Este trabalho foi apoiado pelo MRC, UE FP7, PHELIPE, Wellcome Trust e Parkinson UK. Também gostaríamos de agradecer a Sra. Johanna Buchler por sua contribuição de imagens confocal e os membros do laboratório para a sua entrada construtivo sobre o manuscrito e metodologia.

todos os experimentos utilizando ratos e ratos foram aprovados e realizados utilizando programação 1 procedimentos cobertos ao abrigo da lei do escritório Home animais (procedimentos científicos) 1986. A receita de fluido cerebrospinal artificial (ACSF) pode ser encontrada na tabela 1.
 1. preparação de fatias Hippocampal aguda <ol><li>remover o cérebro de rato tão rapidamente quanto possível, usando uma espátula e afiadas tesouras para cortar o crânio e coloque-o na gelada, oxigenado (95% O 2, 5% CO 2), ACSF alta-sacarose (~ 100 mL).</li>
	<li>Coloque o cérebro do rato sobre uma placa de Petri e remover o cerebelo e uma pequena parte do córtex frontal com um bisturi antes hemisecting para baixo da linha média do cérebro.</li>
	<li>Posicione os dois hemisférios do lado que foi apenas corte e cole cada Hemisfério para o palco de um vibratome.</li>
	<li>Cortar seções de 200-300 µm de espessura da região completa de interesse. No caso do hipocampo, aproximadamente 3 a 4 fatias por hemisfério devem ser obtidas.</li>
	<li>Com uma pipeta Pasteur plástica, transfira as fatias para uma câmara submersa no oxigenado (95% O 2, 5% CO 2) ACSF. Manter a 34 ° C por 30 min. 
	Nota: O tratamento de fatias com agentes farmacológicos ativos, tais como proteínas recombinantes Dkk1, pode ser executado nesta fase, adicionando os agentes para a câmara de fatia.</li>
	<li>Remover as fatias da câmara usando um pincel, coloque-os em uma placa de 24 e corrigir por 20 min a 1 h em paraformaldeído 4% (sacarose PFA)/4% à temperatura ambiente (RT). 
	Cuidado: PFA é tóxica, use proteção adequada.</li>
	<li>Lavar as fatias três vezes em 1X PBS (10 min cada). 
	Nota: O protocolo pode ser pausado aqui por 1-2 dias, enquanto as fatias são mantidas a 4 ° C em 1X PBS.</li>
</ol> 2. Imunofluorescência para marcadores sinápticos Nota: as receitas de todos os buffers usados podem ser encontradas na tabela 2.
<ol><li>Substituir a PBS com buffer de bloqueio/permeabilizing (tabela 2) em poços de fatia e incubar a RT para 4-6 h.</li>
	<li>Diluir o anticorpo policlonal cobaia contra vGlut1 a uma diluição de 1:2,000 no buffer de bloqueio/permeabilizacao. 
	Nota: vGlut1 é um marcador para visualização de terminal excitatório pré-sinápticos. Para identificação de pós-sinápticos excitatórios sinapse, usar um anticorpo policlonal contra PSD-95 e diluído 1: 500 na mesma solução. Use um volume mínimo de 300 µ l em cada poço. Para identificar a localização anatômica do hipocampo, use um anticorpo que pode também identificar a estrutura neuronal, como MAP2 ou tubulina. Resolver as concentrações corretas de todos os anticorpos primários para os marcadores sinápticos de escolha (pré e pós sináptica) e diluir em buffer fresco de bloqueio/permeabilizing.</li>
	<li>Incubar as fatias na solução de anticorpo primário durante a noite (ou 1-2 dias), a 4 ° C. utilizar uma plataforma de agitação com movimento vigoroso.</li>
	<li>Lavar as fatias três vezes em PBS (10 min cada).</li>
	<li>Diluído a 1: 500 anticorpos secundários apropriados em tampão de bloqueio. Por exemplo, quando usando o anticorpo de cobaia vGlut1, aplica um anticorpo secundário que reconhece o componente de cobaia (por exemplo, burro anti-Guiné-porco) conjugado com um fluoróforo específico. Ao usar o anticorpo de coelho PSD-95, aplicar um anticorpo secundário que reconhece o componente de coelho (por exemplo, burro anticoelho), conjugado com um fluoróforo específico diferente.</li>
	<li>Incubar as fatias nesta solução por 2-3 h no RT. Certifique-se de que as fatias são protegidas contra a luz, como anticorpos secundários são sensíveis à luz.</li>
	<li>Lavar as fatias três vezes em PBS (10 min cada).</li>
	<li>, Com cuidado, retire as fatias da placa 24 usando um pincel e colocá-los uniformemente em lâminas de vidro previamente rotulados. Adicionar uma gota de meio de montagem em cima de cada fatia e em seguida, coloque delicadamente uma lamela de vidro em cima as fatias. Evite a formação de bolhas de ar. Tome cuidado para usar suficiente meio de montagem (300-400 µ l), como uma quantidade insuficiente pode levar a secar fatias.</li>
	<li>Deixar secar por um período mínimo de 1-2 dias no RT e manter os slides, protegidos da luz.</li>
	<li>Armazenar os slides a 4 ° C, a curto prazo, mas para armazenamento a longo prazo, mantê-los em -20 ° C.</li>
</ol> 3. Análise e aquisição de imagens confocal <ol><li>usando laser confocal, microscopia eletrônica de varredura de imagem.
	<ol><li>Identificar a região do hipocampo para criação da imagem (por exemplo, o cornu ammonis 1 e 3 (CA1, CA3) ou o giro denteado (DG)) através de 10x ou 20x objetivo.</li>
		<li>Mudança para um 40 x ou x 63 objectivo de imersão de óleo para garantir que a anatomia da fatia está intacta, identificando neuritos contínuos e organizada estrutura. Use um marcador neuronal, como MAP2, como referência ( figura 1A).</li>
		<li>, Posteriormente, mudar para um 60 x objetivo de óleo-imersão (nd = ~1.3 - 1,4) e ajustar as configurações de cada canal para obter sinal ideal e contraste. Definir a intensidade de cada laser para evitar a saturação de qualquer pixels usando uma opção de alto / baixo contraste. 
		Nota: Estas configuração vai depender o microscópio usado, mas referir-se a Tabela de materiais para as configurações de energia do laser usado na Figura 2, Figura 3, e Figura 4. Para melhores resultados, use uma resolução de 1024 x 1024 pixels. As configurações devem permanecer constantes em todas as condições diferentes da mesma experiência. Zoom adicional pode ser aplicado, se necessário.</li>
		<li>Avaliar a profundidade onde a mancha é mesmo e adquirir pilhas de imagem de pelo menos 8 equidistantes (250 nm) aviões. Em seguida, tomar 3 pilhas adjacentes imagens representativas da mesma área de interesse por fatia. 
		Nota: A profundidade pode variar de uma fatia para outro, mas sempre deve ser aproximadamente 2-5 µm da superfície da fatia.</li>
		<li>Repetir a aquisição em pelo menos 3 fatias por condição e de 6 a 8 animais por grupo de tratamento.</li>
	</ol></li> <li>Análise de imagem. 
	Nota: Use um software de análise de imagem automático (consulte a Tabela de materiais). Observe que alguns sistemas requerem uma licença, enquanto outros estão livres, tais como ImageJ. O software utilizado deve analisar as imagens em 3D, tendo em conta todos os aviões da pilha fotografada. Consulte a Tabela de materiais para os detalhes do software utilizado na análise da imagem ( Figura 1).
	<ol><li>Uso um protocolo de limiar de intensidade custom-baseada para identificar todos os partitura sináptica e marcadores neuronais, que são otimizados manualmente e selecionados dentro do software [ver Tabela de materiais para o software específico utilizado neste protocolo]. 
		Nota: O software identifica uma intensidade mínima e máxima para cada fluoróforo e associa um percentual de intensidade para cada objeto reconhecido. Note-se que o percentual de intensidade variará de acordo com o fluoróforo usado e o anticorpo contra o marcador sináptico.</li>
		<li>Para marcadores sinápticos, certifique-se de que o tamanho filtra (&#62; 0.1µm 3 e &#60; 0.8µm 3) são selecionados dentro do software e aplicado à imagem. Ajuste os parâmetros para garantir que os objetos selecionados não se sobrepõem. Excluir qualquer objeto que são muito grande ou muito pequeno para ser considerado partitura sináptica (ver Figura 2B). 
		Nota: Uma vez otimizado, os mesmos valores de limiar são então aplicados a todas as imagens dentro de um determinado experimento.</li>
		<li>Quantificar o número médio, intensidade e volume de partitura sináptica individual (pré ou pós-sinápticos) usando os protocolos otimizados limiar selecionados dentro do software. Normalize o número de partitura para o volume do campo de imagem (mais ou menos 16.928 µm 3 no sistema usado aqui). Normalizar a intensidade sináptica partitura para a intensidade do marcador neuronal referência. 
		Nota: As sinapses são definidas como a localização co entre marcadores pré e pós-sináptica. Uma vez os protocolos de limiar para pré e pós sináptica partitura have foi estabelecida, o software deve identificar a localização co de partitura sináptica como a sobreposição de 1 pixel ou mais em um único plano. 
		Nota: Para a análise estatística, confirme que todos os conjuntos de amostras seguem normalidade e homogeneidade de variância, conforme determinado pelo Lilliefords e testes χ2, respectivamente. Amostras, mostrando uma distribuição normal e a homogeneidade da variância devem ser analisadas com testes paramétricos, conforme descrito abaixo. Por exemplo, análise de partitura sinápticos excitatórios deve ser realizada uma ANOVA One-Way com bloqueio e replicação. Cada experimento individual deve ser considerado como um bloco; Normalmente, existem três experimentos independentes, cada um com 1-3 ratos de cada condição.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg" /> Figura 1: análise de partitura sináptica através da análise de imagem software. (A) Screenshot da personalização de protocolo de limiar de intensidade. O exemplo dado é para o PSD-95, em que a partitura selecionada tem um tamanho definido de &#62; 0.1 µm 3 e &#60; 0,8 µm 3 e presentes minimizados objetos sobrepostos. Observe que a imagem mostrada é para um avião confocal permitir a fácil visualização de partitura sináptica e seleção do parâmetro exato. (B) Screenshot da análise de saída a partir do software (após a seleção do protocolo otimizado). Um exemplo de partitura sináptica cru números medições com base no volume. Esses valores são então exportados para um software de planilha eletrônica. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
 <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg" /> Figura 2: verificação da qualidade das configurações de fatia e parâmetro para partitura sináptica. (A) representante imagens confocal (objetiva de 40 x) da região de interesse: o CA1 stratum radiatum (sr) e estrato oriens (assim) de uma fatia hippocampal são identificados pela coloração MAP2. Barra de escala = 2 µm. (B) imagens Confocal (60 x objetivo e um adicional 1.3 X ampliação do software de aquisição) do CA1 stratum radiatum, com marcadores excitatórios-vGlut1 (verde) e PSD-95 (vermelho)-de fatias hippocampal. Observe a identificação de partitura claro pré e pós-sináptica. Maior do que 0,8 µm 3 partitura excluem-se da quantificação (setas brancas). Barra de escala = 2 µm (C) Confocal imagens (60 x objetivo e um adicional 1.3 X ampliação do software de aquisição) do CA1 stratum radiatum, com marcadores excitatórios-vGlut1 (verde)-do criostato-corte hippocampal seções do cérebro inteiro fixa-se no programa de acção. Observe a presença de grandes buracos e manchas irregulares, agrupados vGlut1. Barra de escala = 2 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Os autores não têm nada para divulgar.

A avaliação precisa do número da sinapse é essencial para o campo da neurociência. Aqui, nós mostramos como avaliar a densidade das sinapses região CA1 stratum radiatum de fatias hippocampal como um sistema modelo. O significado no que diz respeito a métodos existentes é demonstrado em nosso recente artigo de pesquisa sobre o efeito da deficiência de Wnt no hipocampo, e onde também foram avaliados o número sinapse por single-seção EM10. A magnitude da perda de sinapse são semelhantes entre EM single-seção e o cérebro-fatia método descrito aqui10. Assim, esta constatação demonstra a precisão e a confiabilidade da técnica.
Importante, uma limitação tanto EM single-seção e imunocoloração sinapses, tal como apresentado aqui, é a incapacidade para estimar com precisão o número absoluto de sinapse para uma região específica do cérebro. Com efeito, é importante identificar quaisquer alterações morfológicas globais, como mudanças no volume total poderiam impactar número sináptico. Outra limitação é que certos anticorpos são menos eficientes na coloração de regiões do cérebro intacto, parcialmente devido à extrema densidade de conexões sinápticas. Nós experimentamos maior qualidade coloração de vGlut1 e gephyrin usando esta fatia preparação e fixação de PFA subsequente para um máximo de 1 h, comparado à fixação imediata do cérebro inteiro em PFA (Figura 2). Este último levou a coloração sináptica agrupados, com buracos no tecido. No entanto, a penetração de anticorpo vGlut1 ainda é restrito em ambos os métodos (um par de dezenas de mícrons). Nós não superar essa limitação, mesmo com aumento de anticorpos incubação, mas fornecendo a penetração de anticorpo é maior que a profundidade total que é fotografada, não deve haver nenhuma influência no resultado final. Além disso, especial deve ter cuidado para garantir que a mancha está mesmo em toda a pilha inteira adquirida.
Em nosso estudo, nós quisemos distinguir excitatórios de sinapses inibitórias. Consequentemente, nós escolhemos vGlut1/PSD-95 e vGAT/gephyrin, respectivamente, como estas proteínas são altamente expressa no hipocampo de rato adulto e são específicas para cada subtipo de sinapse4,5. Outros marcadores sinápticos excitatórios e inibitórios poderiam ter sido utilizados para identificar cada sinapse respectivo, tais como enriquecido em cada sinapse, incluindo receptores NMDA e Leandro para os receptores excitatórios e receptores GABAA para sinapses inibitórias. Outros neurotransmissores ou neuromodulators também podem ser identificados com nosso protocolo, garantindo que os anticorpos específicos estão disponíveis, como mostrado por sinapses dopaminérgicos no striatum22. Além disso, reduzindo a espessura de cada fatia de 120 µm pode parcialmente superar a baixa quantidade de amostras obtidas com fatias agudas, que é imperativo para estudos em estruturas do cérebro pequeno como a amígdala.
As aplicações futuras do nosso protocolo poderiam ser implementadas no estudo de áreas diferentes do cérebro e transtornos. Por exemplo, no corpo estriado (uma região do cérebro associada com a doença de Parkinson), uma combinação de vGlut2/PSD-95 ou vGlut1/PSD-95 pode ser usada para diferenciar entre as sinapses excitatórias de afferents provenientes do córtex ou tálamo, respectivamente22.
Em conclusão, temos mostrado um método confiável para examinar o número de sinapses nos tecidos do cérebro usando marcadores pré e pós-sináptica para definir uma sinapse. Passos críticos incluem a preparação de fatias hippocampal boas, um tempo de fixação de até 1 h em PFA, a aplicação de suficiente meio de montagem, o uso de anticorpos fiáveis, configurações de aquisição de imagem apropriada e a detecção de partitura sináptica rigorosas. Em última análise, este método é relativamente rápido e facilmente reproduzível por alguns laboratórios que têm acesso a um microscópio confocal.

O cérebro humano é composto de aproximadamente 1014 sinapses. Número de sinapse é fortemente regulamentado durante o desenvolvimento e maturação do sistema nervoso central (SNC). Durante todo o desenvolvimento, o número de sinapse é modulado por sinaptogênese e poda para formar redes neuronais funcionais. Aprendizagem e memória são suportados pelo Regulamento da sinapse número e força, um processo conhecido como potenciação sináptica e depressão1. Importante, a estabilização das sinapses maduras é essencial para manter as conexões de rede neuronal. Além disso, déficits na densidade de sinapse foram relatados nas fases iniciais das condições neurodegenerativas como a doença de Alzheimer (AD)2. Portanto, a capacidade de precisão de identificar e avaliar o número de sinapse é fundamental para a avaliação da patologia e fisiologia do cérebro.
A extrema densidade e natureza compacta de sinapses tornam desafiadora para estimar seu número exacto em áreas do cérebro intacto. Sinapses químicas no SNC são feitas de dois neurônios em aposição perto, separados por uma fissura sináptica3. O terminal pré-sináptica, ou bouton sináptica, emerge de um axônio e consiste de vesículas acumuladas, que contêm os neurotransmissores que definem a especificidade de uma sinapse — ou seja, glutamato e ácido gama - aminobutírico (GABA) para excitatórios e inibitório sinapses, respectivamente. As membranas das vesículas contêm vesiculares transportadores específicos para cada neurotransmissor: transporte vesicular glutamato (vGlut) para glutamato e transportador vesicular de GABA (vGAT) para GABA. O terminal pós-sináptica é uma estrutura altamente densa composta de várias proteínas, incluindo moléculas de adesão, receptores e proteínas de andaime. Nas sinapses excitatórias, proteína pós-sináptica de densidade-95 (PSD-95) é o mais abundante andaime proteína4, modulando excitatórios N-methyl-D-aspartate(NMDA-) e receptor de ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (Leandro) função, Considerando que gephyrin Ancora receptores inibitórios para o terminal pós-sináptica inibitória5. Total, a especificidade das proteínas para compartimentos pré e pós-sináptica auxílio na diferenciação e identificação dos subtipos de sinapse.
A avaliação do número de sinapse pode ser realizada com diferentes técnicas. O mais comum é o uso da microscopia de elétron (EM), que permite a análise da sinapse em áreas do cérebro intacto e compacto com alta ampliação e resolução. No entanto, esta técnica é muito cara, exige a preparação da amostra complicado e é muito demorada. Outras técnicas incluem o uso de matriz tomografia computadorizada6, que tem uma grande desvantagem em que requer equipamento especializado e caro para realizar a análise. Além disso, linhas transgênicas expressando marcadores sinápticos específicos são úteis na avaliação de sinapse número7, mas a geração de novas linhas pode ser restritivas e caro, e a superexpressão de proteínas pode resultar em indesejável fora do alvo fenótipos.
Devido a essas limitações e para manter a simplicidade, muitos pesquisadores avaliam número de sinapse, examinando os níveis de proteína total sináptica. No entanto, perda de sinapse pode ser observada antes de alterações substanciais em proteína, como resultados de remodelação sinápticos estruturais na dispersão de aposição de pré ou pós-sináptica, com nenhuma degradação de proteínas sinápticas. Além disso, no anúncio, os níveis de proteína sináptica são seguir reduzida sinapse degeneração ou morte neuronal8,9. A quantificação dos níveis totais não permite que esta distinção. Assim, há uma necessidade de desenvolver um método confiável, acessível e preciso para a avaliação do número de sinapses no cérebro.
Neste artigo, descrevemos como completamente identificar e determinar o número de sinapses usando microscopia de imunofluorescência em fatias hippocampal cérebro de roedor. As sinapses são definidas pelo colocalization de marcadores pré e pós-sináptica, que aparecem em uma distribuição punctate. Vamos demonstrar a validade desta técnica através do estudo da Wnt sinalização no cérebro. Wnts são secretadas proteínas importantes para a formação, eliminação e manutenção das sinapses. A indução na vivo de um antagonista secretada da cascata da Wnt, Dickkopf-1 (Dkk1), leva à perda sináptica excitatória preservando sinapses inibitórias no hipocampo10. Podemos ilustrar a identificação e contagem das sinapses excitatórias e inibitórias em fatias hippocampal de um rato adulto expressar Dkk1 e destacar a possibilidade de transferência desta técnica a outros tipos de preparações de cultura do tecido.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5905</td>
			<td>vGlut1 (1:2000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-046</td>
			<td>PSD-95 (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>131 004</td>
			<td>vGAT (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>147011</td>
			<td>Gephyrin (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td>MAP2 (1:10000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>706-545-148</td>
			<td>Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175470</td>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td>Fluoromount-G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volocity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>203</td>
			<td>No 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1446875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2, 5% CO2</td>
			<td>BOC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Cylinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>7107</td>
			<td>08-1.0mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDkk1 mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKII&#945; rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKII&#945; rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for solutions:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V800372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S30-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices

No cérebro, sinapses são junções especializadas entre os neurônios, determinar a força e a propagação da sinalização neuronal. O número de sinapses é fortemente regulamentado durante o desenvolvimento e maturação neuronal. Importante, os défices em número de sinapse podem levar a disfunção cognitiva. Portanto, a avaliação do número de sinapse é parte integrante da neurobiologia. No entanto, como as sinapses são pequenas e altamente compacta no cérebro intacto, a avaliação do número absoluto é um desafio. Este protocolo descreve um método para identificar e avaliar as sinapses em fatias hippocampal roedores, utilizando microscopia de imunofluorescência facilmente. Ele inclui um processo de três etapas para avaliar as sinapses em imagens de alta qualidade de microscopia confocal, analisando a localização co das proteínas pré e pós-sinápticas em fatias hippocampal. Ele também explica como a análise é realizada e dá exemplos representativos de sinapses excitatórios e inibitórios. Este protocolo fornece uma base sólida para a análise de sinapses e pode ser aplicado a qualquer pesquisa investigando a estrutura e função do cérebro.

Perda de sinapse ocorre no início de doenças neurodegenerativas, como AD e a doença de Parkinson2,11,12. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a estes défices permanecem mal compreendidos. Deficiências na sinalização Wnt têm sido associadas com AD13,14,15,16,17. Wnts são glicoproteínas secretadas e desempenham um papel essencial na formação da sinapse e a modulação da transmissão sináptica18,19,20,21. Recentemente, nós identificamos Wnts como reguladores chaves da manutenção sináptica no sistema nervoso maduro,10,22. Para estudar com precisão o impacto de sinalização de Wnt em sinapses no hipocampo de camundongos geneticamente modificados, aproveitamos uma preparação de fatia do cérebro e microscopia confocal para avaliar as alterações no número de sinapse. Nós identificamos fatias saudáveis em que a estrutura era bem preservadas (Figura 2A). Além disso, a seleção de partitura sináptica cuidadosamente foi definida, com a exclusão de objetos grandes manchadas, provavelmente representando proteínas agregadas (Figura 2B). Este critério foi aplicado a todas as imagens, com os mesmos parâmetros de análise rigorosa.
Usamos um sistema de modelo transgênico que induz a expressão do antagonista de Wnt secretada Dkk1 em adultos (iDkk1) de ratos sob tetraciclina controlam (veja a Tabela de materiais)10,22. Demonstrámos que o bloqueio de sinalização de Wnt no hipocampo adulto provoca perda de sinapse excitatória, especificamente na região CA1 stratum radiatum (Figura 3). Figura 3A ilustra imagens confocal representante dos marcadores pré e pós-sinápticos excitatórios (vGlut1 e PSD-95, respectivamente) adquiridos de fatias hippocampal de ratos iDkk1 expressando Dkk1 para duas semanas, bem como seus respectivos controles. Analisamos estas imagens utilizando o software Volocity e demonstrou uma redução significativa do número de sinapses excitatórias, quantificada pela localização co do vGlut1 - e PSD-95-rotulado partitura na região CA1 do hipocampo de ratos iDkk1 seguindo o indução de Dkk1 por duas semanas (Figura 3B, * p &#60; 0,05; Teste de Kruskal-Wallis; 6 ratos por genótipo). No CA1 stratum radiatum, o número de partitura excitatório sinapse por 1.000 µm3 foi reduzido de 500 em ratos de controle para 300 em ratos iDkk1. Em contraste, induzida Dkk1 expressão não afetou o número de sinapses inibitórias (identificado pela localização co entre o pré e pós-sináptica marcadores vGAT e gephyrin, respectivamente), como mostrado na Figura 4A-B (p &#62; 0,05; Teste de Kruskal-Wallis; 3 ratos por genótipo).
Importante, realizamos uma análise do poder estatístico para estimar o número adequado de animais necessários para gerar estes resultados robustos e fatias. Usando R, calculamos que aproximadamente 35 fatias por condição eram necessários (animais de fatias x 6 de 3 imagens x 3 = 36) para detectar um efeito de grande tamanho (f = 0,4) com 80% de confiança (poder = 0,8) em uma ANOVA One-Way com bloqueio e replicação, conforme descrito na etapa 3.2.6.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
Figura 3: perda de sinapses excitatórias em fatias hippocampal de ratos iDkk1. (A) imagens confocal representante de CA1 estrato radiatum mostrar excitatórios sinapses, identificados por localização co entre vGlut1 e PSD-95 (setas brancas). O painel inferior representa uma ampliação maior do retângulo realçada. Escala de barras = 2 µm. (B) a percentagem de sinapses excitatórias entre controle e iDkk1 foi quantificada utilizando o software mencionado na Tabela de materiais (* p &#60; 0,05; Teste de Kruskal-Wallis; 6 ratos por genótipo). Os dados são representados ± SEM. Esta figura foi modificada de referência10. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
Figura 4: sinapses inibitórias são inalteradas em fatias hippocampal de ratos iDkk1. (A) imagens confocal representante do CA1 stratum radiatum de sinapses inibitórias identificado pela localização co entre vGAT e gephyrin (setas brancas). O painel inferior representa uma ampliação maior do retângulo realçada. Escala de barras = 2 µm. (B) percentagem de sinapses inibitórias entre ratos controle e iDkk1, conforme quantificada utilizando o software Volocity (p &#62; 0,05; Teste de Kruskal-Wallis; 3 ratos por genótipo). Os dados são representados ± SEM. Esta figura foi modificada de referência10. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alta sacarose ACSF componentes</td>
			<td>Concentração</td>
			<td>Notas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>75 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2h2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido cinurênico</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido pirúvico</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Adicionar após a oxigenação da solução</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 mM</td>
			<td>Adicionar após a oxigenação da solução</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glicose</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarose</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Câmara submersa ACSF componentes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2h2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Adicionar após a oxigenação da solução</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1 mM</td>
			<td>Adicionar após a oxigenação da solução</td>
		
		<tr>
			<td>D-glicose</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	

Tabela 1: Composição de ACSF.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffer de bloqueio/permeabilizing</td>
			<td>Concentração</td>
			<td>Notas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soro de burro</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>0,50%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x PBS</td>
			<td></td>
			<td>pH de 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>1,37 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>27 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>18 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA/4% de sacarose</td>
			<td></td>
			<td>pH de 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td>Diluir de 10 x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>1,33 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarose</td>
			<td>117 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Buffers usados para coloração de imunofluorescência.

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Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Um protocolo para com precisão, identificando e analisando as sinapses em fatias hippocampal usando a imunofluorescência é descrito neste artigo.

Avaliação da densidade de sinapse em fatias Hippocampal cérebro de roedor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

evaluation-of-synapse-density-in-hippocampal-rodent-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.8K visualizações.  University College London. Um protocolo para com precisão, identificando e analisando as sinapses em fatias hippocampal usando a imunofluorescência é descrito neste artigo.

Vídeo: Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Neurociência

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Emparelhados Recordings células inteiras em organotï¿½icas fatias do hipocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Low-Density hipocampo Cultura Neuron primária

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the dendritic filopodia establish contact with a target axon, they begin maturing into spines, leading to the formation of a synapse. Telencephalin (TLCN) is abundantly localized in dendritic filopodia and is gradually excluded from spines. Overexpression of TLCN in cultured hippocampal neurons induces dendritic filopodia formation. We showed that telencephalin strongly binds to an extracellular matrix molecule, vitronectin. Vitronectin-coated microbeads induced phagocytic cup formation on neuronal dendrites. In the phagocytic cup, TLCN, TLCN-binding proteins such as phosphorylated Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), and F-actin are accumulated, which suggests that components of the phagocytic cup are similar to those of dendritic filopodia. Thus, we developed a method for purifying the phagocytic cup instead of dendritic filopodia. Magnetic polystyrene beads were coated with vitronectin, which is abundantly present in the culture medium of hippocampal neurons and which induces phagocytic cup formation on neuronal dendrites. After 24 h of incubation, the phagocytic cups were mildly solubilized with detergent and collected using a magnet separator. After washing the beads, the binding proteins were eluted and analyzed by silver staining and Western blotting. In the binding fraction, TLCN and actin were abundantly present. In addition, many proteins identified from the fraction were localized to the dendritic filopodia; thus, we named the binding fraction as the dendritic filopodia-rich fraction. This article describes details regarding the purification method for the dendritic filopodia-rich fraction.

In this protocol, we introduce a method for purifying the dendritic filopodia-rich fraction from the phagocytic cup-like protrusion structure on cultured hippocampal neurons by taking advantage of the specific and strong affinity between a dendritic filopodial adhesion molecule, TLCN, and an extracellular matrix molecule, vitronectin.

Purificação da fração rica de Filopodia dendrítica

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias Cerebelares adultas

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...