Os autores gostariam de agradecer A. Benham para ajudar com o desenvolvimento do protocolo. Este trabalho foi financiado pelo NIH concessão NS06747 para BAB

1. Preparação de Worms para imagem Este segmento do protocolo é baseada em trabalhos C. técnicas de cultura de elegans 1,2, e é descrito na Figura 1. <ol><li> Crescer vermes em alta peptona placas de ágar NGM (10 cm) semeados com NA22 E. bactéria Escherichia até quase morrer de fome. Se imunomarcação, uma placa irá produzir de forma confiável vermes suficientes para um indivíduo mancha, tendo em conta as perdas ao longo do caminho, e os rigorosos critérios utilizados para selecionar os vermes para geração de imagens (ver Parte 2). </li><li> Vermes colheita vertendo alguns ml de DDQ 2 0 no prato, agitação brevemente, e verter o líquido para um tubo de 15 ml cónica (repetição se necessário, para transferir a maioria dos vermes para o tubo). Sedimento em centrífuga clínica por 3 min, g 1000x. Lavar pelete 1-3x com ddH2O até sobrenadante é claro para remover as bactérias residuais. Usar pipetas de transferência de polipropileno para remover sobrenadantes, como vermes furar vidro(A partir desse passo é crítico para minimizar o tempo entre os passos para evitar perdas na viabilidade dos ovos). </li><li> Após a última lavagem, verme Ressuspender o granulado em 5 ml de solução de hipoclorito alcalino para lisar vermes e ovos de libertação. Balance suavemente, e examinar os tubos sob um microscópio de dissecação cerca de uma vez por minuto. Quando cerca de 50% dos vermes são lisadas (elas aparecerão dobrados e arrombado), terminar a lise através do enchimento do tubo para o topo com tampão de ovo, invertendo várias vezes, e granulação durante 3 min, g 1000x. Tempo de lise não deve exceder 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante com pipeta de transferência, e lavar pellet 3x com tampão de ovo. </li><li> Para separar os ovos de detritos, flutuar-los sobre uma almofada de sacarose a 30% em ddH2O: após a lavagem final a partir do passo 1.4, cuidadosamente remover pelete sobrenadante e ressuspender em 5 ml DDQ 2 0. Adicionar 5 ml de sacarose estéril 60% em DDH 2 O, e misture bem. Girar em centrífuga clínica 6 min, g 1000x. Ovos irá recolher no menisco (eles have uma aparência turva), enquanto os detritos serão pellet. </li><li> Usando uma pipeta de transferência de plástico, sugam ovos em um volume mínimo e transferir para placas de agar unseeded NGM. Quaisquer ovos que aderem ao lado do tubo pode ser enxaguado suavemente para baixo e transferidos também. Uma placa de 10 cm unseeded por estirpe analisado é suficiente. </li><li> Incubar as placas unseeded com os ovos durante a noite (~ 16 horas) a 20 ° C. Alivie a chapa para as primeiras horas para secá-la, deixando a tampa um pouco fora por algumas horas, mas não se esqueça de cobrir durante a noite. </li><li> Após a eclosão, as larvas L1 transferir para um tubo de 15 ml cônico em Basal S (adicionar alguns mililitros S Basal a placa, redemoinho, despeje no tubo). Sedimento em centrífuga clínica (3 min, g 1000x), ressuspender em um volume mínimo de Basal S, e transferir para placas de 10 cm NGM ágar inoculadas com bactérias NA22. Use 2 placas aqui para cada placa original do passo 1.1. Incubar até vermes atingem a idade desejada. </li><li> Monitorizar as culturas uma ou duas vezes por dia. Se eles estão em perigo of fome, a transferência para novas placas NA22. Para vermes do tipo selvagem N2, inanição é precedido pela formação de uma linha ou onda de vermes que se move ao longo da placa como animais de migrar em massa afastado de comida com depleção de zonas. Uma vez que estas formas, a comida será completamente esgotado dentro de algumas horas. </li><li> Worms estão agora prontos para imunomarcação ou imagens ao vivo. Fixação e coloração vermes em suspensão é ótima, porque um grande número de vermes intactas podem ser visualizados facilmente. Procedimentos de coloração com base no protocolo de Finney e Ruvkun 3-6 são preferíveis para congelar-rachadura procedimentos porque um grande número de vermes são necessários para geração de imagens. </li></ol> 2. Imagem confocal <ol><li> Monte vermes em slides para imagem confocal. Ajustar a densidade de vermes para algumas centenas por microlitro. Fazer uma almofada de agarose a 2% em S-basal rodeado por um anel fino de vaselina para evitar a evaporação durante o exame (aplicado através de uma seringa de 3 ml equipado com uma agulha de calibre de corte 25). Pipetar ummicrolitros da suspensão poucos verme em uma lamínula (utilizar anestésico se vermes imagens ao vivo), e abaixar o bloco de agarose para a lamínula, espalhando-se os vermes uniformemente sobre a almofada. </li><li> Selecione vermes para imagens. Escolha vermes onde as sinapses de interesse são orientados para a lente objetiva, com deslocamento radial máximo de ± 45 ° (onde 0 ° significa orientada diretamente para o objectivo). Realizar esta avaliação rápida (poucos segundos) para evitar fotodegradação. A escala das culturas iniciais é otimizado para garantir vermes suficientes irá satisfazer estes critérios geométricos. </li><li> Conclua a imagem confocal da amostra. Amostras relativamente planas que podem ser englobadas dentro de cerca de 14 0,4 ​​uM secções espessas produzir os melhores resultados. Alta velocidade, imagens de baixa resolução (512 x 512 pixels) são suficientes para uma rápida coleta de dados precisos. Evitar a saturação do detector com a potência do sinal excessivos, pois isso fará com que a subestimação da fluorescênciasinais. </li></ol> 3. Automatizado de Identificação e Análise de Clusters individuais Synaptic <ol><li> Abertos multi-TIF ficheiros de saída a partir do microscópio confocal utilizando Volocity 4,0 (ou superior) software (PerkinElmer). </li><li> Cortar fora as áreas da imagem que não contêm a estrutura de interesse (Image -&gt; Focus Extended -&gt; Cortar para a Seleção&gt; Select área de interesse usando &#39;Freehand ROI &quot;ferramenta - -&gt; Ações; Figura 2A). Foco nota, Extended produz uma projeção z-plano na tela do computador para ajudar na sua análise, mas não afeta os dados subjacentes, o mesmo é verdadeiro para ajustes de brilho e contraste, se necessário). </li><li> Medir o comprimento da área de analisados ​​utilizando a ferramenta linha. O comprimento da linha será calculado e adicionado à tabela de dados (Figura 2B). </li><li> Identificar objetos usando os &quot;Objetos por Intensidade &#39;filtro (modo de Medidas). Especifique um limite tal que os clusters sinápticas sãodestacada e não-sináptica de fundo não é (Figura 2C). A inclusão de um marcador independente sináptica rotulados com uma outra cor pode ajudar a identificar inequivocamente sinapses. Sinapses típicas variam de poucos a algumas centenas de voxels. Defina o limite de uma vez, usando uma amostra de controlo, e usá-lo para todas as amostras subseqüentes. Limiarização cada amostra separadamente é inaceitável, porque ela introduz a possibilidade de preconceito de experimentador. Os objectos são seleccionados e tabulados automaticamente (Figura 2D). </li><li> Organizar e exportar os dados. Eliminar objetos de 2 ou menos voxels, uma vez que estes são geralmente manchas de fundo. Estes podem ser eliminados por filtragem adicionais, ou durante a análise subsequente. Para facilitar a jusante sua remoção, reordenar o arquivo de dados por &#39;o tamanho do objeto&#39; para que eles com todo o grupo junto. Exportar os dados no formato CSV, que pode ser aberto pelo Microsoft Excel ou outros programas de planilha. Cada imagem produz um arquivo de saída. </li><li> Se macio Volocityware é indisponíveis, métodos alternativos para analisar Z-plano projeções de dados confocal pode ser utilizado (por exemplo, ref. 7, ou a análise manual usando ImageJ), apesar de 3-dimensional informação é perdida (ver discussão). </li></ol> 4. Os resultados representativos O método de quantificação apresentada deve ser capaz de distinguir entre as populações de fragmentação de brilho diferente e volumes diferentes. Imagens representativas e os correspondentes dados quantitativos apresentados na Figura 3 demonstram exemplos de diferenciação com base destes parâmetros. Como regra geral os resultados devem estar de acordo com o que é evidente para o olho. No caso de UNC-49 receptor GABA imunocoloração o cabo de nervo ventral de C. elegans, todos os animais tipicamente apareceu muito semelhantes em tamanho e maturidade e totais sinápticas valores de fluorescência para um grupo de cinco vermes (normalizados para o comprimento do cabo de nervo analisado) mostrou Erro Padrão<html> valores de cerca de 10% da média 4. Mutação genética e outros tratamentos experimentais (por exemplo, a exposição ao medicamento) pode alterar não só o volume e valores de intensidade e as distribuições de freqüência de clusters sinápticas, mas possivelmente o desenvolvimento tempo-curso e sincronia dos vermes, resultando em maior variabilidade. No entanto, os resultados quantitativos devem sempre refletir o que pode ser apreciada visualmente e se não, a inspeção das imagens e os objetos identificados por Volocity deve revelar onde ocorreu o erro e sugerir medidas corretivas, tais como re-thresholding ou remoção de objetos artefatuais. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig1.jpg" /> Figura 1. Preparação de síncrona C. elegans culturas. culturas síncronos são obtidas a partir deste procedimento, pois C. prisões desenvolvimento elegans e da fase larval L1 na ausência de alimentos e retoma quando o alimento é introduzido. <html> ove_content &quot;&gt; <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig2.jpg" /> Figura 2. A quantificação de puncta sináptica. <ol class="ualpha"><li> Regiões estranhas da imagem são cortadas para reduzir o tamanho dos arquivos e aumentar a especificidade. Painel da esquerda mostra a partir de imagem, painel do meio mostra região selecionada, o painel direito mostra imagem após a colheita. Sinal vermelho é UNC-49 de imunofluorescência receptor GABA, o sinal verde é sinaptobrevina-GFP (um marcador pré-sináptica), expresso em pré-sinápticos de neurônios GABA 4. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . </li><li> Uma linha é traçada o comprimento do segmento de cabo de nervo a ser analisado, eo seu comprimento é registada automaticamente na tabela de resultados. Esta informação é necessária para normalizar os dados sinápticas devido ao comprimento do cabo de nervo analisável, que pode variar várias vezes se vermes tornar fragmentados durante a coloração.www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver maior figura. </li><li> Um limiar é aplicado para identificar individuais aglomerados sinápticas. O painel esquerdo mostra imagem antes de limiarização; exemplos de níveis de limiarização diferentes são mostradas em painéis separados (sinal verde omitido). Cada objecto identificado é representado na imagem como uma região de cor. Observe a correspondência entre os grupos visualmente evidentes sinápticas no painel mais à esquerda e as regiões coloridas no painel mais à direita. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2clarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . </li><li> Cada objeto identificado é listado separadamente na tabela de resultados. Objetos individuais podem ser selecionados, e são destaque na imagem para a inspeção, se desejar. Observe a tabela contém informações para o vermelho (&quot;rodamina &#39;) e verde (&#39; EGFP &#39;) canais; a informação do canal verde é potencialmente enganosa uma vez que objetos eramidentificados com base estritamente na fluorescência vermelha. Esta análise também pode ser realizada em imagens de cor única. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2dlarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . </li></ol><img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig3.jpg" /> Figura 3. Resultados representativos. Micrografias representativas de tipo selvagem C. elegans coradas para UNC-49 receptores GABA antes (A) e após (B) o tratamento com o muscimol, um agonista do receptor de GABA que faz com que os receptores para se tornar downregulated após uma exposição prolongada. Painéis mostram imagens cortadas antes (esquerda) e depois (direita) limiarização e remoção de partículas pequenas de fundo. (C) A parcela de quantitativos parâmetros sinápticos para os espécimes mostrados em (A) e (B): fluorescência total normalizada para a cabo de comprimento do nervo (esquerda), e os histogramas probabilidade cumulativa de conteúdo individual sinapse fluorescência (meio) e volume sinapse (right), demonstrando redução estatisticamente significante no conteúdo e volume sináptica induzida pela exposição agonista (n = 60 sinapses para não tratadas, n = 115 sinapses para muscimol-tratado, p &lt;0,001, Kolmogorov-Smirnov <a href="http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html" target="_blank">http://www.physics.csbsju .edu / stats / KS-teste.html</a> ).

<ol>
	<li>Christensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells.">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33, 503-514 (2002).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122, 2517-2527 (1996).</li><li>Davis, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+lysosomal+trafficking+as+a+mechanism+for+regulating+GABAA+receptor+abundance+at+synapses+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Rowland, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+terminals+independently+regulate+synaptic+clustering+and+autophagy+of+GABAA+receptors+in+Caenorhabditis+elegans.">Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).</li><li>Burbea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+AP180+regulate+the+abundance+of+GLR-1+glutamate+receptors+at+postsynaptic+elements+in+C.+elegans.">Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans.</a> Neuron. 35, 107-120 (2002).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+regulated+by+the+insulin-like+signaling+pathway+underlies+salt+chemotaxis+learning+in+Caenorhabditis+elegans.">Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).</li><li>Sankaranarayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>McDonald, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+functional+characterization+of+fluorescent,+N-terminally+tagged+CB1+receptor+chimeras+for+live-cell+imaging.">Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging.</a> Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).</li><li>Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+neuropeptide+release+induced+by+octopamine+without+Ca2++entry+into+the+nerve+terminal.">Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui apresentado é projetado para extrair quantitativos múltiplos parâmetros de dados para grandes populações de sinapses em C. elegans, enquanto maximiza a consistência dentro de grupos de tratamento. Três características contribuir para estes objectivos. Em primeiro lugar, imunocoloração é realizada em populações de vermes síncronas para assegurar que todos os animais são da mesma idade. Este passo é crítico porque regulação do desenvolvimento de níveis de expressão podem obscur...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do software </td><td> Companhia </td><td></td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Volocity v4.0 ou superior </td><td> PerkinElmer / Improvision </td><td></td><td> Verifique sua instalação núcleo local de imagem para o acesso a este software. O software de demonstração está disponível no site da PerkinElmer. Este método requer apenas o módulo A determinação quantitativa de Volocity. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 2. Reagentes específicos e equipamentos. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Buffer de ovo </td><td> NaCl KCl CaCl 2 MgCl 2 HEPES (Ajustar o pH a 7,3) </td> &lt;td&gt; 118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM </td></tr><tr><td> Hipoclorito alcalino (por 5 ml) </td><td> Lixívia fresca (descartar garrafa de 30 dias após a abertura) 10 N NaOH ddH2O </td><td> 1,0 ml 0,25 ml 3,75 ml </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. Solutions. </td></tr></tbody></table>

automated quantification of synaptic fluorescence in c. elegans

Força Synapse refere-se à amplitude das respostas pós-sinápticos para eventos de liberação de neurotransmissores pré-sinápticos, e tem um grande impacto na função circuito neural global. Synapse força crítica depende da abundância de receptores de neurotransmissores agrupadas em sítios sinápticos na membrana pós-sináptica. Níveis de receptores são estabelecidos developmentally, e pode ser alterada por tráfico entre pools receptor de superfície localizada, subsináptica, e intracelular, que representam importantes mecanismos de plasticidade sináptica e neuromodulação. Métodos rigorosos para quantificar sinapticamente localizada abundância receptor neurotransmissor são essenciais para estudar o desenvolvimento e plasticidade sináptica. A microscopia de fluorescência é uma abordagem ideal porque preserva informação espacial, distinguindo sináptica de não-sinápticos piscinas e discriminar entre as populações de receptores localizados em diferentes tipos de sinapses. A genética organismo modelo Caenorhabditis elegans é particularmente bem adequado para estes estudos, devido ao pequeno tamanho e simplicidade relativa do seu sistema nervoso, a sua transparência, e da disponibilidade de poderosas técnicas genéticas, permitindo o exame das sinapses nativas em animais intactos. Aqui apresentamos um método de quantificação fluorescente-etiquetados receptores de neurotransmissores sinápticos em C. elegans. Sua característica fundamental é a identificação automatizada e análise individual das sinapses em três dimensões no plano multi-arquivos microscópio confocal de saída, a posição de tabulação, volume, intensidade de fluorescência, fluorescência e total para cada sinapse. Esta abordagem tem duas vantagens principais sobre a análise manual de z-plano projeções de dados confocal. Primeiro, porque todos os planos do conjunto de dados confocal está incluído, não existem dados são perdidos devido a z-plano de projeção, normalmente com base nas médias de intensidade de pixel ou maxima. Identificação, segundo as sinapses é automatizado, mas pode ser inspecionado pelo experimenter como o produto de análise de dados, permitindo a extração rápida e precisa dos dados de um grande número de sinapses. Centenas de milhares de sinapses por amostra pode ser facilmente obtida, produzindo grandes conjuntos de dados para maximizar a potência estatística. Considerações para a preparação de C. elegans para análise, e realizando imagem confocal para minimizar a variabilidade entre os animais nos grupos de tratamento são também discutidos. Embora tenha sido desenvolvido para analisar C. receptores pós-sinápticos elegans, este método é geralmente útil para qualquer tipo de sinapticamente localizada proteína, ou, na verdade, qualquer sinal de fluorescência que está localizada a aglomerados discretas, puncta, ou organelos. O procedimento é realizado em três passos: 1) preparação de amostras, 2) imagem confocal, e 3) análise de imagem. Passos 1 e 2 são específicos para C. elegans, enquanto o passo 3 é geralmente aplicável a qualquer sinal de fluorescência em ponteada micrografias confocal.

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Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

A abundância de receptores de neurotransmissores nas sinapses cluster influencia fortemente a força sináptica. Este método quantifica receptores de neurotransmissores fluorescente-etiquetados em três dimensões com um único sinapse resolução em<em&gt; C. elegans</em&gt;, Permitindo que centenas de sinapses para ser rapidamente caracterizados dentro de uma única amostra, sem distorções introduzidas pela z-plano de projecção.

Quantificação automatizada de fluorescência em Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

automated-quantification-of-synaptic-fluorescence-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

10.2K visualizações.  University of Toledo. A abundância de receptores de neurotransmissores nas sinapses cluster influencia fortemente a força sináptica. Este método quantifica receptores de neurotransmissores fluorescente-etiquetados em três dimensões com um único sinapse resolução em C. elegans, Permitindo que centenas de sinapses para ser rapidamente caracterizados dentro de uma única amostra, sem distorções introduzidas pela z-plano de projecção.

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Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &amp;#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

Assaying Toxicidade β-amilóide utilizando um transgênico C. elegans Modelo

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

Neurociência

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In vivo Laser axotomia em C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Difusão lateral e Exocitose de proteínas de membrana em neurônios cultivados avaliada através da recuperação de fluorescência e fluorescência perda de fotobranqueamento

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Acompanhamento e Medição do Comportamento

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Pós-incorporação de Etiquetagem immunogold de proteínas sinápticas em culturas de hipocampo

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualizando neuroblasto Cytokinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogênese

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In vivo de imagens de Dauer específica Neuronal Remodelação em C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

Análise automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamento Swim Usando CELEST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...