sinapse número7, mas a geração de novas linhas pode ser restritivas e caro, e a superexpressão de proteínas pode resultar em indesejável fora do alvo fenótipos.
Devido a essas limitações e para manter a simplicidade, muitos pesquisadores avaliam número de sinapse, examinando os níveis de proteína total sináptica. No entanto, perda de sinapse pode ser observada antes de alterações substanciais em proteína, como resultados de remodelação sinápticos estruturais na dispersão de aposição de pré ou pós-sináptica, com nenhuma degradação de proteínas sinápticas. Além disso, no anúncio, os níveis de proteína sináptica são seguir reduzida sinapse degeneração ou morte neuronal8,9. A quantificação dos níveis totais não permite que esta distinção. Assim, há uma necessidade de desenvolver um método confiável, acessível e preciso para a avaliação do número de sinapses no cérebro.
Neste artigo, descrevemos como completamente identificar e determinar o número de sinapses usando microscopia de imunofluorescência em fatias hippocampal cérebro de roedor. As sinapses são definidas pelo colocalization de marcadores pré e pós-sináptica, que aparecem em uma distribuição punctate. Vamos demonstrar a validade desta técnica através do estudo da Wnt sinalização no cérebro. Wnts são secretadas proteínas importantes para a formação, eliminação e manutenção das sinapses. A indução na vivo de um antagonista secretada da cascata da Wnt, Dickkopf-1 (Dkk1), leva à perda sináptica excitatória preservando sinapses inibitórias no hipocampo10. Podemos ilustrar a identificação e contagem das sinapses excitatórias e inibitórias em fatias hippocampal de um rato adulto expressar Dkk1 e destacar a possibilidade de transferência desta técnica a outros tipos de preparações de cultura do tecido.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5905</td><td>vGlut1 (1:2000)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA1-046</td><td>PSD-95 (1:500)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Synaptic Systems</td><td>131 004</td><td>vGAT (1:500)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Synaptic Systems</td><td>147011</td><td>Gephyrin (1:500)</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td>MAP2 (1:10000)</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Jackson Laboratories</td><td>706-545-148</td><td>Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600)</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab175470</td><td>Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)</td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>SouthernBiotech</td><td>00-4958-02</td><td>Fluoromount-G</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%.</td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>PerkinElmer</td><td>NA</td><td>Volocity</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Swann-Morton</td><td>203</td><td>No 11</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Loctite</td><td>1446875</td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>BOC</td><td>NA</td><td>Cylinder</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Thermo</td><td>7107</td><td>08-1.0mm thick</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>iDkk1 mice</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKII&amp;alpha; rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKII&amp;alpha; rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for solutions:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Ca&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Mg&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Kynurenic acid</td><td>Sigma</td><td>K3375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid</td><td>Sigma</td><td>107360</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Millipore</td><td>S30-100ml</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices

No cérebro, sinapses são junções especializadas entre os neurônios, determinar a força e a propagação da sinalização neuronal. O número de sinapses é fortemente regulamentado durante o desenvolvimento e maturação neuronal. Importante, os défices em número de sinapse podem levar a disfunção cognitiva. Portanto, a avaliação do número de sinapse é parte integrante da neurobiologia. No entanto, como as sinapses são pequenas e altamente compacta no cérebro intacto, a avaliação do número absoluto é um desafio. Este protocolo descreve um método para identificar e avaliar as sinapses em fatias hippocampal roedores, utilizando microscopia de imunofluorescência facilmente. Ele inclui um processo de três etapas para avaliar as sinapses em imagens de alta qualidade de microscopia confocal, analisando a localização co das proteínas pré e pós-sinápticas em fatias hippocampal. Ele também explica como a análise é realizada e dá exemplos representativos de sinapses excitatórios e inibitórios. Este protocolo fornece uma base sólida para a análise de sinapses e pode ser aplicado a qualquer pesquisa investigando a estrutura e função do cérebro.

Perda de sinapse ocorre no início de doenças neurodegenerativas, como AD e a doença de Parkinson2,11,12. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a estes défices permanecem mal compreendidos. Deficiências na sinalização Wnt têm sido associadas com AD13,14,15,16,17. Wnts são glicoproteínas secretadas e desempenham um papel essencial na formação da sinapse e a modulação da transmissão sináptica18,19,20,21. Recentemente, nós identificamos Wnts como reguladores chaves da manutenção sináptica no sistema nervoso maduro,10,22. Para estudar com precisão o impacto de sinalização de Wnt em sinapses no hipocampo de camundongos geneticamente modificados, aproveitamos uma preparação de fatia do cérebro e microscopia confocal para avaliar as alterações no número de sinapse. Nós identificamos fatias saudáveis em que a estrutura era bem preservadas (Figura 2A). Além disso, a seleção de partitura sináptica cuidadosamente foi definida, com a exclusão de objetos grandes manchadas, provavelmente representando proteínas agregadas (Figura 2B). Este critério foi aplicado a todas as imagens, com os mesmos parâmetros de análise rigorosa.
Usamos um sistema de modelo transgênico que induz a expressão do antagonista de Wnt secretada Dkk1 em adultos (iDkk1) de ratos sob tetraciclina controlam (veja a Tabela de materiais)10,22. Demonstrámos que o bloqueio de sinalização de Wnt no hipocampo adulto provoca perda de sinapse excitatória, especificamente na região CA1 stratum radiatum (Figura 3). Figura 3A ilustra imagens confocal representante dos marcadores pré e pós-sinápticos excitatórios (vGlut1 e PSD-95, respectivamente) adquiridos de fatias hippocampal de ratos iDkk1 expressando Dkk1 para duas semanas, bem como seus respectivos controles. Analisamos estas imagens utilizando o software Volocity e demonstrou uma redução significativa do número de sinapses excitatórias, quantificada pela localização co do vGlut1 - e PSD-95-rotulado partitura na região CA1 do hipocampo de ratos iDkk1 seguindo o indução de Dkk1 por duas semanas (Figura 3B, * p &#60; 0,05; Teste de Kruskal-Wallis; 6 ratos por genótipo). No CA1 stratum radiatum, o número de partitura excitatório sinapse por 1.000 µm3 foi reduzido de 500 em ratos de controle para 300 em ratos iDkk1. Em contraste, induzida Dkk1 expressão não afetou o número de sinapses inibitórias (identificado pela localização co entre o pré e pós-sináptica marcadores vGAT e gephyrin, respectivamente), como mostrado na Figura 4A-B (p &#62; 0,05; Teste de Kruskal-Wallis; 3 ratos por genótipo).
Importante, realizamos uma análise do poder estatístico para estimar o número adequado de animais necessários para gerar estes resultados robustos e fatias. Usando R, calculamos que aproximadamente 35 fatias por condição eram necessários (animais de fatias x 6 de 3 imagens x 3 = 36) para detectar um efeito de grande tamanho (f = 0,4) com 80% de confiança (poder = 0,8) em uma ANOVA One-Way com bloqueio e replicação, conforme descrito na etapa 3.2.6.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
Figura 3: perda de sinapses excitatórias em fatias hippocampal de ratos iDkk1. (A) imagens confocal representante de CA1 estrato radiatum mostrar excitatórios sinapses, identificados por localização co entre vGlut1 e PSD-95 (setas brancas). O painel inferior representa uma ampliação maior do retângulo realçada. Escala de barras = 2 µm. (B) a percentagem de sinapses excitatórias entre controle e iDkk1 foi quantificada utilizando o software mencionado na Tabela de materiais (* p &#60; 0,05; Teste de Kruskal-Wallis; 6 ratos por genótipo). Os dados são representados ± SEM. Esta figura foi modificada de referência10. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
Figura 4: sinapses inibitórias são inalteradas em fatias hippocampal de ratos iDkk1. (A) imagens confocal representante do CA1 stratum radiatum de sinapses inibitórias identificado pela localização co entre vGAT e gephyrin (setas brancas). O painel inferior representa uma ampliação maior do retângulo realçada. Escala de barras = 2 µm. (B) percentagem de sinapses inibitórias entre ratos controle e iDkk1, conforme quantificada utilizando o software Volocity (p &#62; 0,05; Teste de Kruskal-Wallis; 3 ratos por genótipo). Os dados são representados ± SEM. Esta figura foi modificada de referência10. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alta sacarose ACSF componentes</td>
			<td>Concentração</td>
			<td>Notas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>75 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2h2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido cinurênico</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido pirúvico</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Adicionar após a oxigenação da solução</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 mM</td>
			<td>Adicionar após a oxigenação da solução</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glicose</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarose</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Câmara submersa ACSF componentes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2h2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Adicionar após a oxigenação da solução</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1 mM</td>
			<td>Adicionar após a oxigenação da solução</td>
		
		<tr>
			<td>D-glicose</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	

Tabela 1: Composição de ACSF.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffer de bloqueio/permeabilizing</td>
			<td>Concentração</td>
			<td>Notas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soro de burro</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>0,50%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x PBS</td>
			<td></td>
			<td>pH de 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>1,37 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>27 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>18 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA/4% de sacarose</td>
			<td></td>
			<td>pH de 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td>Diluir de 10 x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>1,33 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarose</td>
			<td>117 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Buffers usados para coloração de imunofluorescência.

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Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Um protocolo para com precisão, identificando e analisando as sinapses em fatias hippocampal usando a imunofluorescência é descrito neste artigo.

Avaliação da densidade de sinapse em fatias Hippocampal cérebro de roedor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

evaluation-of-synapse-density-in-hippocampal-rodent-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.9K visualizações.  University College London. Um protocolo para com precisão, identificando e analisando as sinapses em fatias hippocampal usando a imunofluorescência é descrito neste artigo.

Vídeo: Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

Preparação de fatias do hipocampo aguda de ratos e camundongos transgênicos para o Estudo das Alterações Synaptic durante o envelhecimento e amilóide Patologia

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Neurociência

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic connectivity mechanisms work properly and homeostasis is maintained. The hippocampus is a unique brain structure that manages higher cognitive functions, and is the subject of several studies regarding neurologic diseases. The investigation of physiological and pathological mechanisms in rodent models can benefit from acute hippocampal slice (AHS) preparations. AHS has the advantage of providing reliable information on cell function since the cytoarchitecture and synaptic circuits are preserved. Although AHS preparations are commonly used in neurochemistry laboratories, it is possible to find some methodological differences in the literature. Considering that distinctive slice preparation protocols might change the hippocampal regions analyzed, this current protocol proposes a standard technique for obtaining transverse AHS from resected hippocampus. This simple-to-perform protocol may be used in mice and rats&#39; experimental models and allow several ex vivo approaches investigating neurochemical dynamics (in dorsal, intermediate and ventral hippocampus) in different backgrounds (e.g., transgenic manipulations) or after in vivo manipulations (e.g., pharmacological treatments or suitable rodent models to study clinical disorders). After dissecting the hippocampus from the rodent brain, transverse slices along the septo-temporal axis (300 &#181;m thick) were obtained. These AHS contain distinct parts of the hippocampus and were subjected to an individual neurochemical investigation (as an example: neurotransmitter transporters using their respective substrates). As the hippocampus presents a high density of excitatory synapses, and glutamate is the most important neurotransmitter in the brain, the glutamatergic system is an interesting target for in vivo observed phenomena. Thus, the current protocol provides detailed steps to explore glutamate uptake in ex vivo AHS using L-[3H]-Glutamate. Using this protocol to investigate hippocampal function may help to better understand the influence of glutamate metabolism on mechanisms of neuroprotection or neurotoxicity.

Measurement of Glutamate Uptake using Radiolabeled L-[3H]-Glutamate in Acute Transverse Slices Obtained from Rodent Resected Hippocampus

This article describes a reliable and simple way to obtain ex vivo acute hippocampal transverse slices from mice and rats using a tissue chopper. Slices obtained from resected hippocampi can be submitted for functional glutamate uptake analysis to investigate glutamatergic system homeostasis.

Glutamate removal from the extracellular space by high-affinity Na+-dependent transporters is essential to ensure that the brain&#39;s intrinsic ...

Bioquímica

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Avaliação de dendríticas Arborização no giro dentado do hipocampo em Ratos Região

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

Minimizando a hipóxia em fatias hipocampais de camundongos adultos e envelhecidos

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

Corte cerebral aguda do rato para investigar atividade espontânea da rede hipocampal

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Fatias hipocampais horizontais do cérebro do rato

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

Preparação de fatias agudas do hipocampo dorsal para gravação de células inteiras e reconstrução neuronal no giro dentado de camundongos adultos

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Microscopic Analysis of Synapses in Mouse Hippocampal Slices Using Immunofluorescence

<a href='https://app.jove.com/v/56153/evaluation-of-synapse-density-in-hippocampal-rodent-brain-slices'>Source: McLeod, F., et al. Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices. J. Vis. Exp. (2017).</a>This video demonstrates a method for visualizing synaptic markers in hippocampal brain slices using confocal immunofluorescence analysis. The slices are immunostained with primary antibodies targeting presynaptic and postsynaptic markers, followed by fluorophore-conjugated secondary antibodies. The labeled markers are then visualized using confocal microscopy to evaluate the synaptic architecture through their colocalization.

Source: McLeod, F., et al. Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates a method for ...