Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da microbiologia sobre a dinâmica da colonização e infecção por microrganismos no trato gastrointestinal. As principais vantagens dessa técnica são que ela é mais representativa de infecções transmitidas por alimentos em humanos e que reduz danos potenciais nos tecidos em peixes em comparação com o gavage oral. A demonstração visual deste método é fundamental, pois as etapas de lavagem podem ser difíceis de executar devido à natureza altamente motil da paramecia.
De uma cultura viva em crescimento, adicione um mililitro de cultura paramecium e um mililitro de uma cultura e-coli MG1655 a um frasco de cultura de tecido de dez mililitros contendo oito mililitros de meio E3. Gire levemente o frasco antes de colocá-lo a 22 graus Celsius, deslizando um mililitro da co-cultura em um novo frasco de cultura de tecido de dez mililitros contendo nove mililitros de médio E3 fresco, complementado com 108 unidades formadoras de colônias por mililitro de e-coli MG1655, a cada duas semanas. Para determinar a meia-vida bacteriana dentro de um paramecium, conte o número de paramécia de uma densidade óptica de 600 bactérias paramécia co-cultura e adicione uma alíquota de 50 microliter aliquot de supernascer a um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro a cada hora durante seis horas.
Adicione 950 microliters de um por cento de surfactante não iônico em PBS aos tubos. E lise a paramécia em cada amostra com um minuto de vórtice, em seguida, faça uma em cada dez diluições de cada amostra em PBS estéril. E placa 100 microliters de cada diluição em placas seletivas para uma incubação de 16 horas a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, conte apenas as colônias individuais isoladas e distintas para determinar o número de colônias bacterianas na placa. E identificar uma placa com uma diluição que rende 30-300 unidades formadoras de colônias. Na véspera da infecção, colete um volume de bactérias de uma densidade óptica de 600 cultura por tratamento por centrifugação.
E suspenda as pelotas em um mililitro de E3 médio por tubo. Em seguida, adicione um microliter de uma mancha bacteriana apropriada a cada suspensão bacteriana. E proteja os tubos de branqueamento fotográfico com papel alumínio.
Antes de incubar as amostras de bactérias com rotação final por 15 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, lave as bactérias duas vezes em um grande volume de meio E3 para remover o excesso de corante. E suspenda as pelotas em um mililitro de e3 médio fresco por tubo.
Em seguida, adicione um mililitro de suspensão bacteriana a cada um dos dois frascos de paramecia fresca por condição para uma incubação de duas horas à temperatura ambiente. Puxe o conteúdo de ambos os frascos por condição em tubos cônicos individuais de 50 mililitros. E pelotar as amostras por centrifugação.
Usando uma pipeta estéril, substitua aproximadamente dez mililitros do supernatante E3 em cada tubo por dez mililitros de meio E3 fresco para 3 lavagens por centrifugação. Após a última lavagem, remova aproximadamente dez mililitros dos supernacantes E3, tomando cuidado para não interromper as pelotas, e suspenda as pelotas nos dez mililitros restantes do meio E3. Transfira 500 microliters de cada suspensão para tubos individuais de microcenrifus de 1,5 mililitro e pelota a paramecia por centrifugação.
Descarte 400 microliters dos supernantes, e adicione 20 microliters de 36,5% de solução de formaldeído aos 100 microliters restantes de paramécia com tubulação suave. Após cinco minutos em temperatura ambiente, meça o volume total real em cada tubo por pipeta antes de contar o número de paramecia morta por mililitro. Para infecção transmitida por alimentos do peixe-zebra, diluir as amostras de paramecia para duas vezes dez a cinco paramecia por mililitro de concentração média E3.
E adicione 3 mililitros de cada cultura paramécia a um poço de 6 placas de poço por condição. Em seguida, transfira dez zebrafish anestesiados para cada poço em um volume mínimo de líquido. E incubar as co-culturas por duas horas a 30 graus Celsius em uma incubadora diurna sob condições de luz do dia.
Para determinar a taxa de presas, visualize o peixe-zebra alimentado sob um microscópio estéreo enquanto adquire imagens de vídeo da captura da presa. A captura de presas é caracterizada pelo golpe de um zebrafish em direção à presa. Estima-se que cada ataque seja um evento de captura de presas.
No final da incubação, lave o zebrafish em 5 poços diferentes contendo 3 mililitros de e3 médios frescos complementados com 100 miligramas por litro de tricaine por poço. E incorporar cada zebrafish em 3 mililitros de 1% de baixa derretimento surgiu em uma placa de seis poços de poço preto. Quando todos os peixes tiverem sido incorporados, coloque a placa sob um microscópio estéreo e use uma ponta de carregamento de gel cortado para ter certeza de que as cabeças estão à esquerda e as caudas estão à direita em cada campo de observação.
Aguarde por 5 minutos para que a agarose se estaque, em seguida, sobreponha o peixe embutido com meio E3 fresco complementado com tricaine, e imagem o peixe-zebra em um microscópio fluorescente para avaliar o progresso das infecções bacterianas. Para e-coli patogênico, a densidade bacteriana inicial é de 790 bactérias por paramecium, e as bactérias são degradadas dentro das vacuoles de cada átomo cortado de paramecium com uma meia-vida de aproximadamente 2,3 horas. A presa é acompanhada por um comportamento marcante característico, e a determinação da taxa de presas baseia-se no pressuposto que cada ataque leva à internalização de 1 paramécio.
Após a digestão, as bactérias livres se movem do foregut para o intestino médio e posterior, onde são detectadas aproximadamente 1 a 2 horas após o início da caça. S-enterica, por exemplo, localiza principalmente na mucosa intestinal com alguma invasão epitelial levando à infiltração de neutrófilos no epitélio. Não se esqueça que trabalhar com certos tipos de bactérias pode ser extremamente perigoso, e que precauções como usar o equipamento de proteção individual adequado devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
